CN111690090B

CN111690090B - 一种糖基化光子晶体水凝胶及其在流感病毒检测中的应用

Info

Publication number: CN111690090B
Application number: CN202010612731.7A
Authority: CN
Inventors: 李艳霞; 缪玲; 陈毅挺; 黄露; 娄本勇; 康心汕
Original assignee: Minjiang University
Current assignee: Minjiang University
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111690090A

Abstract

本发明公开了一种糖基化光子晶体水凝胶及其在流感病毒检测中的应用，其是先以乳糖酸为原料进行末端氨基化处理，然后引入不饱和双键制得半乳糖功能化单体；再以丙烯酰胺和GAC为功能单体，甲叉双丙烯酰胺为交联剂，于二维光子晶体表面进行聚合，而得到所述糖基化光子晶体水凝胶。流感病毒对该光子晶体水凝胶中的糖基有裂解作用，可破坏其空间结构，导致光子晶体间距发生变化，引起德拜环的变化，因此可利用德拜环直径的变化值与流感病毒浓度的关系，实现对流感病毒的检测。本发明可实现高特异性、高灵敏、便携式的流感病毒识别与检测，其检测时间短，成本低且结果可视化，可实现流感病毒的即时检测，有利于流感疫情的早期筛查。

Description

一种糖基化光子晶体水凝胶及其在流感病毒检测中的应用

技术领域

本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种糖基化光子晶体水凝胶及其在流感病毒检测中的应用。

背景技术

流行性感冒病毒，简称流感病毒，属于正黏液病毒科，是一种单股负链RNA病毒，它会造成急性上呼吸道感染，并通过呼吸、讲话等途径借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。流感病毒主要分为三个等级，即A型、B型、C型。其中A型流感病毒抗原易发生变异，多次引起世界性大流行。A型流感病毒根据HA和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)糖蛋白进行分类，又可分为许多亚型，HA可分为15个亚型（H1～H15），NA有9个亚型（N1～N9）。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。甲型流感病毒含有3种膜蛋白：HA、NA，基质蛋白（M₂，少量离子通道），基质蛋白（M₁）在双层脂质膜下层，基因组的各个节段与3个聚合酶（PB1，PB2及PA）构成的病毒RNA聚合酶复合体（RNP）相连，由核衣壳蛋白（NP）包裹，形成独立的核衣壳。病毒囊膜上的2种纤突糖蛋白，直接插入脂质膜上，一种为棒状的HA，有同源三聚体组成，负责病毒进入宿主细胞并进行复制；另一种为蘑菇状的NA，有同源四聚体组成，负责在宿主细胞内释放新的病毒颗粒，HA和NA在病毒的免疫反应中起重要作用，抗体可与之结合避免病毒感染。

预防流感病毒和可能的流感大流行最重要的先决条件是尽早隔离，检测病毒核酸存在。发展新型流感病毒检测方法意义重大，重在改善方法的条件和属性，以达到易操作，便携式仪表，快速测试和低成本等要求。

现有的流感病毒检测方法有：病毒分离检测法、核酸检测法、聚合酶链反应（PCR）检测方法（基于逆转录PCR的检测方法、普通RT-PCR、荧光RT-PCR、细胞培养分离法）高通量测序法、生物传感器检测法、基于免疫的检测方法。在现有的流感病毒检测方法中，病毒分离检测法高灵敏性且有特异识别性，但检测时间长，需要特殊的实验仪器和设备；核酸检测法具有高灵敏性和特异性，但其检测成本高并且存在交叉感染的风险，危险系数较大；基于PCR的检测技术，检测过程操作复杂，耗时长，有可能出现交叉污染；基于核酸序列扩增的检测方法，检测成本太高并且检测过程中所用到的仪器设备以及部分分析软件使用较复杂，不适合普遍性使用。综上，研发一种具有高敏感性、特异性、即时性并且能进行样品批量检测的检测技术，使人们用最短时间，达到最高准确的检测结果，迫在眉睫。

