CN105463025A - 一种生物活化量子点纳米载体用于rna干扰的技术方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物活化量子点纳米载体用于RNA干扰的技术方法。鉴于量子点具有可调大小的粒径、能够通过细胞膜、生物相容性好、细胞毒性小及优异的荧光特性，本发明首次成功的将量子点和巯基修饰的siRNA偶联。其方法是先制得氨基水溶性量子点，再通过竞争替代法将生物活化的量子点加入到巯基修饰的siRNA中。结果发现活化后的量子点能够有效地结合并输送siRNA进入骨髓间充质干细胞中发挥干扰作用。该方法简单易行，鉴于生物活化量子点既能作为纳米载体与外源基因结合，又能作为纳米荧光标记物跟踪记录基因在转染过程中的位置，转染效率高，细胞毒性低，在一般实验室均可完成，可广泛运用于体内、体外转染。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物活化量子点纳米载体用于RNA（核糖核酸）干扰的技术方法，属于分子生物学、纳米材料学领域。
背景技术
在基因转染和基因治疗研究中，增加基因传递的效率、实现对基因的实时追踪、开发安全有效的基因转染载体已成为基因技术研究的一项重要工作。目前为止，脂质体转染效率较低，病毒载体的基因转运能力虽然强，但其在临床应用上存在安全性问题，且病毒载体携带基因的大小受限制，不易大量生产。最近，以非病毒载体为基础的纳米材料——量子点(quantumdot，QDs)获得了极大的关注。研究表明，纳米粒子不仅可以增加目的基因进入细胞的量，同时能够保护siRNA抵抗核酸酶的破坏，并能有效解决目前基因治疗载体在安全性、免疫原性、低转染效率和示踪性上的诸多缺陷，从而成为基因转染和基因治疗领域中的重点。
量子点是一种由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒，粒径一般在2-10nm范围内，能够自由的穿过细胞膜和血脑屏障。量子点作为一种新型的荧光半导体纳米晶体，与传统的荧光探针相比，它的发射光谱可以通过改变量子点的大小来控制。量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱，用同一激发光源就可实现对不同粒径的量子点进行同步检测。此外，量子点具有良好的光化学稳定性，可以耐受更强的激发光和更长的光发射周期。最重要的是量子点生物相容性好，容易被多种配体修饰，水溶性量子点能够以静电结合或共价结合的方式与蛋白质、多肽和核酸等生物大分子偶联，进而实现基因转染在细胞或动物体内的荧光示踪研究。量子点上述优势使其在基因转染、药物输送等方面的应用具有很大的潜力。基于生物活化的氨基水溶性量子点构建新型基因转染载体，有望在实现有效基因转染的同时，对转染过程进行长期实时、可视化追踪，并能通过研究所转染基因引起的生物学现象揭示转染基因的特定生物学机制。
目前尚无报道氨基水溶性量子点具有转染作用，但种种迹象表明量子点具有转染和示踪功能。有研究表明，氨基水溶性量子点能够与抗体偶联，在体外实验中发挥示踪作用。我们在前期研究的基础上，将生物活化的氨基水溶性量子点与巯基修饰后的siRNA偶联，探索量子点在基因转染中的优势、考察量子点标记基因的方法。本实验首次将氨基修饰的量子点用于siRNA转基因研究，将偶联后的纳米复合物载体QD-siRNA转入骨髓间充质干细胞中，增加了QD-siRNA复合物进入细胞的数量，提高了转染效率。通过激光共聚焦显微镜发现绿色荧光信号标记的siRNA已经进入骨髓间充质干细胞内部，PCR、WB检测结果表明Sox9表达受到明显抑制。研究结果表明，量子点作为基因载体，用现代物理显像方法和分子生物学技术，能实时定位基因在细胞内的转运，在揭示量子点载体在转基因的生物物理过程及其机理上显示出了巨大的应用前景。我们相信，随着对量子点的进一步深入研究，其在生命科学领域，尤其是基因转染方面，将具有更加广阔的应用前景，也将为生命科学的发展做出更多的贡献。
