CN112352160A - 可固定生存力染料及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了可用于检测细胞样品中的活细胞和死细胞的组合物和方法。该方法依赖于包含与标记物连接的马来酰亚胺部分的标记化合物。
Description
相关申请
本申请要求于2018年7月12日提交的印度专利申请No.201811026074的优先权。所述申请的全部内容出于所有目的而并入本文。
技术领域
本发明涉及可用于在细胞样品中区分活细胞与死细胞的组合物和方法。该组合物和方法适合于与染色来自细胞样品的细胞中的细胞内靶标以及细胞外靶标的方法一起使用。
背景技术
当执行流式细胞术染色时，DNA结合染料经常用于区别活细胞和死细胞。DNA结合染料(例如7-AAD和碘化丙啶)不染色活细胞，但能够到达并且非共价地结合死细胞的DNA，因为它们的细胞膜和核膜是透化的。然而，当期望细胞内染色时，不能使用DNA结合染料，因为在用于细胞内染色程序的固定和透化后，染料脱离死细胞且染色活细胞。
已开发的允许与检测细胞生存力(cell viability)组合的细胞内染色的一种方法是在细胞内染色之前使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯染料来染色细胞，以区别活细胞和死细胞。NHS酯染料与游离NH2基团共价结合。活细胞以“低强度”染色，因为NHS-酯染料将仅染色在细胞表面处表达的蛋白质，而死细胞以“高强度”染色，因为细胞是透化的，并且染料能够结合细胞内蛋白和细胞表面蛋白两者。然而，NHS-酯染料并非水溶性的，并且是相对不稳定的。结果，必须将染料等分成适合于各个测定的体积，作为冻干组合物保持在-20℃下，并且在临用前重悬浮于DMSO中。
持续需要开发新的和改进的快速、高通量的细胞生存力测定，例如使用流式细胞术的那些。可用于这些应用中的试剂组合物的鉴定是特别重要的。本发明解决了这些需要及其他需要。
发明内容
本发明提供了用于区分细胞样品中的死细胞与活细胞的方法。该方法包括在标记化合物结合死细胞和活细胞上的细胞表面蛋白上的游离巯基(thiol group)，并且优先穿过死细胞的细胞膜且结合死细胞中的细胞内蛋白上的游离巯基的条件下，使细胞样品与式I的标记化合物接触：
其中R是标记物(label)或通过接头连接的标记物；以及检测细胞样品中的标记物，从而通过检测与活细胞相比增多的死细胞的标记，来区分细胞样品中的死细胞与活细胞。
该方法还可以包括在使细胞样品与标记化合物接触的步骤之后，标记细胞中的细胞内靶标。细胞内靶标的标记可以包括将细胞固定和透化。在一些实施方案中，该方法还包括标记细胞外靶标。
许多标记物可以用于本发明的方法中。标记物可以是直接标记物，例如荧光标记物。
在一些实施方案中，该方法在包括约6.5至约7.5的pH的条件下进行。
本发明的方法可以导致死细胞的标记是活细胞的标记的至少约20倍，经常是活细胞的标记的至少500倍。
在一些实施方案中，接触步骤包括使细胞样品与标记化合物一起温育约10至约60分钟。检测细胞样品中的标记物的步骤可以使用流式细胞仪来进行。
细胞样品可以是多种类型中的任一种。在一些实施方案中，细胞样品是例如来自人的血细胞样品。
本发明还提供了用于区分细胞样品中的死细胞与活细胞的试剂盒。该试剂盒包括包含式I的标记化合物的容器：
其中R是标记物或通过接头连接的标记物，包含用于将样品中的细胞固定和透化的试剂的一个或多个容器，以及关于如何使用标记化合物来区分细胞样品中的死细胞与活细胞的说明书。
标记物可以是直接标记物，例如荧光标记物。
在一些实施方案中，标记化合物以干燥形式提供。试剂盒可能适合于使用流式细胞仪来区分细胞样品中的死细胞与活细胞。试剂盒还可以包含经标记的结合剂，其用于检测细胞样品中的细胞内靶标和/或细胞外靶标。
附图说明
图1A显示了柱状图，其示出了与活Jurkat细胞相比，死Jurkat细胞的更强荧光，如通过流式细胞术使用本发明的标记化合物(即，ViaKrome 405、ViaKrome 561、ViaKrome638或ViaKrome 808)检测到的。图1B显示了用NHS-酯染色的相同样品的结果，所述NHS-酯用Violet Stain、Red Stain或Far Red Stain进行标记。
