JPH03501653A - 標識連鎖球菌の抗体を含有する組成物ならびにそれを使用する試験キットおよびアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 標識連鎖球菌の抗体を含有する組成物ならびにそれを使用する試験キットおよび アッセイ〔発明の技術分野〕 この発明は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌体に対する 標識された抗体を含有する免疫学的組成物に関する。

それはまた、この組成物を含む免疫学的診断試験にも関する。

本発明は連鎖球菌の菌体を測定するための診断試験で有用である。

〔発明の背景〕

ストレプトコッカス種に属するグラム陽性細菌として分類される細菌は、ヒトの 病原体として知られている。グループＡの細菌は、Ｂ型溶血性肺炎、狂紅熱、リ ウマチ熱、心臓病続発症、糸球体ネフローゼ、敗血病性咽喉痛、および産褥敗血 症に対する主要な病因である。ストレプトコッカスＡによってもたらされる可能 性のある感染症の苛酷な性状のため、適切な方向の処理を行うには早期段階でそ の存在を診断することが重要である。換言すれば、病原体を低濃度で検出するこ との可能な高感度アッセイを入手することが強く望まれる。

抗原−抗体反応は、すべての免疫学的試験法の基礎である。

抗体として知られているある種のタンパク質は、抗原または他のタンパク質もし くは炭水化物でありうる外来物質の存在に対する応答として哺乳類およびヒトに よって産生される。

外来物質に応答するこの正常体が薬物、疾病または連鎖球菌の菌体の存在を初め とする他の生理的条件を検出するための数多くの診断法の開発をもたらしてきた 。

例えば、試験検体中の連鎖球菌の菌体に対する試験管内アッセイでは、この菌体 由来の抗原の存在が前記検体とその免疫学的対応物、すなわち抗体を接触させる ことによって検出されている。その抗原が存在する場合、その結果として形成す る免疫複合体は適当な技法および試薬を用いて検出することができる。

このような複合体は各種の方法で検出される。一般に、その反応に関与する一種 以上のものが検出可能に標識される。

すなわち、それ自体が検出可能であるか、あるいは何等かの方法で検出可能部分 く例えば、酵素、放射性同位体、発色原または蛍光原）が組み入れられたものか らそれは選ばれる。

今日では、酵素がアッセイについての備品を最少限にとどめ熟練者を必要とせず 、ならびに改良された感度の提供に対する都合のよさが幾つかのケースで見られ ることから、今日では検出可能部分として酵素を多くのアッセイで利用する（例 えば、ＥＬ　Ｉ　ＳＡとして既知）。

免疫学的反応を利用する多くの分析操作で遭遇する主な課題の一つは、非特異的 なパインディング反応が起きることである。例えば、抗体または抗原のような免 疫学的な反応体は、それらが特異的でない他のタンパク質、炭水化物または化学 もしくは生物学的物質と無差別に反応する可能性がある。それらはまた相互に反 応しそして一緒に凝集する可能性があるためそれらが特異的な反応性を有する分 子との特異的なパインディングを阻害する。さらに、アッセイがある種（例えば 、膜、ガラスチューブ、プレート、ビーズまたは繊維）の固体支持体を用いて実 施される場合には、前記特異的パインディング種がその表面化学基の性質によっ てこれらの材料と非特異的にパインディングするかも知れない。免疫学的複合体 が固体支持体上の一定領域で検出される場合には、予定しない反応がバックグラ ンドシグナルとして観察されるので前記非特異的パインディングが特にトラブル の原因となる。このバックグランドが高すぎる場合には、目的の免疫学的反応に 由来するシグナルが不明瞭となるかまたは誤読される。低抗原濃度は検出できず 、アッセイ感度は低下する。

特に、ポリアミド膜は抗体と非特異的に相互作用するおそれがある。固体表面（ 例えば、ポリアミド類）との非特異的なパインディングは、カゼインまたはウシ 血清アルブミンのようなタンパク質でそれらを被覆することによって極小化しう ろこきが知られている。同時係属中の米国特許第４．８２８．　！９８０号明細 書では、凝集アッセイで使用される微孔質膜を一定の低ｐｌタンパク質または炭 水化物で被覆することによりそのアッセイの非特異的相互作用を極小化しうろこ とが公表されている。さらに、同時係属中の米国特許出願第２０６．２５７号（ ＷａｒｒｅｎＩ［１らにより、１９８８年６月１３日出願）は、バックグランド を低下させそしてアッセイ感度を改良するために標識された抗体と共に水溶性タ ンパク質または炭水化物を使用することを記載する。