发明内容
为了进一步拓展量子点(Quantumdot，QD)在分子生物学方面的应用，本发明提供了一种基于生物活化的氨基水溶性量子点的纳米载体转染siRNA的技术方法，该方法将氨基水溶性量子点与巯基修饰的siRNA偶联，用于体内、体外的基因转染。
为完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种生物活化量子点纳米载体用于RNA干扰的技术方法，包括：
（1）量子点采用硼酸盐缓冲液稀释，加入10ul活化剂，室温搅拌反应1小时；将活化好的量子点离心除团聚，加入脱盐柱中过柱，用缓冲液进行洗脱，收集有荧光部分；计算待标记巯基siRNA用量，加入到纯化的活性量子点中，室温搅拌反应20分钟；反应结束后，用0.22μm滤膜或离心除团聚；超滤管进行超滤浓缩1次，浓缩后进行分离纯化；终产物取出后12000rpm离心3min除团聚，2-8℃保存，不得冷冻；凝胶电泳判断连接效果；
（2）分别将量子点、活化剂、siRNA和量子点、siRNA按照1:10，1:5，1:1，5:1，10:1的比例偶联，通过凝胶电泳判断偶联效果；
（3）通过细胞增殖实验比较量子点载体与脂质体、慢病毒载体的细胞毒性大小；
（4）通过透射电镜和共聚焦显微镜观察QD-siSox9复合物进入细胞的过程；
（5）通过流式细胞术检测氨基水溶性量子点转染的最佳浓度和时间；
（6）分别在基因和蛋白水平验证干扰后骨髓间充质干细胞中Sox9的表达情况。
步骤（1）所述的量子点至少为CdTe、CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnS之一；所述的活化剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)；缓冲液为2-(N-吗啉代)乙磺酸；siRNA为巯基修饰的siRNA；活化时最佳摩尔比例为1/250，量子点活化反应时间为1小时。最佳偶联反应时间为20分钟。
步骤（2）随着量子点和siRNA复合比的增加，siRNA条带亮度逐渐降低，直至没有自由siRNA的迁移发生。量子点与siRNA的最佳复合比为5:1，复合比大于5:1后siRNA将被量子点完全结合，复合物中没有siRNA向阳极泳动，且通过活化剂SMCC偶联效果优于直接偶联。
步骤（3）中氨基水溶性量子点浓度在20pmol/L到80pmol/L范围内时，细胞活力一直维持在95%左右，当氨基水溶性量子点浓度大于200pmol/L时细胞的活力为63%。慢病毒载体则在浓度大于140pmol/L时开始表现出对骨髓间充质干细胞活力的显著影响，而脂质体在浓度200pmol/L时细胞的活力仅剩54%左右。证明在20pmol/L-80pmol/L的范围内量子点的细胞毒性小于脂质体和慢病毒载体。
步骤（4）中转染后3小时，红色量子点和绿色荧光标记的siRNA聚集在细胞膜周围。转染后6小时，绿色荧光标记的siRNA和红色的量子点主要分布在黄色标记的细胞器中，表明纳米颗粒仍然在内涵体或早期溶酶体中。12小时后，绿色荧光的siRNA和红色的量子点不在分布于黄色荧光的细胞器中，并且部分绿色荧光和红色荧光分离。说明量子点能够有效的将siRNA运输到细胞内并从内涵体中逃逸，使siRNA在胞质中发挥基因沉默的作用。
步骤（5）用流式细胞术检测了转染后siSox9阳性的骨髓间充质干细胞数量，确定了最佳转染时间为12小时；最佳转染浓度为40pmol/L。量子点载体的转染效率（81.6%）高于脂质体（76.4%），低于慢病毒（87.9%）。