图2显示了当PBMC用本发明的标记化合物ViaKrome 405、ViaKrome 561、ViaKrome638或ViaKrome 808进行染色时，与活外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)相比，来自死PBMC的更强荧光。
图3A-3B显示了代表性数据集，其示出了即使当与细胞内抗原染色组合使用时，本发明的标记化合物也能够区别活细胞和死细胞。具体地，图3A显示了用单独的ViaKrome405(“VK405”)(I)或多色染色(II)进行染色的PBMC的结果。图3B显示了群体的表型分型在VK405的存在或不存在下是相似的，所述群体例如CD45+淋巴细胞[图3B(I)，CD45+细胞]、表达颗粒酶B的T细胞[图3B(II)，CD3+GB+细胞]、表达CD79a的B细胞[图3B(III)，CD19+CD79a+细胞)和单核细胞[图3B(IV)，CD14+细胞]。
具体实施方式
本发明提供了可用于区分细胞样品中的活细胞与死细胞的方法。该方法依赖于包含与标记物连接的马来酰亚胺部分的标记化合物。
标记化合物
本发明的标记化合物包含与标记物连接的马来酰亚胺部分，并且具有式I的通式：
其中R是标记物或与接头连接的标记物。
在一些实施方案中，标记化合物并不被动扩散通过活细胞的细胞膜，即，除非膜是透化的，否则它们并不穿过活细胞的细胞膜。在一些实施方案中，R不包含式II的9-氨基吖啶：
马来酰亚胺与巯基的反应可用于生物分子的生物缀合和标记，所述生物分子例如蛋白质和肽。马来酰亚胺是针对游离巯基显示高选择性的亲电化合物。游离巯基存在于蛋白质中的半胱氨酸残基上。半胱氨酸残基通常形成胱氨酸桥，其稳定蛋白质的三级结构。这些二硫化物不与马来酰亚胺反应。因此，有时有必要在缀合之前使二硫化物还原，以从反应中排除氧。
即使在用固定剂处理样品之后，本发明的标记化合物也保持与细胞蛋白结合。因此，它们适用于其中将细胞固定用于进一步分析的测定中(例如，如下所述的细胞内靶标的标记)。标记化合物有时称为可固定标记化合物或可固定生存力染料。
标记物是可以直接或间接检测的分子或部分。可直接检测的标记物直接显现和/或测量或以其他方式鉴定，使得可以检测到其存在或不存在。可间接检测的标记物本身不是可检测的，而是需要在标记化合物已与靶蛋白中的游离巯基反应之后连接可检测的次级标记物。标记物的实例包括荧光分子、酶(例如，辣根过氧化物酶)、颗粒(例如，磁性颗粒)、金属标签、发色团、磷光体、化学发光剂、可用作可间接检测标记物的特异性结合分子(例如，生物素和链霉亲和素、地高辛和抗地高辛)等等。
在一个典型的实施方案中，标记物是荧光标记物，其是可以经由其固有的荧光特性检测的任何分子。合适的荧光标记物包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻红蛋白花青苷7(PC7)、藻红蛋白德克萨斯红
荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、荧光黄、Cascade BlueTM、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒冈绿、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)和萤光素酶。用于本发明中的另外标记物包括：Alexa-Fluor染料(例如：APC-Alexa Fluor 750(AA750)、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)、基于共轭聚合物的染料、基于树状聚合物的染料、量子点和聚合物点。
标记物可以直接或通过接头连接至马来酰亚胺部分。合适的接头是本领域技术人员公知的，并且取决于例如特定的标记物。合适接头的实例包括SMCC、磺基SMCC等等。
标记化合物因此具有相对大的分子量，这致使它们在没有透化的情况下不能穿过细胞膜，因此它们占优势地染色死细胞而不是活细胞。阳性读出(死细胞的染色)更高效且准确地定量死细胞。因此，在多参数技术例如流式细胞仪中，活细胞的低染色导致数据集的较少补偿，其有助于分析并提高其他参数的测量准确度。
标记化合物可以根据本领域已知的方法(参见例如，Dolci等人(2016)PolymerReviews 56：512-556，以及Song等人(2009)Org Biomol Chem 7：3400-3406)进行制备，所述参考文献通过引用并入本文。作为替代，它们可以购自商业供应商，例如PromoKine和AATBioquest。
