CN101024090B - 一种基因传递复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的复合物，本发明还提供了该复合物的制备方法和使用方法。本发明所述的由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的基因传递复合物，制备方法和使用方法操作简单，能显著提高基因传递的效率，并能降低聚乙烯亚胺对细胞的毒性，为聚乙烯亚胺的广泛使用提供了可靠的技术保证。

Description

一种基因传递复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的基因传递复合物及其制备方法。

背景技术

基因治疗是向靶细胞引入正常且有功能的基因，以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的。人类基因组草图的绘制完成及深入研究为基因治疗打下了坚实的基础，基因治疗已成为世界上最活跃的研究领域，基因治疗药物将对医药工业产生深远的影响。自从1990年Anderson等首次成功的进行基因治疗临床试验以来，迄今全球已完成了500多例基因治疗临床试验，但其结果尚不尽人意，因此需要开发无毒、高效的基因治疗载体。目前，介导基因转移的载体一般分为病毒载体和非病毒载体两类。虽然80％的试验仍采用转染率较高的病毒载体，但其存在着诸如非导向性、有限的携带能力、安全性等问题。于是人们逐渐把目光投向非病毒载体的研究上。在众多非病毒载体中，聚乙烯亚胺(PEI)因其有效的基因转移功能而备受人们的青睐。但是它突出的问题是毒性较大。因此，需要在PEI上偶联一个靶向配体，在提高转染效率的同时能降低PEI的毒性。

细菌纳米磁小体(BMPs)的主要组成是Fe₃O₄晶体，外面以脂膜包被，直径在25～45nm之间，这一特性使它不易聚集成团，是一种理想的生物纳米材料。到目前为止，BMPs因其操作简单、靶向性强等优点而被广泛应用。

因此，把BMPs和PEI偶联起来进行基因传递将会是解决PEI应用瓶颈的一个突破口，本发明就是基于以上思路。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的基因传递复合物，本发明的又一目的是提供该基因传递复合物的制备方法及使用方法。

(二)技术方案

本发明的原理是：常规利用聚乙烯亚胺(PEI)进行转染时，虽然能够有效的使DNA进入细胞，但是PEI的高毒性使得其应用受限。而细菌纳米磁小体(BMPs)是纳米磁性材料，它的表面带负电荷，在帮助提高PEI传递效率的同时，也具有靶向作用。不仅如此，BMPs表面的负电荷还能中和PEI中的部分阳离子，从而降低PEI对细胞的毒性。

在本发明中，所述的基因传递复合物是由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的，其中聚乙烯亚胺和目的DNA的N/P比为7-9(N/P比在本发明的意义上是指PEI中质子化的N元素与目的DNA中P元素的比值)，细菌纳米磁小体与目的DNA的质量比为0.3-1.5，目的DNA的大小为4-8kb。聚乙烯亚胺和目的DNA之间是共价连接，因为得到的PEI/目的DNA化合物带正电荷，细菌纳米磁小体带负电荷，所以PEI/目的DNA化合物与细菌纳米磁小体之间依靠静电吸引而形成BMPs-PEI/目的DNA复合物。

本发明所述的基因传递复合物的制备方法，它包括以下步骤：

(1)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理(采用γ射线照射对细菌纳米磁小体进行灭菌处理，照射剂量为15kGy)，测定细菌纳米磁小体在660nm的吸光值(具体操作参见Nakamura，N.，Matsunaga，T.(1993)Highly sensitive detection of allergen using bacterial magneticparticles：Biosensors.Anal Chem Acta 281，585-589.)，并根据1OD₆₆₀＝172μg细菌纳米磁小体对其进行定量；

(2)将聚乙烯亚胺的浓度调节至1mg/ml(pH＝7.2)；

(3)将目的DNA定量(具体方法参见《分子克隆》第二版，科学出版社出版)；

(4)将聚乙烯亚胺和目的DNA按照N/P比为7-9的比例在150mM NaCl溶液中混合；再将细菌纳米磁小体加入混合物中，加入的细菌纳米磁小体与目的DNA的质量比为0.3-1.5；反应20-30分钟，制得BMPs-PEI/目的DNA复合物。

在本发明中，BMPs、PEI和目的DNA三者之间的比例要在一定的范围内才能保证较高的转染效率：其中PEI与DNA的N/P比为7-9，若N/P的值过大(≥10)或过小(≤6)，都会降低体外转染的效率；而BMPs与目的DNA的质量比在0.3-1.5为宜，当BMPs与目的DNA的质量比超过1.5时，体外转染效率会下降。