前記の各発明は当該技術分野の重要な進歩をもたらすものであるが、連鎖球菌の 菌体のアッセイではさらにバックグランドを低下させることが非常に有利である ことが観察された。

特に、例えばアッセイが微孔質濾過膜の個別領域で実施される場合、その領域の 周囲はアッセイのシグナルを不明瞭にし、個別領域において偽りの正の結果をも たらしそしてアッセイの測定を妨害する可能性がある標識された抗体の凝集をと きどき起こす。

〔発明の要約〕

前記課題は、連鎖球菌抗原に対する検出可能な標識抗体および水溶性または水分 散性非イオン界面活性剤を含んでなる水性免疫学的組成物の使用によって解決さ れた。

さらに、ａ、連鎖球菌の菌体から連鎖球菌抗原を抽出するための１種以上の試薬 、およびす、前述した水性免疫学的組成物を含んでなる連鎖球菌の菌体の測定に 有用な免疫学的診断試験キットにより解決される。

この発明はまた、次の工程を含んでなる連鎖球菌の菌体の検出方法を提供する。

Ａ、抽出された連鎖球菌抗原を含むことが疑われる被検体と前述の水性免疫学的 組成物と接触させて検出可能な標識免疫学的複合体を形成する工程、 Ｂ、被検体における抗原の存在の指標として複合体の存在を検出する工程。

本発明は、検出可能な標識抗体を用いる連鎖球菌の菌体に対する高感度診断試験 を手にすることを可能にする組成物を提供する。アッセイの改良された感度およ び特異性は、１種以上の水溶性または水分散性非イオン界面活性剤と混合した標 識抗体を使用することによって達成される。これらの界面活性剤がいかにして改 良をもたらすかは理解できないが、バックグランドが低下しそして支持体のバッ クグランド領域で形成された標識抗体の凝集が著しく低減することは明らかであ る。従って、試験が支持体のスポラ）　（Ｓｐｏｔ）または領域で行われる場合 にはスポットの品質が改良される。さらに、アッセイ感度は悪影響を受けず、低 濃度の抗原が容易に検出できるので多くの事例で改良される可能性がある。

〔発明の詳細な記述〕

本発明を使用してヒトまたは動物宿主由来の生物学的被検体における連鎖球菌の 菌体の存在を迅速に検出することができる。一般に、このような細菌は連鎖球菌 Ａ、Ｂ、Ｃ４たはＧ群の細菌から抽出される炭水化物抗原のような抽出された連 鎖球菌抗原の測定によって検出される。本発明によって連鎖球菌Ａ抗原が最も都 合よく検出できる。

こうしてアッセイすることができる生物学的試料は、連鎖球菌の菌体または抽出 された連鎖球菌抗原を含有することが疑われるいずれかの溶液、被検体または試 料が挙げられる。

一般に、このような細菌は口、咽喉または鼻孔由来のヒト粘液および組織培養物 中に見い出される。被検体は、適当な方法を用いて採集される。例えば咽喉被検 体は、一般に綿棒で採取し、予備処理（例えば、濾過）して望ましくない残層ま たは障害物を除去するか除去せずして試験することができる。

ある種の抗原部位は細菌細胞の外部に存在しうるのである種の分析法は連鎖球菌 の菌体そのものを用いて行うことが適する可能性もあるが、免疫学的反応を利用 するにはアッセイを抽出された抗原で行うことが好ましい。

連鎖球菌抗原の抽出は、多数の既知法を用いて行うことができる。例えば、抽出 は熱ホルムアミドを用いて、）ＩＣｆ存在下でのオートクレーブを用いて、各種 酵素を用いて（米国特許第４．６１８．５７６号、参照）、または一種以上の抽 出剤を使用する米国特許第４．６７３．６３９号に従って亜硝酸の発生によって 行うことができる。好ましい抽出法は、同時係属の米国特許第４．８０８．５２ ４号に記載されている。

好ましい抽出法では連鎖球菌の菌体を含有する疑いのある被検体く例えば、患者 由来の）を好ましい抽出組成物にさらされる。例えば、咽喉培養物を含有する綿 棒を抽出組成物を含むコンテナーに入れ、次いで適当な時間そこでインキュベー ションすることができる。必要により、遠心を行って抽出物を採取するか得られ た抽出物を中和することができる。