步骤（6）中量子点载体转染的Sox9基因水平在转染后第二天降至最低（37.3%），然后逐渐上升，转染后21天达到90.6%。而用慢病毒转染的Sox9基因水平基本稳定在39%。WB结果显示量子点载体转染的Sox9蛋白水平在转染后第三天最低（24.6%），转染后21天达到78.2%，说明量子点转染的siSox9在细胞内发挥了干扰作用，且QD-siSox9干扰效果优于脂质体。
本发明的优势
本发明是在量子点标记巯基修饰的抗体的启发下，首次成功的将量子点和巯基修饰的siRNA偶联。其方法是先制得氨基水溶性量子点，再通过竞争替代法将生物活化的量子点加入到巯基修饰的siRNA中。该方法简单易行，转染效率高，细胞毒性低，在一般实验室均可完成，可广泛运用于体内、体外转染。量子点合成所需要的仪器设备成本也比较低，可以大大节约基因载体研发的时间和费用。量子点作为一种新型的荧光半导体纳米晶体，与传统的载体相比，它的发射光谱可以通过改变量子点的尺寸大小来控制，具有宽的激发谱和窄的发射谱，使用同一激发光源就可实现对不同粒径的量子点进行同步检测。量子点荧光强度更强、荧光持续时间长，更有利于长时间动态示踪观察。鉴于量子点既能作为纳米载体与外源基因结合，又能作为纳米荧光标记物跟踪记录基因在转染过程中的位置，所以在基因转染具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为偶联前后量子点的透射电镜照片。（a.量子点；b.量子点-siRNA）
图2为量子点和siRNA复合物在不同复合比的情况下的凝胶电泳照片。
图3为偶联后量子点细胞毒性研究。
图4为量子点-siRNA复合物进入细胞的透射电镜和激光共聚焦照片（a.细胞伸出丝状伪足；b.丝状伪足包裹量子点-siRNA；c.量子点-siRNA位于内涵体中；d.内涵体破裂释放量子点和siRNA；e.转染后3小时，红色量子点和绿色siRNA围绕在细胞周围；f.转染后6小时，红色量子点和绿色siRNA进入细胞内，并且位于黄色标记的溶酶体中；g.转染后12小时，红色量子点和绿色siRNA从溶酶体中释放出来，进入细胞质中）。
图5为流式细胞仪检测最佳转染时间、浓度，验证转染效率（a.量子点在不同转染时间下的转染效率；b.量子点在不同转染浓度下的转染效率；c.比较量子点与脂质体、慢病毒的转染效率）。
图6为转染后不同时间段骨髓间充质干细胞中Sox9基因、蛋白表达水平（A.量子点转染后Sox9基因表达变化；B.量子点转染后Sox9蛋白表达变化）。
具体实施方式
本发明采用以下技术方案：
一、量子点的生物活化
采用硼酸盐缓冲液将量子点浓度稀释至4μM，按照1/250的摩尔比例加入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液进行生物活化，室温搅拌反应1小时。
二、量子点与siRNA的偶联
将活化剂活化后的量子点离心除团聚，然后加入到脱盐柱中用缓冲液进行洗脱，收集有荧光部分，洗脱后的量子点与siRNA偶联20分钟。超滤管进行超滤浓缩1次，浓缩后进行分离纯化。反应结束后，凝胶电泳判断偶联效果。
三、生物相容性评价
将量子点稀释成不同浓度梯度后加入细胞中培养，根据细胞活性选取最佳工作浓度。
四、QD-siSox9复合物进入细胞的过程
转染后3小时、6小时、12小时观察QD-siSox9复合物位于细胞内的位置。
五、确定最佳转染浓度与最佳转染时间，验证转染效率
采用流式细胞仪检测不同转染时间、不同转染浓度下siSox9阳性的细胞数目，并比较量子点、脂质体、慢病毒的转染效率。
六、体外检测转染后Sox9的表达
干扰1、2、3、7、14、21天后，通过PCR和WB检测Sox9的在体外的表达情况。
实施例：
