JP7076016B2 - 固定可能な生存率解析用色素およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年7月12日に出願されたインド特許出願第201811026074号に基づく優先権を主張する。前述の出願の全内容は、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば、以下の項目が提供される:
(項目1)
細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するための方法であって、
前記細胞試料を式Iの標識化化合物
前記標識化化合物が、死細胞および生細胞上の細胞表面タンパク質上の遊離チオール基に結合し、死細胞の細胞膜を選択的に通過し、前記死細胞中の細胞内タンパク質上の遊離チオール基に結合する条件下で接触させるステップと、
前記細胞試料中の前記標識を検出し、それによって、生細胞と比較して前記死細胞の標識化の増加を検出することによって、前記細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するステップと、を含む、方法。
(項目2)
前記方法が、前記細胞試料を前記標識化化合物と接触させる前記ステップの後に、前記細胞中で細胞内標的を標識化するステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
細胞内標的を標識化する前記ステップが、前記細胞を固定および透過処理することを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記方法が、追加の細胞標的を標識化するステップをさらに含む、項目2または項目3に記載の方法。
(項目5)
前記標識が、直接標識である、項目1~4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記直接標識が、蛍光標識である、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記条件が、約6.5~約7.5のpHを含む、項目1~6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
死細胞の前記標識化が、生細胞の前記標識化の少なくとも約20倍である、項目1~7のいずれかに記載の方法。
(項目9)
前記接触させるステップが、前記細胞試料を前記標識化化合物と約10~約60分間インキュベートすることを含む、項目1~8のいずれかに記載の方法。
(項目10)
前記細胞試料中の前記標識を検出する前記ステップが、フローサイトメータを使用して実行される、項目1~9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記細胞試料が、血球細胞試料である、項目1~10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
前記細胞試料が、ヒト由来である、項目1~11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するためのキットであって、
式Iの標識化化合物
前記試料中の細胞を固定および透過処理するための試薬を含む1つ以上の容器と、
前記標識化化合物を使用して、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別する方法に関する説明書と、を備える、キット。
(項目14)
前記標識が、直接標識である、項目13に記載のキット。
(項目15)
前記直接標識が、蛍光標識である、項目14に記載のキット。
(項目16)
前記標識化化合物が、乾燥形態である、項目13~15のいずれかに記載のキット。
(項目17)
フローサイトメータを使用して、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するために適する、項目13~16のいずれかに記載のキット。
(項目18)
前記細胞試料中の細胞内標的および/または追加の細胞標的を検出するための標識された結合剤をさらに含む、項目13~17のいずれかに記載のキット。
本発明の標識化化合物は、細胞試料中の生細胞を死細胞と区別するために便利に使用される。本発明のアッセイでは、生細胞および死細胞の両方の細胞表面タンパク質が、標識化化合物によって染色される。死細胞では、細胞膜が透過処理されるため、細胞内タンパク質も染色され、死細胞の細胞内標的へのアクセスの増加を標識化化合物にもたらす。結果として、死細胞は、生細胞と比較して、標識化およびシグナル強度が増加した。死細胞からのシグナルの強度は、典型的には、生細胞からのシグナルの少なくとも約10倍、通常約50倍超、およびしばしば約250倍超、および最も頻繁には約1500倍超強い。