抽出された連鎖球菌抗原をこの発明の水性免疫学的組成物と接触させ検出可能に 標識された免疫学的複合体を形成する。

この組成物はその抗原に対する検出可能に標識された抗体を含んでなる。検出可 能に標識されたとは、適当な検出機器および方法を用いて抗体が直接検出できる か、一種以上の適当な試薬きその標識のさらなる反応後にそれが検出できること を意味する。標識は抗体分子の固有の部分にあるか、あるいはそれに結合した別 の部分にあってもよい。標識としては放射性同位体、化学発光成分、発色もしく は蛍光成分、リン光成分、酵素、酵素補因子および当業者に既知の他のものが挙 げられる。一般に、その標識は抗体を不溶化しないように標識抗体が水溶性また は水分散性である。

他の部類の標識としては、当該技術分野で対応する受容体物質に特異的にパイン ディングしうる特異的なパインディング物質と称されているものが挙げられる。

得られる複合物は免疫学的複合体と同等である。特異的パインディング複合物の 例としては、アビジン−ビオチンおよび糖−レクチンが挙げられる。従って、連 鎖球菌の抗体はアビジン、ビオチン、糖、レクチンまたは連鎖球菌抗原に特異的 でない同等の他の抗体もしくは抗原性物質で標識することができる。免疫複合体 の検出は標識に対応する受容体と標識の反応によって行うことができ、なおこの 受容体は検出可能な成分（例えば、放射性同位体、酵素または補因子）を有して いる。

放射性同位体および酵素が好ましい標識であり、酵素が最も好ましい。代表的な 具体例としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ウレアーゼ、 グルコースオキシダーゼ、β−グルコシダーゼおよび当該技術分野で既知の他の 酵素が挙げられる。ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが好まし く、ペルオキシダーゼが最も好ましい。

標識抗体は既知の方法を用いて調製することができる。多くは市販されている。

他のものは市販されていないが、それらは既知の方法を用いて調製される（例え ば、Ｌａｎｇｏｎｅおよびνａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ著の放射線標識抗体調製に関 するＭｅｔｈｏｄｓ　ｉ口Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９２．　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２７７ページ、１９８３、ビオチニル化抗 体の調製に関するヨーロッパ特許公開第２０１０７９号公報および米国特許第４ ．２７６、２０６号明細書を参照のこと）。一般に、酵素標識抗体は酵素を誘導 体化し、その酵素誘導体を精製し、この誘導体を抗体と反応させ、得られた結合 物を精製そして特性決定することによって調製する。

各種の方法が次の引用文献に記載されている。ＹｏｓｈｉｔａｋｅのＢｕｒ、Ｊ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０１．　３９５（１９７９）、ＮａｋａｎｅらのＪ、　 Ｈｉｓｔ、ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｆｆｌ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　 ２２．１０８４（１９７４）およびＡｖｒａｍｅａｓのＢｕｌｌ。

Ｓｏｃ、Ｃｈｉｎ、Ｂｉｏｌ、、　５０．１１６９（１９６８）。

この発明の組成物中に存在する標識抗体の量は、標的リガンド、使用される色素 生成組成物（酵素標識が使用される場合）、使用される特定の標識および特定の アッセイの他の要因に応じて変動しうる。しかしながら、一般には少なくとも約 ０．１ｇ／ｍＡ、好ましくは約１〜約２０に／蔵の量で存在する。

この発明の実施に際して使用される標識抗体および未標識抗体（後述）は、別個 にまたは両者ともモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。そ れらは数々の市販光（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｅｄ、　Ｉｍｍｕｎｏｓｅａｒｃ ｈまたはＶｅｎｔｒｅｘ）から得ることができるしまた標準的な技法を用いて調 製することもできる。

この免疫学的組成物の第二の必須成分は、水溶性または水分散性非イオン界面活 性剤である。一般に、このような界面活性剤は少なくとも約１■／−の量で水に 溶解性または分散性である。限定されるものでないが、有用な界面活性剤として は、Ｔｒｉｔｏｎ　（商標）非イオン界面活性剤〔例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標 ）　Ｘ−１００およびＴｒｉｔｏｎ　（商標）　Ｎｌ０ＩＩとして、またはＮｏ ｎ　１ｄｅｔ　（商標）もしくはＢｒ１ｊ　（商標）非イオン界面活性剤〔例え ば、Ｎｏｎ１ｄｅｔ（商標）　Ｐ−４０およびＢｒ１ｊ　（商標）３５〕として 販売されているポリオキシエチレンエーテル類、ならびにＴｅｒｇｉｔｏｌ　（ 商標）非イオン界面活性剤（例えば、’ｊｅｒｇｉｔｏｌ（商標）　ＮＰＸおよ びＮＰ−７］のようなポリグリコールエーテル類が挙げられる。他の有用な物質 は、特に界面活性剤に対する標準的な文献、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ　Ｅｍｕ ｌｓｉｆｉｅｒｓ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ。