在一些实施方案中，可以根据如下的合成方案，通过经由SMCC接头将马来酰亚胺与标记物缀合，来制备本发明的标记化合物：
在一些实施方案中，本发明的标记化合物具有大于300g/mol，例如大于400g/mol、大于500g/mol或大于600g/mol的分子量。在一些实施方案中，标记化合物具有300g/mol至3000g/mol，例如600g/mol至2000g/mol、或700g/mol至1800g/mol的分子量。
在一些情况下，在一些实施方案中，在本发明中使用的标记化合物是ViaKrome405、ViaKrome 561、ViaKrome 638和ViaKrome 808之一。这些标记化合物各自包含与如上所述的标记物连接的马来酰亚胺，并且其分子量如下。
化合物的激发波长和发射波长如下：
检测活细胞和死细胞的测定
本发明的标记化合物方便地用于区分细胞样品中的活细胞与死细胞。在本发明的测定中，在活细胞和死细胞两者上的细胞表面蛋白均通过标记化合物进行染色。在死细胞中，由于细胞膜是透化的，给予标记化合物对死细胞的细胞内靶标的增多的接近，因此细胞内蛋白质也被染色。结果，与活细胞相比，死细胞具有提高的标记和信号强度。来自死细胞的信号强度通常是来自活细胞的信号强度的至少约10倍，通常为约50倍，且经常为约250倍，且最经常为1500倍。
本发明的标记化合物与游离巯基之间的反应在中性PH下是最高效的。在典型的实施方案中，使标记化合物与细胞样品在约6.0至约8.0，通常在约6.5至约7.5，并且经常为约7.2的pH下接触。
在典型的测定中，将来自细胞样品的细胞旋下，并且在适当的缓冲溶液(例如，PBS)中重悬浮至期望的细胞密度，例如，为约0.5×106至约10×106个细胞/ml，经常为约1×106至约2×106个细胞/ml。染色体积可以从约50调整到约1000μl。然后使包含细胞的溶液与本发明的标记化合物接触。标记化合物可以以干燥形式(例如，作为反应容器中的干燥点)提供，或者可以添加至溶液，所述溶液可以包含另外的组分，例如缓冲剂、盐等等。如果标记化合物以干燥形式提供，则它通常是冻干的。
选择细胞样品中标记化合物的最终浓度，以确保样品中细胞的充分标记。在一个典型的实施方案中，标记化合物的最终浓度将为约0.15μg/ml至约10μg/ml，通常为约1μg/ml至约5μg/ml。然后使样品与标记化合物一起温育确保足够标记的时间。温育时间通常为约10至约60分钟，通常为约20至约30分钟。本领域技术人员可以容易地确定要使用的合适溶液、标记化合物的量和实现足够标记所必需的温育时间，其取决于例如细胞样品的性质、可检测的标记物等等。
细胞样品可以是包含要测试其生存力的细胞的任何样品。样品可以包括真核细胞培养物(例如，动物、植物、酵母或真菌细胞)或原核细胞培养物(例如，细菌细胞)。样品也可以源自受试者。源自受试者的样品的非限制性实例包括血浆、血清、全血、尿、精液、乳、眼泪、唾液、痰、黏液、脊髓液、淋巴液、口腔拭子、阴道拭子、直肠拭子、吸出物、穿刺活检物、或者例如通过手术或尸检获得的组织的组织切片。受试者可以是人(例如，患有疾病的患者)，商业上重要的哺乳动物，包括例如猴、牛或马。样品还可以得自家庭宠物，包括例如犬或猫。在一些实施方案中，受试者是用作疾病的动物模型或用于药物筛选的实验动物，例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠。
本文公开的标记化合物对于区别活细胞和死细胞是有利的。与为此目的使用的许多其他传统染色剂(例如NHS-酯染料)不同，所述传统染色剂在制备过程中需要DMSO作为溶剂，本文公开的标记化合物可以在使用前溶解于水溶液中。使用水溶液代替DMSO来溶解标记化合物，可以避免与DMSO相关的许多有害效应，例如DMSO和溶解在其中的物质渗透到使用者的皮肤内。另外，本文公开的标记化合物是相对稳定的，并且可以在室温下贮存至少4天，并且因此不需要在临用前重悬浮。
标记细胞内靶标
本发明的方法还可以包括标记细胞中的细胞内靶标的步骤。此类步骤通常包括固定(或保存)步骤，其可以包括使样品与足以交联蛋白质、脂质和核酸分子的量的固定剂接触。用于固定样品中的细胞的试剂是本领域技术人员公知的。实例包括基于醛的固定剂，例如甲醛、多聚甲醛和戊二醛。其他固定剂包括乙醇、甲醇、四氧化锇、重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾。在一些实施方案中，固定剂可以是加热、冷冻、干燥、交联剂或氧化剂。