光子晶体是一种介电常数周期变化的功能材料。由于光子晶体中光子禁带具有可调控性利用这一特性，可用来制备多功能传感器，例如温度、压力、pH值、血糖浓度、离子强度的探测等，也可结合其他特殊材料，制备成具有不同性质的传感器。水凝胶是一种含大量溶剂的具有三维空间网状结构的高分子聚合物，其特性表现为在溶剂中有溶胀而不溶解性，识别性、刺激响应性、生物相容性等。利用光子晶体和水凝胶的特性，人们将两者结合，形成具有自我表达特性的光子晶体水凝胶，其具有特异选择性、识别性等各种特性，在各个领域都有了广泛应用，其中包括通信传播、智能传感、生物检测等方面。

研究报道显示，流感病毒表面的神经氨酸酶（NA）会裂解含葡萄糖或半乳糖的底物，这一特性可以用来鉴定流感病毒。但在含糖底物制备上较为复杂，其采用的电化学检测方法灵敏度虽高但不够便携，血糖仪虽然便携，但灵敏度不够。因此本发明制备了一种基于光子晶体的糖基化水凝胶，利用流感病毒对糖基化水凝胶中糖基的裂解作用可引起的德拜环直径的变化值，从而构建了一种新型流感病毒便携式检测方法，其具有较高的灵敏度，利于流感疫情的早期防控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种糖基化二维光子晶体水凝胶及其制备方法，与其在流感病毒检测中的应用。该糖基化光子晶体水凝胶可实现对流感病毒的高特异性、高灵敏度、高速度的检测。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的目的之一是保护一种糖基化光子晶体水凝胶，其是以乳糖酸（LA）为原料进行末端氨基化处理，然后引入不饱和双键制得半乳糖功能化单体（GAC）；再以丙烯酰胺（AAM）和GAC为功能单体，甲叉双丙烯酰胺（MBA）为交联剂，于二维光子晶体（PC）表面聚合生成一层水凝胶，而得到所述糖基化光子晶体水凝胶。

所述糖基化光子晶体水凝胶的制备方法包括以下步骤：

1）乳糖酸末端氨基化处理：按一定质量比将LA和乙二胺（EDA）分别溶于二甲亚砜（DMSO）中，充分溶解后将两者混合均匀，然后将所得混合液倒入三颈烧瓶中，于75 ℃冷凝回流2 h，待产物冷却至室温后，将冷却后的产物倒入氯仿中沉析，沉析后过滤，再低温真空干燥2 h，得到较纯的半乳糖端氨基中间体L-NH₂，冷藏，备用；

2）半乳糖功能化单体GAC的合成：按一定质量比将合成的L-NH₂和丙烯酸（AAC）分别溶于DMSO中，充分溶解后将两者混匀，接着加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚铵盐（EDC·HCl）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）的混合液（其中EDC·HCl和NHS的质量比为1：1），使EDC·HCl和NHS在所得反应液中的总浓度为0.1 wt%，然后室温下磁力搅拌20 h，然后倒入氯仿中沉析，沉析后所得产物用少量氯仿多次冲洗后低温真空干燥，得到较纯的半乳糖功能化单体GAC；

3）二维光子晶体的组装：按体积比1-3:1（优选为2:1）量取聚苯乙烯乳液和正丙醇，将二者超声混合，使聚苯乙烯微球分子分散均匀，然后采用针尖注射法将该混合液垂直匀速地注射在去离子水表面，使其在水表面形成一层光亮的单层聚苯乙烯光子晶体（PC），再将水面上制得的聚苯乙烯光子晶体转移到载玻片上，将载玻片垂直放置，室温风干，使得聚苯乙烯二维光子晶体呈规则排列；