１９８６年版、（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｉｎｇ　Ｃｏ、、　ＧｌｅｎＲｏｃｋ、　Ｎ、　Ｊ、　）ならびにＳｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＣｏｍｐａｎｙのカタログｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｏ ｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｆｏｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄＤｉａ ｇｎｏｓｔｉｃ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｊ　（１９８９）、３３３〜３３５ページ を参照することにより当業者に容易に明らかとなろう。

特に有用な界面活性剤は、モノラウレート、モノオレエート、モノパルミテート 、モノステアレートおよび他の誘導体のようなポリオキシエチレンソルビタン誘 導体類である。モノラウレート誘導体が最も好ましい。この材料はＴｗｅｅｎ　 （商標）２０非イオン界面活性剤として購入することができる。

これらの非イオン界面活性剤は、この発明の免疫学的組成物中に少なくとも約０ ．０５重量％、好ましくは約０．１〜約０．５重量％（総組成物重量基準）存在 する。

場合により、しかし好ましくは免疫学的組成物はアッセイ性能を改良する各種他 の成分も含む。例えば、低ｐｉを有する水溶性タンパク質または炭水化物を含む ことができる。

ｐｌ（または等電点）の語は、分子が電荷においで中和であるように分子の正電 荷と負電荷の数が等しくなるｐｈ＋として知られている。ｐＩは標準材料および 方法を用いて測定することができる。限定されるものでないが、このような材料 としては、カゼイン誘導体または負に帯電した他のタンパク質誘導体（例えば、 スクシニル化カゼイン、グルタリル化カゼイン、スクシニル化ウシ血清アルブミ ンおよびスクシニル化コラーゲン）、ならびにセルロース誘導体（例えば、カル ボキシメチルセルロースおよびカルボキシエチルセルロース）が挙げられる。ス クシニル化カゼインが好ましい。

この組成物はまた、その保存安定性を改良する１種以上のフェノール類を含むこ とができる。有用なフェノール類は、例えば米国特許第４．８２８．９８３号に 記載されており、ｐ、ｐ’−ビフェノール、４′−ヒドロキシアセタニリド、ｐ −メトキシフェノール、クロロフェノールレッド、ｐ−クレゾール、ｍ−メトキ シフェノール、バニリン、４−クロロ−３，５−ジメチルアミノフェノールおよ びｐ−ヒドロキシ安息香酸が挙げられる。フェノール類、ｐ−メトキシフェノー ルおよび４′−ヒドロキシアセタニリドが好ましく、４′−ヒドロキシアセタニ リドが最も好ましい。この組成物中に存在するフェノール量は、一般に少なくと も約０．００１重量％である。

この免疫学的組成物には１種以上の緩衝剤が一般に含まれる。少なくとも緩衝剤 は適当な量で組成物のｐｉｔを約７がら約９の範囲内に有効に維持しうるものが 有用である。限定されるものでないが、代表的な緩衝剤としては、３−（Ｎ−モ ルホリノ）プロパンスルホン酸、Ｎ−＜２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ ’−２−エタンスルホン酸およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２− アミノエタンスルホン酸が挙げられる。

連鎖球菌抗原と検出可能な抗体との間で形成される複合体は、使用される標識の タイプに応じて適当な方法および機器を用いて検出することができる。

標識が酵素である場合、複合体は適当な基質および１種以上の色素生成試薬と接 触される。ある例では、基質それ自体が色素を提供する。このような基質として は、ベンジジンもしくはそれらの誘導体、２，２′−アジノージ−（３−エチル ベンゾチアゾロン−６−スルホン酸）、フェノールレッド、０−フ二二レンジア ミン、ピロガロール、４−アミノアンチピリン、ブロモピロガロールレッドおよ び当該技術分野で既知の他の色素が挙げられる。また、水素供与体および電子受 容体を組み合わせて検出可能種（例えば、米国特許第４．２６０．６７９号に見 られる）を提供することができる。

標識はペルオキシダーゼであって、ペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で色 素を提供するロイコ染料を初めとする色素生成試薬が好ましい。有用なロイコ染 料としては、イミダゾール類、アリールメタン類および当該技術分野で既知の他 のものが挙げられる。特に有用なロイコ染料は、トリアリールイミダゾール類（ 米国特許第４．０８９．７４７号明細書に記載されるような）およびトリアリー ルメタン類（米国特許第４、６７０．３８５号明細書に見られるような）である 。好ましい色素生成組成物は同時係属中の米国特許出願第１３６．１６６号（Ｍ ｃＣｌｕｎｅらによる１９８７年１２月８日出願）明細書に記載されており、引 用することによって本明細書の内容となる。