在一个典型的实施方案中，使细胞与透化试剂接触，所述透化试剂破坏或裂解细胞质膜以及任选地其他膜例如核膜。用于使细胞透化的透化试剂(例如，去污剂)可以基于多种因素进行选择，并且可以是例如离子型去污剂或非离子型去污剂。合适的去污剂是使细胞透化并且保持所检测蛋白质的表位完整性的那些。去污剂通常是非离子型去污剂。示例性的非离子型去污剂包括毛地黄皂苷和乙氧基化辛基苯酚(TRITON
)。其他有用的透化剂(例如，去污剂)包括皂苷、聚山梨醇酯20(
20)、辛基苯氧基聚(乙烯-氧基)乙醇(
CA-630)或Nonidet P-40(NP-40)、Brij-58、以及作为
A-38(BASF Corp)或
A-39(BASF Corp)商购可得的线性醇烷氧基化物。在一些实施方案中，可以使用离子型去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠或N-月桂酰肌氨酸。
在将细胞固定和透化之后，使其与经标记的结合剂接触，所述经标记的结合剂与期望的靶标分析物特异性结合。用于这些目的的结合剂(例如，抗体)是本领域技术人员公知的。经标记的结合剂可以显现和/或测量或以其他方式鉴定，使得可以使用本领域技术人员公知的手段，借助于可检测的信号来检测其存在或不存在。实例包括荧光分子、酶(例如，辣根过氧化物酶)、颗粒(例如，磁性颗粒)、金属标签、发色团、磷光体、化学发光剂、特异性结合分子(例如，生物素和链霉亲和素、地高辛和抗地高辛)等等。
固定和透化步骤可以用于染色细胞内靶标和细胞外靶标两者。在一些实施方案中，细胞内靶标和细胞外靶标两者的染色无需离心而完成，例如使用可从Beckman-Coulter，Marseille，法国获得的
No Centrifuge Assay试剂盒。在US 2016/0299139中描述了在细胞内和/或细胞外染色中使用
No Centrifuge Assay试剂盒的程序，该专利的相关公开内容通过引用并入本文。
测量系统
使用本发明的标记化合物来检测细胞样品中的活细胞和死细胞的测量系统是公知的。此类系统的实例包括流式细胞仪、扫描细胞仪、成像细胞仪、成像流式细胞仪、荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜和质量细胞仪。
在一些实施方案中，流式细胞仪可以用于检测荧光。适合于这种用途的许多设备是可用的，并且是本领域技术人员已知的。非限制性实例包括Beckman Coulter
和
流式细胞仪。
试剂盒
可用于本发明的方法中的试剂也可以以试剂盒的形式生产。此类试剂盒是包括容器的包装组合，所述容器包含以干燥形式(例如，作为容器壁上的干燥点)或在水溶液中的本发明的标记化合物，以及其他试剂、缓冲液、固定剂和透化溶液、以及检测活细胞和死细胞及染色细胞中的细胞内靶标所必需的类似物。试剂盒还可以包含关于如何使用这些试剂来执行方法的说明书。
实施例
提供下述实施例以示出而不是限制本发明。
实施例1：活JURKAT细胞和死JURKAT细胞的染色
本发明的标记化合物ViaKrome 405、ViaKrome 561、ViaKrome 638和ViaKrome808(可从Beckman Coulter，Inc.Brea，CA获得)，并用于区分活Jukat细胞与死Jukat细胞。简言之，方案如下：
1.已在55℃水浴中加热10分钟的Jurkat细胞以5×106个细胞/ml制备，每次测试使用100μl(每次测试5×105个细胞)
2.将四种不同的标记化合物(即ViaKrome 405、ViaKrome 561、ViaKrome 638和ViaKrome 808)各自溶解于1×PBS中，并且将溶液以每次测试2.5μg标记化合物的剂量添加至细胞样品。
3.将步骤2之后形成的混合物涡旋以混合。
4.使来自步骤3的样品在18-25℃下避光温育20分钟
5.将3ml PBS 1×添加至每个样品。
6.然后将样品以300G离心5分钟
7.通过抽吸去除来自样品的上清液。
8.将500μl PBS 1×/甲醛(FA)0.5％添加至细胞，并且在CytoFlex流式细胞仪上分析样品。