(1)采用硼酸盐缓冲液将量子点(Quantumdot，QD)浓度稀释至4μM，加入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液进行活化，室温搅拌反应1小时。将活化的量子点离心除团聚，加入脱盐柱中过柱，用2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液进行洗脱，收集有荧光的部分。计算所需的待标记巯基siRNA用量，加入到上述已经纯化的活性量子点中，室温搅拌反应20分钟。反应结束，用0.22μm滤膜或离心除团聚。超滤管进行超滤浓缩1次，浓缩后进行分离纯化。终产物取出后12000rpm离心3分钟除团聚，2-8℃保存，不得冷冻。用透射电镜观察偶联后的QD-siRNA纳米复合物表征，凝胶电泳判断连接效果。量子点-siRNA粒径由之前的10.8nm增加到51.6nm（图1），当siRNA与量子点比例为1/5时，偶联效果最佳（图2）。
(2)将骨髓间充质干细胞以5000个/孔的密度种于96孔细胞培养板中，培养过夜。将量子点纳米颗粒溶液用完全培养基稀释到不同的浓度，并与细胞共同培养。对照未加量子点而直接与完全培养基共同培养。24小时后，于每孔中加入25ul噻唑蓝溶液，并在空白孔中加入25ul磷酸盐缓冲液，继续培养2小时；用Bio-Rad酶标仪在570nm下测定孔中溶液的吸光度。在20pmol/L-80pmol/L的范围内量子点的细胞毒性小于脂质体和慢病毒载体（图3）。
(3)转染3小时、6小时、12小时后的细胞用4%的多聚甲醛固定细胞，取出盖玻片并用磷酸盐缓冲液清洗三遍。样品采用透射电镜和激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。透射电镜发现细胞伸出丝状伪足（图4a），丝状伪足逐渐包裹量子点-siRNA（图4b），并且细胞膜内陷形成内涵体，量子点-siRNA位于内涵体中（图4c），内涵体破裂后释放量子点和siRNA（图4d）。激光共聚焦显微镜发现转染后3小时，红色量子点和绿色荧光标记的siRNA聚集在细胞膜周围(图4e）。转染后6小时，绿色荧光标记的siRNA和红色的量子点主要分布在黄色标记的细胞器中，表明纳米颗粒仍然在内涵体或早期溶酶体中（图4f）。12小时后，绿色荧光的siRNA和红色的量子点不在分布于黄色荧光的细胞器中，并且部分绿色荧光和红色荧光分离（图4g）。说明量子点能够有效的将siRNA运输到细胞内并从内涵体中逃逸，使siRNA在胞质中发挥基因沉默的作用。
(4)流式细胞术检测量子点纳米颗粒输送siSox9进入细胞的能力，将骨髓间充质干细胞接种到24孔板中，每孔中接种7×104个细胞，然后在37℃培养箱中孵育过夜；将QD-siSox9复合物加入到接种有骨髓间充质干细胞的24孔板中，在37℃培养箱中培养6小时、12小时、24小时后，消化收集细胞，并用流式细胞仪检测细胞内的荧光信号，发现量子点转染12小时效率最高（图5a）。将20、40、80pmol/L的QD-siSox9复合物加入到接种有骨髓间充质干细胞的24孔板中在37℃培养箱中培养一段时间，消化收集细胞，并用流式细胞仪检测细胞内的荧光信号，发现40pmol/L的量子点转染效率最高（图5b）。比较不同载体的转染效率，发现慢病毒转染效率最高，量子点其次，脂质体最低（图5c）。
(5)将40pmol/L量子点-siSox9复合物加入骨髓间充质干细胞中，分别于转染后不同时间段检测Sox9基因和蛋白水平。量子点载体转染的Sox9基因水平在转染后第二天降至最低（42%），然后逐渐上升，转染后21天达到90.6%，而用慢病毒转染的Sox9基因水平基本稳定在39.3%（图6A）。WB结果显示量子点载体转染的Sox9蛋白水平在转染后第三天最低（23.4%），转染后21天达到78.2%（图6B），说明量子点转染的siSox9在细胞内发挥了干扰作用，且QD-siSox9干扰效果优于脂质体。
Claims (2)