複合体が形成されたならば、次に、連鎖球菌の菌体の存在を示すであろう試験検 体中の抗原の存在をアッセイが示すかどうかを決定するためにそれを検出する。

正対照試験および負対照試験の両方を、必要な結果を与える適当な試薬を用いて 同時に行うことができる。

この発明の好ましい態様では、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ）　Ａの検出方法は、Ａ、ストレプトコッカスＡを含有する疑いのある被検体 をその菌体由来の抗原を抽出するための１種以上の抽出試薬と接触させる工程、 Ｂ、この抽出された連鎖球菌Ａ抗原を酵素標識抗体を有する本明細書で開示した 水性免疫学的組成物と接触させて酵素標識免疫学的複合体を形成する工程、 Ｃ０工程Ａと同時にまたはその前後で、抽出された連鎖球菌Ａ抗原を不溶化もし くはそのようにしうる前記抗体に対する未標識抗体と接触させて抗体と未標識抗 体の複合体を形成する工程、 Ｄ、得られる抗原を伴う標識抗体と未標識抗体の複合物を酵素の存在下で色素を 提供する１種以上の試薬と接触させる工程、ならびに Ｅ、被検体におけるストレプトコッカスへの存在の指標として色素の存在を検出 する工程を、含んでなる。

この態様の工程Ｃに記載したように、抽出された連鎖球菌抗原はまた、その抗原 に対する第二抗体と接触することができ、この第二抗体は第一抗体について前述 したような検出可能成分で標識されていない。この第二抗体を使用して２つの抗 体間に抗原の「サンドイッチ」を形成することができる。

一般に、未標識抗体は不溶性支持体（例えば、ビーズ、膜、フィルター、ガラス 管または当該技術分野で既知の他の材料）に結合されているか、あるいはアッセ イ中にそのように結合されうる。後者の例では、未標識抗体が支持体上の他の部 分または化学基と容易に反応する部分または化学基を有することができる。従っ て、第二抗体は吸着、共有結合または特異的なパインディング手段（例えば、ア ビジン−ビオチン）を介して支持体に結合することができる。

好ましい態様では、この未標識抗体が濾過膜のような本不溶性微孔質製品にある 方法で結合される。この膜は、数種のポリアミド（例えば、ナイロン）または最 も好ましくは変性ポリアミドで構成することができる。それは、未複合化物を排 出するが抗原と２つの抗体との間で形成された免疫学的複合体は容易に捕捉する のに十分な多孔度を有する。

未標識抗体は前述の微孔質製品へ容易に付着することができる。例えば、塗布、 スポツティングもしくは噴霧し、分子間の疎水結合によってその上に保持するこ とによって機械的に付着するか、あるいは抗体を粒子に結合させる場合には粒子 間で結合することもできる。それはまた、化学的手段によって付着することもで きる。その抗体をポリマー粒子に共有結合し、その粒子をナイロンの微孔質濾過 膜へ機械的に付着することが好ましい。

未標識抗体は、一般に、検出すべきすべての利用可能な抗原とパインディングす るのに十分量でアッセイに用いられる。

抽出抗原と未標識抗体の接触のタイミングは、標識抗体と抗原との接触に殆どの 場合に関連するので限定的でない。好ましい態様では、未標識抗体が固体支持体 上に固定されている場合、それと抗原が接触された後に標識抗体との接触が行わ れる。

この発明のアッセイは、未複合化物質または未利用試薬を複合体物質から分離す る１回以上の洗浄工程を含むことができる。分離は標準的な遠心または他の機械 的手段を通して行うことができる。未複合化物質は、微孔質膜を通して洗浄し、 膜上に複合体を残こすことが好ましい。

他の工程では、色素生成剤や未標識抗体を固定化するための試薬を加えることが 必要であるかも知れない。当業者は、このような工程をアッセイにどのようにし て組み入れればよいか容易に理解できるであろう。代表的なアッセイは後述の例 ３で示す。

この発明のアッセイは標準的な実験室の備品およびガラス容器を使用して行うこ とができるが、ある種の試験装置で実施することが好ましい。米国特許第３．８ ２５．４１０号、同３．８８８．６２９号、同３．９７０．４２９号および同４ ．４４６．２３２号明細書に記載されるものを初めとする各種の試験装置が当該 技術分野で既知である。特に有用な装置は、ヨーロッパ特許公開第３０８２３１ 号および米国特許第４．８７０．００７号明細書に記載されている。