结果显示于图1中。结果指示，当用根据实施例1产生的四种标记化合物各自进行染色时，死Jurkat细胞显示比活Jurkat细胞更强的荧光。化合物用作染色加热的Jurkat细胞的对照，所述化合物是与下述染料之一连接的NHS酯：Violet染剂、Red Stain和Far RedStain，并且从商业来源获得。已知这些基于NHS酯的化合物优先染色死细胞。来自使用这些对照的实验的结果类似于来自使用本发明的标记化合物的实验的结果，即，死Jurkat细胞显示比活Jurkat细胞更强的荧光。
实施例2：活PBMC和死PBMC的细胞内染色和细胞外染色
用ViaKrome 405、ViaKrome 561、ViaKrome 638或ViaKrome 808标记的本发明的标记化合物用于区分活的与死的外周血单个核细胞(PBMC)。
简言之，方案如下：
1.已在55℃水浴中加热10分钟的PBMC以5×106个细胞/ml制备，每次测试使用其中的100μl(每次测试5×105个细胞)
2.将如实施例1中所述的标记化合物溶解于PBS 1×中，并且将溶液以每次测试2.5μg标记化合物的剂量添加至每个细胞样品。
3.将由步骤2形成的混合物涡旋以混合。
4.使来自步骤3的样品在18-25℃下避光温育20分钟。
5.将3ml PBS 1×添加至每个样品。
6.然后将样品以300G离心5分钟。
7.通过抽吸去除来自样品的上清液。
8.添加500μl PBS 1×/甲醛(FA)0.5％，以使细胞重悬浮，并且在
流式细胞仪，Beckman Coulter，Inc上分析样品。
结果显示于图2中，其指示了死PBMC也显示比活PBMC更强的荧光信号。
实施例3：活PBMC和死PBMC以及细胞内靶标和细胞外靶标的染色
该实施例显示了本发明的标记化合物可以与细胞内靶标和/或细胞外靶标的染色组合使用。即使在使用PerFix-nc，(Beckman Coulter，Inc)固定和透化后，标记化合物仍能够区分活细胞与死细胞。PBMC样品用标记化合物进行染色，随后洗涤以去除未结合的标记化合物。随后根据如下的方案，将细胞固定和透化，以用荧光染料缀合的抗体对细胞内抗原和细胞外抗原进行染色：
1.已如所述加热的PBMC以1×107个细胞/ml制备，每次测试使用其中的100μl(每次测试5×105个细胞)
2.将如实施例2中所述的标记化合物溶解于1×PBS中，并且将溶液以每次测试2.5μg标记化合物的剂量添加至每个细胞样品。
3.将步骤2之后形成的混合物涡旋以混合。
4.使来自步骤3的样品在18-25℃下避光温育(20分钟)
5.将3ml 1×PBS添加至每个样品。
6.然后将步骤5之后的样品以300G离心5分钟。
7.将50μl 100％胎牛血清(FCS)添加至每个样品。
8.将2.5μl PerFix-nc试剂1(固定剂溶液)添加至每个样品，以混合。
9.使来自步骤8的混合物在18-25℃下避光温育15分钟
10.将150μl PerFix-nc试剂2(透化溶液)和抗体缀合物(10μl颗粒酶B-FITC(PNB46038，Beckman Coulter)、10μl CD19-PE(PN A07769，Beckman Coulter)、5μl CD14-ECD(PN B92391，Beckman Coulter)、5μl CD79a-PC5.5(PN B42018，Beckman Coulter)、5μlCD3-PC7(PN737657，Beckman Coulter)和5μl CD45-KrO(PN A96416，Beckman Coulter)添加至样品并混合。
11.使由步骤10形成的混合物在18℃-25℃下避光温育15分钟
12.将3ml PerFix-nc试剂3(10×)稀释至1×(在水中)，并且添加至上述混合物。
13.然后将混合物以500G离心5分钟。
14.通过抽吸去除来自每个样品的上清液。
15.将500μl PBS 1×/甲醛(FA)0.5％添加至细胞，并且在
流式细胞仪上分析样品。
结果显示于图3A和3B中。图3A的左图显示了已用本发明的标记化合物ViaKrome405染色的细胞的结果。图3A的右图分别显示了抗CD45、抗CD3、抗CD19和抗CD14的染色。在图3B中，在用缀合物之一染色之前，用标记化合物染色细胞。结果显示了即使在使用用于细胞内染色的缓冲液处理样品之后，本发明的标记化合物也允许检测死细胞，并且当本发明的标记化合物单独使用或与抗体缀合物组合使用时，死细胞的百分比是相似的。另外，表达特异性靶标(例如，CD45)的细胞的百分比在用单独的抗体缀合物染色的细胞样品与用抗体缀合物和ViaKrome 405染色的细胞样品之间也是相似的。因此，使用本发明的标记化合物的染色程序并不改变通过特异性抗体/荧光染料缀合物检测特异性抗原(细胞内和细胞外)的可能性。