1.一种生物活化量子点纳米载体用于RNA干扰的技术方法，包括：
（1）量子点采用硼酸盐缓冲液稀释，加入10ul活化剂，室温搅拌反应1小时；将活化好的量子点离心除团聚，加入脱盐柱中过柱，用缓冲液进行洗脱，收集有荧光部分；计算待标记巯基siRNA用量，加入到纯化的活性量子点中，室温搅拌反应20分钟；反应结束后，用0.22μm滤膜或离心除团聚；超滤管进行超滤浓缩1次，浓缩后进行分离纯化；终产物取出后12000rpm离心3min除团聚，2-8℃保存，不得冷冻；凝胶电泳判断连接效果；
（2）分别将量子点、活化剂、siRNA和量子点、siRNA按照1:10，1:5，1:1，5:1，10:1的比例偶联，通过凝胶电泳判断偶联效果；
（3）通过细胞增殖实验比较量子点载体与脂质体、慢病毒载体的细胞毒性大小；
（4）通过透射电镜和共聚焦显微镜观察QD-siSox9复合物进入细胞的过程；
（5）通过流式细胞术检测氨基水溶性量子点转染的最佳浓度和时间；
（6）分别在基因和蛋白水平验证干扰后骨髓间充质干细胞中Sox9的表达情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤（1）所述的量子点至少为CdTe、CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnS之一；所述的活化剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；缓冲液为2-(N-吗啉代)乙磺酸；siRNA为巯基修饰的siRNA；活化时最佳摩尔比例为1/250，量子点活化反应时间为1小时；最佳偶联反应时间为20分钟；
步骤（2）随着量子点和siRNA复合比的增加，siRNA条带亮度逐渐降低，直至没有自由siRNA的迁移发生；量子点与siRNA的最佳复合比为5:1，复合比大于5:1后siRNA将被量子点完全结合，复合物中没有siRNA向阳极泳动，且通过活化剂SMCC偶联效果优于直接偶联；
步骤（3）中氨基水溶性量子点浓度在20pmol/L到80pmol/L范围内时，细胞活力一直维持在95%左右，当氨基水溶性量子点浓度大于200pmol/L时细胞的活力为63%；慢病毒载体则在浓度大于140pmol/L时开始表现出对骨髓间充质干细胞活力的显著影响，而脂质体在浓度200pmol/L时细胞的活力仅剩54%左右；证明在20pmol/L-80pmol/L的范围内量子点的细胞毒性小于脂质体和慢病毒载体；
步骤（4）中转染后3小时，红色量子点和绿色荧光标记的siRNA聚集在细胞膜周围；转染后6小时，绿色荧光标记的siRNA和红色的量子点主要分布在黄色标记的细胞器中，表明纳米颗粒仍然在内涵体或早期溶酶体中；12小时后，绿色荧光的siRNA和红色的量子点不在分布于黄色荧光的细胞器中，并且部分绿色荧光和红色荧光分离；说明量子点能够有效的将siRNA运输到细胞内并从内涵体中逃逸，使siRNA在胞质中发挥基因沉默的作用；
步骤（5）用流式细胞术检测了转染后siSox9阳性的骨髓间充质干细胞数量，确定了最佳转染时间为12小时；最佳转染浓度为40pmol/L；量子点载体的转染效率（81.6%）高于脂质体（76.4%），低于慢病毒（87.9%）；
步骤（6）中量子点载体转染的Sox9基因水平在转染后第二天降至最低（37.3%），然后逐渐上升，转染后21天达到90.6%；而用慢病毒转染的Sox9基因水平基本稳定在39%；WB结果显示量子点载体转染的Sox9蛋白水平在转染后第三天最低（24.6%），转染后21天达到78.2%，说明量子点转染的siSox9在细胞内发挥了干扰作用，且QD-siSox9干扰效果优于脂质体。
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