より具体的には、試験装置は生物学的被検体試料と適当な試薬を収容できる１以 上の試験ウェルを有する水不溶性シェルを含んでなる。

このシェルは、ガラス、ポリマー材料、セラミック、繊維材料、セルロース材料 および当該技術分野で既知の他の材料のようないずれかの有用な水不溶性材料か ら作製することができる。

好ましい態様では、試験装置は被検体の試験結果、正対照結果および負対照結果 を提供するように設計された３つの試験ウェルを有する。各試験ウェルはそれら の中に微孔質製品が取り付けられている。他の試験装置はヨーロッパ特許公開第 ２８０５５８号明細書で記載され特許請求されている。有用な試験装置の他の変 型も当業者の技術水準の範囲内にあるであろう。このような試験装置は、イース トマンコダック社（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から市販され ている５ｕｒｅｃｅｌｌ　（商標）診断アッセイキットが最近使用されている。

この発明の診断キットは、この発明の免疫学的組成物ならびに１種以上の他の試 薬または試薬組成物を含む。ある態様では、そのキットが免疫学的組成物と１種 以上の抽出試薬を含む。もう一つの態様では、キットが免疫学的組成物と標識が 酵素である場合に検出可能な種を提供するための１種以上の試薬を含む。いずれ の態様においても（適当な場合）、キットは緩衝剤、洗液、色素生成溶液、試験 装置、抽出装置、未標識抗体、固定化試薬（例えば、アビジン塗布ビーズ）、混 合容器、ピペット、綿棒および説明書などをも含むことができる。

いずれの試験装置も連鎖球菌抗原に対する未標識抗体が固定化された使い捨て試 験装置を含むことが好ましい。

〔実施例〕

以下の例は本発明を具体的に説明するために提供するものであってそれを限定す るものでない。すべてのパーセンテージは、特に言及しない限り重量基準である 。

材料 ロイコ染料溶液は、２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４ ，５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾールを用いて次のように調製した 。

固体ロイコ染料を、リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中２０％ポリ　 （ビニルピロリドン）溶液に溶解した（０．１％溶液の調製）。次に、この溶液 をリン酸すｌ−ＩＪウム緩衝液中過酸化水素（１０ミリモル濃度）、４′−ヒド ロキシアセタニリド（０，７ミリモル濃度）およびジエチレントリアミン五酢酸 （１０マイクロモル濃度）含有溶液に加え、最終濃度を１％ポリ　（ビニルピロ リドン）および０．００５％ロイコ染料とした。

スクシニル化カゼインは、同重量の無水コハク酸とカゼインを２５℃で４時間反 応させ、次いで透析によって生成物を精製して調製した。

ＬｏＰｒｏｄｙｎｅ　（商標）ナイロン微孔質膜（Ｐａｌｌ　Ｃａｒｐ、）を、 使い捨て試験装置の試験ウェルに取り付け、Ｆｌｕｏｒａｄ（商標）　ＦＣ１３ ５界面活性剤（０，０５ｇ／ｍ”）で予備処理した。

抗ストレプトコッカスＡ−ペルオキシダーゼ結合物は、市販されている免疫学的 に純粋なラビットポリクローナル抗体とＹｏｓｈｉｔａｋｅら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　１０１．３９５＜１９７９）に記載の方法で得た西洋ワサビペ ルオキシダーゼを用いて調製した。

例１および２　免疫学的組成物 ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　Ａ抗原のアッセイで使用 する免疫学的組成物は次のように調製した。

ナノ純度の水中スクシニル化カゼイン（５ｇ）の溶液を調製した（１１）。この 溶液に３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝剤（２０，９３ｇ　）を 加え、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ７，５５に調整した。

この溶液のそれぞれの部分（各５００ｍｆ）にフェノール（４′−ヒドロキシア セタニリド０．７５６ｇまたはｐ−メトキシフェノール６．２　ｍｇ＞　、Ｔｗ ｅｅｎ（商標）２０非イオン界面活性剤（Ｉｇ、０．２％）およびチメロサール 防腐剤（０，０５ｇ）を加えた。得られた溶液をフィルター（０，４５−）を通 して濾過し、これにストレプトコッカスＡに対するペルオキシダーゼ標識抗体（ 抗体１゜２３２■／１ｎ１を含むリン酸緩衝溶液３．５７ｍｊりを加えた。

こうして、例１は安定剤として４′−ヒドロキシアセタニリドを含ませ、例２は ｐ−メトキシフェノールを含ませた。

例３　ストシブ１−コツカスＡについてのアッセイこの例は、本発明の方法にお ける例１および２の組成物を使用する生物学的被検体中のスト１／ブトコツカス Ａ抗原の検出を例示する。