4）糖基化光子晶体水凝胶的制备：称取12g丙烯酰胺（AAM）和0.4 g甲叉双丙烯酰胺（MBAA），加去离子水溶解并定容至50 mL，得A液，储存在冰箱中备用；取A液1 mL，加GAC搅拌1h，再依次加入1 mL去离子水、20 μL10 wt%的过硫酸铵溶液（APS）和2 μL 四甲基乙二胺（TEMED），边加边搅拌至混合液聚合呈半胶态时，将其涂到步骤3）所得载有光子晶体的载玻片上，盖上盖玻片使其均匀平铺，静置，待水凝胶完全成胶后取下盖玻片，水洗，得到所述糖基化光子晶体水凝胶。

步骤1）中所用乳糖酸和乙二胺的质量比为2-6:1，混合液的质量浓度为0.5-2 g/mL。

步骤2）中所用L-NH₂和丙烯酸的质量比为2-6:1。

步骤1）、2）中所述低温真空干燥的温度不超过40 ℃。

步骤3）中所用聚苯乙烯乳液的质量浓度为10-20%，其中聚苯乙烯微球的粒径为700-900 nm。

步骤4）中加入的GAC与所用A液中丙烯酰胺的质量比为1:1-6，混合液搅拌的时间为1-5 min。

本发明的另一目的是保护所述糖基化光子晶体水凝胶在流感病毒检测中的应用。流感病毒能够裂解糖基化光子晶体水凝胶中的糖基（如半乳糖或葡萄糖），破坏水凝胶的空间结构，导致光子晶体间距发生变化，引起德拜环的变化，因而可利用德拜环直径的变化值与流感病毒浓度的关系，实现对流感病毒的高特异性、高灵敏度定量检测。所述流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1中的任意一种。

其具体检测方法为：

a）将所述糖基化光子晶体水凝胶置于水中溶胀1.5 h，然后取出，用滤纸吸去表面游离水并保持水凝胶呈溶胀状态，将其固定于桌子上方并用激光笔照射该水凝胶，记录在桌面上显示出的德拜环的直径；

b）取10 μL系列浓度的流感病毒样液分别滴在糖基化光子晶体水凝胶上并标记区域，静置2h后水洗去标记区域内的残留物，然后沥干表面游离水并保持水凝胶呈溶胀状态，再次用激光笔照射并测定桌面上显示出的德拜环的直径；

c）利用步骤a）、b）所得德拜环直径的差值与流感病毒浓度的对数进行线性拟合，获得反映两者线性关系的回归方程；

d）将待测流感病毒样液按步骤b）进行操作，获得其德拜环的直径；

e）利用待测流感病毒样液的德拜环直径与步骤a）所得德拜环直径的差值及获得的回归方程计算出待测流感病毒溶液的浓度。

其中，所用激光笔为绿色激光笔，其波长为532 nm，功率为1000 mW；照射时，光源与水凝胶的垂直距离为20cm，水凝胶与桌面的垂直距离为10cm；所述流感病毒样液的浓度为0.01~100 ng/mL。

与现有技术相比，本发明构建的糖基化二维光子晶体水凝胶及利用其进行流感病毒检测分析的方法，有如下的优点：

（1）本发明将光子晶体与水凝胶结合，利用光子晶体对光的衍射作用和水凝胶的环境敏感性，能够简单、直接的通过徳拜环直径变化来检测流感病毒，起到了可视化的效果；

（2）本发明在相容性高的水凝胶上面引入了糖基分子，增强了对目标反应物分子的吸附识别作用，提高了流感病毒检测的灵敏性；

（3）本发明制备的糖基化光子晶体水凝胶成本低廉、性质稳定、生物相容性好，具有一定的弹性、附着力强。对于附着载体没有特殊限制，方法简单，可实现对流感病毒的简单快速检测，避免了使用大型仪器的不便之处。

（4）本发明应用于流感病毒的检测分析，具有高特异性、高灵敏、便携式等特点，其检出限可达10 pg/mL，且检测时间短，有利于流感疫情的早期筛查，并可用于复杂基底中流感病毒的检测。