本発明の方法は、細胞中で細胞内標的を標識化するステップをさらに含み得る。そのようなステップは、典型的には、タンパク質、脂質、および核酸分子を架橋するのに充分な量の固定剤と、試料を接触させることを含み得る、固定(または保存)ステップを含む。試料中の細胞を固定するための試薬は、当業者に周知である。例としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドなどのアルデヒド系固定剤が挙げられる。その他の固定剤としては、エタノール、メタノール、四酸化オスミウム、二クロム酸カリウム、クロム酸、および過マンガン酸カリウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、固定剤は、加熱、凍結、乾燥、架橋剤、または酸化剤であってもよい。
細胞試料中の生細胞および死細胞を検出するために本発明の標識化化合物を使用した測定システムは周知である。そのようなシステムの例として、フローサイトメータ、スキャニングサイトメータ、イメージングサイトメータ、イメージングフローサイトメータ、蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、および質量サイトメータが挙げられる。
本発明の方法で有用な試薬は、キットの形態でも生成され得る。そのようなキットは、乾燥形態(例えば、容器の壁上の乾燥スポットとして)または水溶液中の本発明の標識化化合物、ならびに生細胞および死細胞を検出し、かつ細胞中の細胞内標的を染色するために必要な他の試薬、緩衝液、固定剤、および透過処理溶液などを含む容器を備える、パッケージ化された組み合わせである。キットはまた、これらの試薬を使用して方法を実施する方法に関する説明書を含んでもよい。
本発明のViaKrome405、ViaKrome561、ViaKrome638、およびViaKrome808の標識化化合物(Beckman Coulter,Inc.Brea,CAから入手可能)を使用して、死Jukat細胞と生Jukat細胞を区別する。簡潔に述べると、プロトコルは以下のとおりであった。
1.55℃の水槽で10分間加熱したJurkat細胞を、5×106細胞/mlで調製し、100μl/試験(5×105細胞/試験)を使用した。
2.4つの異なる標識化化合物、すなわち、ViaKrome 405、ViaKrome 561、ViaKrome 638、およびViaKrome 808の各々を1X PBSに溶解し、これらの溶液を試験当たり2.5μgの標識化化合物の用量で細胞試料に添加した。
3.ステップ2の後に形成された混合物をボルテックスして混合した。
4.ステップ3からの試料を、光から保護して18~25℃で20分間インキュベートした
5.3mlのPBS 1Xを各試料に添加した。
6.次いで、試料を300Gで5分間遠心分離した。
7.試料からの上清を吸引によって除去した。
8.500μlのPBS 1X/ホルムアルデヒド(FA)0.5%を細胞に添加し、CytoFlexフローサイトメータ上で試料を分析した。
結果が図1に示される。結果は、実施例1に従って生成した4つの標識化化合物の各々で染色した場合、死Jurkat細胞が、生Jurkat細胞よりも強い蛍光を示したことを示す。色素:バイオレット染料、赤色染料、および遠赤色染料のうちの1つに結合したNHSエステルである化合物を、商業的供給源から得て、加熱したJurkat細胞を染色するための対照として使用した。これらのNHSエステル系化合物は、死細胞を選択的に染色することが知られている。これらの対照を使用した実験からの結果は、本発明の標識化化合物を使用した実験からの結果と類似していた。すなわち、死Jurkat細胞は、生Jurkat細胞よりも強い蛍光を示した。
ViaKrome 405、ViaKrome561、ViaKrome 638、またはViaKrome 808で標識された本発明の標識化化合物を使用して、生細胞を死んだ末梢血単核細胞(PBMC)と区別した。簡潔に述べると、プロトコルは以下のとおりであった。
1.55℃の水槽で10分間加熱したPBMCを、5×106細胞/mlで調製し、そのうちの100μlを試験当たりに使用した(5×105細胞/試験)。
2.実施例1に記載される標識化化合物をPBS 1Xに溶解し、各細胞試料に試験当たり2.5μgの標識化化合物の用量でこれらの溶液を添加した。
3.ステップ2から形成された混合物をボルテックスして混合した。
4.ステップ3からの試料を、光から保護して18~25℃で20分間インキュベートした。
5.3mlのPBS 1Xを各試料に添加した。
6.次いで、試料を300Gで5分間遠心分離した。
7.試料からの上清を吸引によって除去した。
8.500μlのPBS 1X/ホルムアルデヒド(FA)0.5%を添加して細胞を再懸濁し、CytoFLEX(登録商標)フローサイトメータ(Beckman Coulter,Inc.)上で試料を分析した。
本実施例は、本発明の標識化化合物が、細胞内および/または細胞外標的の染色と組み合わせて使用され得ることを示す。標識化化合物は、PerFix-nc(Beckman Coulter,Inc)を使用した固定および透過処理後でさえ、生細胞と死細胞を区別することができた。PBMC試料を標識化化合物で染色し、続いて洗浄して、結合していない標識化化合物を除去した。その後、以下のようなプロトコルに従って、細胞を固定および透過処理して、蛍光色素結合抗体で細胞内および細胞外抗原を染色した。