ストレプトコッカスＡ抗原は標準的な亜硝酸抽出法を用いてグループＡストレプ トコッカス培養物から得た。なお、亜硝酸は培養生菌体に加える前に水性亜硝酸 ナトリウトを酸性共試薬に混合した。次に、この抽出液を過剰の緩衝剤を加える ことにより中和した。グループＡ炭水化物抗原は、酸性エタノールおよびアセト ンを用い、上澄を排棄しそしてベレットを０．８５％生理食塩水に再懸濁させて 得た。ラムノース濃度は、Ｄｉｓｃｈｅおよび５ｈａｔｔｌｅｓ、　Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、１７５．５９５〜６０３ページ（１９４８）の方法によって測定 した。この濃厚物（２０ｍ　）を、クエン酸（１０ｍ、　１．２モル濃度）、亜 硝酸ナトＩＪ　’７　Ａ　（１２０ｉ１１．８モル濃度）および４−モルホリノ プロパンスルホン酸緩衝液（１２０ｍ、　２モル濃度、ｐＨ８）を含んでなる中 和された抽出液中に再懸濁した。

前述のような微孔質膜を、ヨーロッパ特許公開第３０８２３１号公報に記載され ているのと同様な２つの使い捨て試験装置の３つのウェルのそれぞれに取り付け た。ポリ〔スチレンーコ−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）−ス チレン〕ビーズ分散体〔０，１モル濃度グリシン（ｐｆ１８．５　）中１％固体 懸濁液とポリ　（アクリルアミド）（５％）および０．０００５％の光学増白剤 の混合物〕を、被検体試験ウェルとして称した試験ウェル中の膜の中心領域に加 えた。ビーズに対してストレブトコッカスＡ抗原に対するラビットポリクローナ ル抗体を共有結合させた。

負対照ウェルとみなす各使い捨て試験装置の第二試験ウェルには、ポリ　（アク リルアミド）（５％）および光学増白剤を混合したラビットγ−グロブリン（ビ ーズ当たり１重量％）を結合させた同一のポリマービーズの乾燥分散体＜２１１ １）を含ました。この分散体は膜の中心部に適用した。

正対照ウェルとみなす各試験装置の第三試験ウェルは、ポリ　（アクリルアミド ）（５％）、光学増白剤および２０ｎｇ／ｄのストレプトコッカスＡ抗原中に上 記の試薬（２Ｉ）の乾燥分散体を含ました。この分散体を膜の中心部に適用した 。

抽出抗原の試料（約３００ｎｇ／−の炭水化物含有物、２００ｐｌ）を被検体試 験ウェルだけに加えた。例１および２に由来するペルオキシダーゼ標識抗体組成 物（９ｇ／ｍｆ結合物、各４０ｐｌ　’）を前記使い捨て試験ウェルすべてに加 え、次いで室温にて２分間インキュベーションした。次に、流体を同時に排液し ながらデシルサルフエ−）　（１８ｇ／６）含有洗液（２４０ｍ　）で試験ウェ ル中の膜を２度洗浄した。前述のロイコ染料組成物（４０ｍ　”）を加えた後、 室温で５分間インキュベーションした。

例１および２のものと同様であるがＴｗｅｅｎ　（商標）２０非イオン界面活性 剤を含まない対照組成物を、ストレプトコッカスＡについての対照アッセイにお いて同様に使用した。この対照組成物は米国特許出願第２０６．２５７号（前述 ）に記載され特許請求されている組成物と類似である。

各試験ウェルの中心部で得られた色素のスポットを観察し、色素の観察できない ものを０とし最も高い色素濃度を１０とする０〜１０のスケールで段階分けした 。膜に未標識抗体が固定化された中心部外の領域に存在するいずれかの色素を観 察することによってバックグランドの読みを得た。

これらの試験結果を以下の表に示す。対照アッセイ、特に負対照ウェルではアッ セイにおいて許容できないノ＜・ツクグランドを示すことが明らかである。例１ および２の組成物を使用するアッセイで少ないかまたはバックグランドを示さな い。

このことは、対照組成物およびアッセイを陵駕する有意な改良を示す。

第　Ｉ　表（対　照） 第■表（例１） ００１　００．５７０ 第■表（例２） ０００．５０ＯＴＯ 本発明をその特に好ましい態様を引用して詳細に記述してきたが、変形および変 更態様は本発明の精神および範囲内で有効でありうることが理解されるであろう 。