附图说明

图1为半乳糖功能化单体GAC的合成路线图。

图2为利用本发明糖基化光子晶体水凝胶检测流感病毒的原理图。

图3为L-NH₂与AAC的质量比对GAC产量的影响情况图。

图4为A液中AAM与GAC的相对含量对成胶时间的影响情况图。

图5为流感病毒浓度的对数值与德拜环差值的拟合曲线。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

半乳糖功能化单体（GAC）的具体制备步骤如下：

1）称取12 g LA和3 g EDA，分别溶于15 mL DMSO中，充分溶解后将二者混合均匀，使所得混合液的浓度达到0.5 g/mL，75 ℃条件下冷凝回流2 h，待产物冷却至室温后，用氯仿沉析、溶剂过滤器过滤、40 ℃真空干燥2h，得到较纯的L-NH₂；

2）按一定质量比称取L-NH₂和0.2g AAC，分别溶于3.33 mL DMSO中，再将二者混合，接着加入由4.2 mg EDC·HCl和4.2mg NHS配制成的混合液，使EDC·HCl和NHS在所得反应液中的总浓度为0.1 wt%，然后在室温下磁力搅拌20 h，产物用氯仿沉析并冲洗，40 ℃真空干燥，得到较纯的GAC。

如图3所示，L-NH₂和AAC质量比为4:1时，GAC的产量最高。

实施例2

1）量取600 μL微球粒径为800nm、浓度为20wt%的聚苯乙烯乳液和300 μL正丙醇，混合超声20 min，使聚苯乙烯微球分子分散均匀，然后采用针尖注射法将该混合液用1mL注射器取300 μL垂直匀速地注射在去离子水表面，使其在去离子水表面形成一层光亮的单层聚苯乙烯光子晶体（PC），再将水面上制得的PC转移到载玻片上，将载玻片垂直放置，在空气中风干，使得聚苯乙烯二维光子晶体呈有规则排列；

2）称取12 g AAM和0.4 g MBAA，加去离子水溶解并定容至50 mL，得A液，并储存在冰箱中备用；然后取1 mL A液，按A液中AAM与GAC的质量比为5:1、5:2、5:3、5:4、5:5，分别加入实施例1中L-NH₂和AAC按质量比4:1制备的GAC，GAC的加入质量依次为0.048 g、0.096 g、0.144g、0.192g、0.24g，磁力搅拌1h后，在每一组烧杯中都依次加入1 mL H₂O、20 μL 10wt%APS、2 μL TEMED，边加边搅拌并在所有试剂加完后继续搅拌5 min，停止搅拌，观察成胶状态，水凝胶处于成胶临界点时，记录成胶时间，结果见图4。

如图4所示，A液中AAM与GAC的相对含量会影响水凝胶的成胶速度，选择5:1作为优化参数，保证二维光子晶体表面水凝胶30 min内能完全成胶。

实施例3

糖基化二维光子晶体水凝胶的具体制备步骤如下：

1）半乳糖端氨基中间体L-NH₂的合成：称取12 g LA和3 g EDA，分别溶于15 mLDMSO中，充分溶解后将二者混合均匀，使所得混合液的浓度达到0.5 g/mL，75 ℃条件下冷凝回流2 h，待产物冷却至室温后，用氯仿沉析、溶剂过滤器过滤、40 ℃真空干燥2h，得到较纯的L-NH₂；

2）半乳糖功能化单体GAC的合成：称取步骤（1）合成的L-NH₂0.8 g和0.2 g AAC，分别溶于3.33 mL DMSO中，再将二者混合，使所得混合液的浓度为0.15 g/mL，接着加入由4.2mg EDC·HCl和4.2mg NHS配制成混合液，使EDC·HCl和NHS在最终反应液中的总浓度为0.1wt%，然后在室温下磁力搅拌20 h，产物用氯仿沉析并冲洗，40 ℃真空干燥，得到较纯的GAC；