1.記載されるように加熱したPBMCを、1×107細胞/mlで調製し、そのうちの100μlを試験当たりに使用した(5×105細胞/試験)。
2.実施例2に記載される標識化化合物を1X PBSに溶解し、各細胞試料に試験当たり2.5μgの標識化化合物の用量でこれらの溶液を添加した。
3.ステップ2の後に形成された混合物をボルテックスして混合した。
4.ステップ3からの試料を、光から保護して18~25℃で(20分間)インキュベートした
5.3mlの1X PBSを各試料に添加した。
6.次いで、ステップ5の後の試料を300Gで5分間遠心分離した。
7.50μlの100%ウシ胎児血清(FCS)を各試料に添加した。
8. 2.5μlのPerFix-nc試薬1(固定液)を各試料に添加して混合した。
9.ステップ8からの混合物を、光から保護して18~25℃で15分間インキュベートした
10.150μlのPerFix-nc試薬2(透過処理溶液)と抗体複合体(10μlのグランザイムB-FITC(PN B46038、Beckman Coulter)、10μlのCD19-PE(PN A07769、Beckman Coulter)、5μlのCD14-ECD(PN B92391、Beckman Coulter)、5μlのCD79a-PC5.5(PN B42018 Beckman Coulter)、5μlのCD3-PC7(PN737657、Beckman Coulter)、および5μlのCD45-KrO(PN A96416、Beckman Coulter)を試料に添加し、混合した。
11.ステップ10で形成された混合物を、光から保護して18℃~25℃で15分間インキュベートした
12.3mlのPerFix-nc試薬3(10X)を1X(水中)に希釈し、上記の混合物に添加した。
13.次いで、混合物を500Gで5分間遠心分離した。
14.各試料からの上清を吸引によって除去した。
15.500μlのPBS 1X/ホルムアルデヒド(FA)0.5%を細胞に添加し、CytoFlex(登録商標)フローサイトメータ上で試料を分析した。
Claims (16)
- 前記方法が、前記細胞試料を前記標識化化合物と接触させる前記ステップの後に、前記細胞中で細胞内標的を標識化するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞内標的を標識化する前記ステップが、前記細胞を固定および透過処理することを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記方法が、追加の細胞標的を標識化するステップをさらに含む、請求項2または請求項3に記載の方法。
- 前記条件が、6.5~7.5のpHを含む、請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 前記接触させるステップが、生細胞の前記標識化の少なくとも20倍である死細胞の前記標識化をもたらす、請求項1~5のいずれかに記載の方法。
- 前記接触させるステップが、前記細胞試料を前記標識化化合物と10~60分間インキュベートすることを含む、請求項1~6のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞試料中の前記標識を検出する前記ステップが、フローサイトメータを使用して実行される、請求項1~7のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞試料が、血球細胞試料である、請求項1~8のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞試料が、ヒト由来である、請求項1~9のいずれかに記載の方法。
- 前記標識化化合物が、
714.69g/molの分子量と402nm/425nmの励起/発光波長、
836.78g/molの分子量と556nm/569nmの励起/発光波長、
1186.27g/molの分子量と638nm/652nmの励起/発光波長、または
1647.66g/molの分子量と852nm/877nmの励起/発光波長
を有する、請求項1~10のいずれかに記載の方法。 - 前記標識化化合物が、乾燥形態である、請求項12に記載のキット。
- フローサイトメータを使用して、細胞試料中の死細胞を生細胞と区別するために適する、請求項12または13のいずれかに記載のキット。
- 前記細胞試料中の細胞内標的および/または追加の細胞標的を検出するための標識された結合剤をさらに含む、請求項12~14のいずれかに記載のキット。
- 前記標識化化合物が、
714.69g/molの分子量と402nm/425nmの励起/発光波長、
836.78g/molの分子量と556nm/569nmの励起/発光波長、
1186.27g/molの分子量と638nm/652nmの励起/発光波長、または
1647.66g/molの分子量と852nm/877nmの励起/発光波長
を有する、請求項12~15のいずれかに記載のキット。
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