手続補正書 平成２年７２月７０日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．連鎖球菌抗原に対する検出可能な標識抗体および水溶性または水分散性非イ オン界面活性剤を含んでなる水性免疫学的組成物。
2. ２．前記抗体が放射性同位体または酵素で標識されている請求項１記載の組成物 。
3. ３．前記抗体が酵素で標識されている請求項２記載の組成物。
4. ４．前記抗体が連鎖球菌Ａ抗原に向けられたものであって、ペルオキシダーゼで 標識されている請求項１記載の方法。
5. ５．前記非イオン界面活性剤が少なくとも約０．０５重量％の量で存在する請求 項１記載の組成物。
6. ６．前記非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチ レンソルビタン誘導体類およびポリグリコールエーテル類からなる群より選ばれ る請求項１記載の組成物。
7. ７．前記非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン誘導体類である請 求項６記載の組成物。
8. ８．前記非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートで ある請求項７記載の組成物。
9. ９．さらに、緩衝剤、水溶性タンパク質または炭水化物およびフェノールを含ん でなる請求項１記載の組成物。
10. １０．ａ．連鎖球菌の菌体から連鎖球菌抗原を抽出するための１種以上の試薬、 ならびに ｂ．前記連鎖球菌抗原に対する検出可能な標識抗体および水溶性または水分散性 非イオン界面活性剤を含んでなる水性免疫学的組成物、を含んでなる連鎖球菌の 菌体の測定に有用な免疫学的診断試験キット。
11. １１．前記抗体が酵素で標識されており、そして前記キットがさらに前記酵素の 存在下で検出可能な種を提供するための１種以上の試薬を含んでなる請求項１０ 記載の試験キット。
12. １２．ａ．連鎖球菌抗原に対する酵素標識抗体および水溶性または水分散性非イ オン界面活性剤を含んでなる水性免疫学的組成物、ならびに ｂ．前記酵素の存在下で検出可能な種を提供する１種以上の試薬類、を含んでな る連鎖球菌の菌体の測定に有用な免疫学的診断試験キット。
13. １３．さらに、前記連鎖球菌抗原に対する未標識抗体を固定化した使い捨て試験 装置を含んでなる請求項１２記載の試験キット。
14. １４．前記酵素がペルオキシダーゼであり、前記１種以上の試薬がペルオキシダ ーゼおよび過酸化水素の存在下で色素を提供するトリアリールイミダゾールロイ コ染料を含む請求項１２記載の試験キット。
15. １５．Ａ．抽出された連鎖球菌抗原を含有することが疑われる被検体を、前記連 鎖球菌抗原に対する検出可能な標識抗体および水溶性または水分散性非イオン界 面活性剤を含んでなる水性免疫学的組成物と接触させて検出可能な標識免疫学的 複合体を形成する工程、 Ｂ．前記被検体における前記抗原の存在の指標として前記複合体の存在を検出す る工程、を含んでなる連鎖球菌の菌体の検出方法。
16. １６．前記抽出された抗原を工程Ａの前であって抽出後にそこに固定化された未 標識抗体と接触させる請求項１５記載の方法。
17. １７．前記抗体が酵素で標識されており、そして前記複合体の検出が前記酵素の 存在下で検出可能な種を提供する１種以上の試薬と前記複合体を接触させること によって行われる請求項１５記載の方法。
18. １８．Ａ．ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ａを含有するこ とが疑われる被検体を、前記細菌から抗原を抽出するための１種以上の抽出試薬 と接触させる工程、Ｂ．前記抽出された連鎖球菌Ａ抗原を、前記連鎖球菌Ａ抗原 に対する酵素標識抗体および水溶性または水分散性界面活性剤を含んでなる水性 免疫学的組成物と接触させて酵素標識免疫学的複合体を形成する工程、 Ｃ．工程Ｂと同時にまたはその前後で、前記抗原に対する未標識抗体であって、 固定化されているかまたはそうされうる未標識抗体を前記抽出された連鎖球菌Ａ 抗原と接触させて抗原と前記未標識抗体の複合体を形成する工程、Ｄ．前記抗原 と標識抗体および未標識抗体の得られる複合体を、前記酵素の存在下で色素を提 供する１種以上の試薬と接触させる工程、ならびに Ｅ．前記被検体におけるストレプトコッカスＡの存在の指標として前記色素の存 在を測定する工程、を含んでなるストレプトコッカスＡの検出方法。
19. １９．前記酵素がペルオキシダーゼであり、そして前記色素がトリアリールイミ ダゾールロイコ染料および適酸化水素を使用して生成される請求項１８記載の方 法。
20. ２０．前記非イオン界面活性剤が少なくとも約０．０５重量％の量で存在し、そ してポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体類お よびポリグリコールエーテル類からなる群より選ばれる請求項１８記載の方法。