3）二维光子晶体的组装：量取600 μL微球粒径为800nm、浓度为20wt%的聚苯乙烯乳液和300 μL正丙醇，混合超声20 min，使聚苯乙烯微球分子分散均匀，然后采用针尖注射法将该混合液用1mL注射器取300 μL垂直匀速地注射在去离子水表面，使其在去离子水表面形成一层光亮的单层聚苯乙烯光子晶体（PC），再将水面上制得的PC转移到载玻片上，将载玻片垂直放置，在空气中风干，使得聚苯乙烯二维光子晶体呈有规则排列；

4）糖基化光子晶体水凝胶的制备：称取12 g AAM和0.4 g MBAA，加去离子水溶解并定容至50 mL，得A液，并储存在冰箱中备用；然后取1 mL A液，按A液中AAM与GAC的质量比为5:1加入0.048 g GAC，搅拌1h，再依次加入1 mL去离子水，20 μL 10wt%的APS和2 μLTEMED，边加边搅拌至水凝胶成半胶状时，用1mL注射器取0.8 mL水凝胶注射到PC载玻片上，盖上盖玻片，于水平桌面静置，待水凝胶完全成胶后取下盖玻片，用去离子水冲洗水凝胶表面，得到糖基化光子晶体水凝胶。

实施例4

1）将实施例3制备的糖基化光子晶体水凝胶置于水中溶胀1.5 h，然后取出，用滤纸吸去表面游离水并保持水凝胶呈溶胀状态时，将其固定于桌子上方（水凝胶与桌面的垂直距离为10cm）并用激光笔照射光子晶体水凝胶（采用绿色激光笔，其波长为532 nm，功率为1000 mW，光源与水凝胶的垂直距离为20cm），记录在桌面上显示出的德拜环直径d₀；

2）取一系列10 μL浓度分别为0 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、10ng/mL、100 ng/mL的H1N1流感病毒试样，滴在糖基化光子晶体水凝胶上并标记区域，静置2h后水洗去标记区域内的残留物，然后沥干表面游离水并在保持水凝胶呈溶胀状态时分别测定桌面上显示出的德拜环的直径d₁、d₂、···；

3）利用流感病毒浓度的对数与德拜环直径的差值△d（d₁-d₀、d₂-d₀、···）进行线性拟合，获得反映两者线性关系的回归方程，结果见图5。

如图5所示，德拜环直径的变化值与流感病毒浓度的对数呈良好的线性关系，其线性方程为：△d =5.1+lgC_病毒，相关系数r=0.9901，线性范围为0.01~100 ng/mL。

实施例5

1）将实施例3制备的糖基化光子晶体水凝胶置于水中溶胀1.5 h，然后取出，用滤纸吸去表面游离水并保持水凝胶呈溶胀状态时，将其固定于桌子上方（水凝胶与桌面的垂直距离为10cm）并用激光笔照射光子晶体水凝胶（采用绿色激光笔，其波长为532 nm，功率为1000 mW，光源与水凝胶的垂直距离为20cm），记录在桌面上显示出的德拜环直径d₀’；

2）于稀释20倍的胎牛血清溶液中，添加一定浓度的H1N1流感病毒，使流感病毒终浓度为1.0 ng/mL，将其滴在糖基化光子晶体水凝胶上并标记区域，另滴加不含流感病毒的胎牛血清溶液作为对照，静置2h后水洗去标记区域内的残留物，然后沥干表面游离水并在保持水凝胶呈溶胀状态时测定桌面上显示出的德拜环的直径d₁’、d₂’；

3）分别计算血清样品与血清加标样品德拜环直径的差值△d（d₁’-d₀、d₂’-d₀），再依据实施例4所得线性方程计算病毒浓度，并计算回收率，结果如表1所示。

表1 血清样品的测定及添加回收实验

由表1可见，添加回收率为125.9%，证明本方法可用于血清等复杂生物基底中流感病毒的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种糖基化光子晶体水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）乳糖酸末端氨基化处理：按一定质量比将乳糖酸和乙二胺分别溶于二甲亚砜中，充分溶解后将两者混匀，并将所得混合液于75 ℃冷凝回流2 h，待产物冷却至室温后，倒入氯仿中沉析，过滤，再低温真空干燥2 h，得到半乳糖端氨基中间体L-NH₂，冷藏，备用；