应理解本文描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且有鉴于此的各种修改或改变将由本领域技术人员提出，并且被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请都出于所有目的在此通过引用整体并入。
Claims (18)
1.一种用于区分细胞样品中的死细胞与活细胞的方法，所述方法包括
在标记化合物结合死细胞和活细胞上的细胞表面蛋白上的游离巯基，并且优先穿过死细胞的细胞膜且结合死细胞中的细胞内蛋白上的游离巯基的条件下，使所述细胞样品与式I的标记化合物接触：
其中R是标记物或通过接头连接的标记物，
以及检测所述细胞样品中的标记物，从而通过检测与活细胞相比增多的死细胞的标记，来区分所述细胞样品中的死细胞与活细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在使所述细胞样品与所述标记化合物接触的步骤之后，标记所述细胞中的细胞内靶标。
3.根据权利要求2所述的方法，其中标记细胞内靶标的步骤包括将所述细胞固定和透化。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述方法还包括标记细胞外靶标。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记物是直接标记物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述直接标记物是荧光标记物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述条件包括约6.5至约7.5的pH。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中死细胞的标记是活细胞的标记的至少约20倍。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中接触步骤包括使所述细胞样品与所述标记化合物一起温育约10至约60分钟。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测所述细胞样品中的标记物的步骤使用流式细胞仪来进行。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞样品是血细胞样品。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞样品来自人。
13.一种用于区分细胞样品中的死细胞与活细胞的试剂盒，所述试剂盒包含
包含式I的标记化合物的容器：
其中R是标记物或通过接头连接的标记物，
包含用于将所述样品中的细胞固定和透化的试剂的一个或多个容器，和
关于如何使用所述标记化合物来区分细胞样品中的死细胞与活细胞的说明书。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述标记物是直接标记物。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述直接标记物是荧光标记物。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的试剂盒，其中所述标记化合物为干燥形式。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的试剂盒，其适合于使用流式细胞仪来区分细胞样品中的死细胞与活细胞。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的试剂盒，其还包含经标记的结合剂，所述经标记的结合剂用于检测所述细胞样品中的细胞内靶标和/或细胞外靶标。
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