2）半乳糖功能化单体GAC的合成：按一定质量比将L-NH₂和丙烯酸分别溶于二甲亚砜中，充分溶解后将两者混匀，接着加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚铵盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的混合液，室温下磁力搅拌20 h，然后倒入氯仿中沉析，沉析后所得产物用少量氯仿多次冲洗后低温真空干燥，得到半乳糖功能化单体GAC；

3）二维光子晶体的组装：按体积比1-3:1量取聚苯乙烯乳液和正丙醇，将二者超声混合，然后采用针尖注射法将该混合液垂直匀速地注射在去离子水表面，使其在水表面形成一层光亮的单层聚苯乙烯光子晶体，再将水面上制得的聚苯乙烯光子晶体转移到载玻片上，将载玻片垂直放置，室温风干，使得聚苯乙烯二维光子晶体呈规则排列；

4）糖基化光子晶体水凝胶的制备：称取12g丙烯酰胺和0.4 g甲叉双丙烯酰胺，加去离子水溶解并定容至50 mL，得A液，储存在冰箱中备用；取A液1 mL，加GAC搅拌1h，再依次加入1 mL去离子水、20 μL10wt%的过硫酸铵溶液和2 μL 四甲基乙二胺，边加边搅拌至混合液聚合呈半胶态时，将其涂到步骤3）所得载有光子晶体的载玻片上，盖上盖玻片使其均匀平铺，静置，待水凝胶完全成胶后取下盖玻片，水洗，得到所述糖基化光子晶体水凝胶；

所述半乳糖功能化单体GAC的结构为：

。

2.根据权利要求1所述的糖基化光子晶体水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤1）中所用乳糖酸和乙二胺的质量比为2-6:1，混合液的质量浓度为0.5-2 g/mL。

3.根据权利要求1所述的糖基化光子晶体水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤2）中所用L-NH₂和丙烯酸的质量比为2-6:1；

加入混合液后的反应液中，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚铵盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的总浓度为0.1wt%，其中1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚铵盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为1:1。

4.根据权利要求1所述的糖基化光子晶体水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤3）中所用聚苯乙烯乳液的质量浓度为10-20%，其中聚苯乙烯微球的粒径为700-900 nm。

5.根据权利要求1所述的糖基化光子晶体水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤4）中加入的GAC与所用A液中丙烯酰胺的质量比为1:1-6，混合液搅拌的时间为1-5 min。

6.如权利要求1-5任一所述制备方法制得的糖基化光子晶体水凝胶。

7.一种如权利要求6所述的糖基化光子晶体水凝胶在流感病毒检测中的应用，其特征在于：具体应用方法为：

a）将所述糖基化光子晶体水凝胶置于水中溶胀1.5 h，然后取出，用滤纸吸去表面游离水并保持水凝胶呈溶胀状态，然后用激光笔照射位于桌子上方的糖基化光子晶体水凝胶，并记录在桌面上显示出的德拜环的直径；

b）取10 μL系列浓度的流感病毒样液分别滴在糖基化光子晶体水凝胶上并标记区域，静置2h后水洗去标记区域内的残留物，然后沥干表面游离水并保持水凝胶呈溶胀状态，再次测定桌面上显示出的德拜环的直径；

8.根据权利要求7所述的糖基化光子晶体水凝胶在流感病毒检测中的应用，其特征在于：所述流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1中的任意一种。

9.根据权利要求7所述的糖基化光子晶体水凝胶在流感病毒检测中的应用，其特征在于：所用激光笔为绿色激光笔，其波长为532 nm，功率为1000 mW；照射时，光源与水凝胶的垂直距离为20cm，水凝胶与桌面的垂直距离为10cm；所述流感病毒样液的浓度为0.01~100ng/mL。