在本发明中，所述的基因传递复合物的使用方法为：

当用该复合物进行体外转染时，需要在细胞的培养皿下放置磁铁10-30分钟，所用磁铁的磁场强度是200-300mT；

当用该复合物进行体内的基因传递时，在注射复合物之前需要用超声波击打使该复合物分散，所用超声波功率是40-50W(如果超声功率超过50w，会破坏目的DNA和BMPs的质量)，且在该复合物被注入到体内后，需要在被注射部位固定磁铁10-30分钟，所用磁铁的磁场强度是200-300mT。

(三)有益效果

本发明所述的由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的基因传递复合物，制备方法和使用方法操作简单，能显著提高基因传递的效率，并能降低PEI对细胞的毒性，为PEI的广泛使用提供了可靠的技术保证。

附图说明

图1是BMPs-PEI/EGFP-N2质粒复合物的电镜照片；

图2是BMPs-PEI/EGFP-N2质粒复合物保护DNA不受DNA酶作用的电泳图；其中，泳道1-5表示裸DNA被DNA酶酶切，泳道6-10表示BMPs-PEI/DNA复合物不受DNA酶的作用；

图3是BMPs-PEI/DNA复合物在体外转染时，各因素对转染效率影响的柱状图；其中，图3(a)表示N/P比与转染效率的关系，图3(b)表示BMPs质量多少与转染效率的关系，图3(c)表示随着DNA量的增加，BMPs-PEI复合物与单独PEI进行体外转染的效率比较，图中□表示PEI-polyfection，■表示BMPs/PEI-polyfection，图3(d)表示磁场对转染效率的影响；

图4是BMPs-PEI/DNA复合物在体外的细胞毒性检测结果图；

图5是BMPs-PEI/DNA复合物在体内进行基因传递情况的照片：图5(a)是体内进行基因传递的照片，其中A代表质粒DNA组，B代表BMPs-PEI/DNA复合物组，C代表PEI/DNA组，D代表对照组；图5(b)是注射BMPs-PEI/DNA复合物部位的组织石蜡切片照片。

实施例1BMPs-PEI/目的DNA复合物的制备及体外基因转染实验

(1)BMPs-PEI/目的DNA复合物的制备：目的DNA选取表达绿色荧光蛋白的EGFP-N2质粒(购自Clontech公司，大小为4.7kb)。对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并将BMPs，PEI和DNA三者准确定量(具体操作方法参见说明书技术方案的相应部分)。

将PEI和EGFP-N2质粒按照N/P＝7的比例在150mM NaCl溶液中混合，再将BMPs加入混合物中，加入的BMPs与EGFP-N2质粒的质量比为0.3，室温下反应20分钟，制得BMPs-PEI/DNA复合物。

然后用电镜检测BMPs-PEI/DNA复合物的状态，并用电泳法检测BMPs-PEI复合物连接DNA的效率。附图1是BMPs-PEI/DNA复合物的电镜照片，可以看出该复合物的大小在200nm以内；附图2表示的是BMPs-PEI/DNA复合物具有保护目的DNA的作用，使目的DNA免受DNA酶酶切的作用，从而为DNA疫苗顺利进入体内打下基础。

(2)将BMPs-PEI/DNA复合物加至培养好的细胞BHK-21(购自中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室)中，与细胞BHK-21共同孵育20分钟，在此期间，在细胞培养板下放置一块永磁铁(磁场强度＝200mT)。

(3)当细胞BHK-21在培养箱(型号为Thermo Forma HEPACLASS 100，Thermo Forma公司生产)中继续培养48小时后，用流式细胞仪(FACS Calibur System，Becton-Dickinson)检测转染效率。

附图3表示了各种因素对BMPs-PEI/DNA复合物体外转染效率的影响情况：其中图3(a)表示不同的N/P比对转染效率的影响，从图中可以看出随着N/P比值的增高并不能增加转染效率；图3(b)表示在DNA量一定的情况下BMPs对转染效率的影响，从图中可以看出BMPs的量跟DNA量的比值在0.3-1.5之间为宜；图3(c)表示随着DNA量增加的情况下，BMPs-PEI复合物与单独PEI进行体外转染的效率比较，从图中可以看出BMPs的存在能明显增加体外基因转染的效率；图3(d)表示磁场的作用能显著增加BMPs-PEI/DNA复合物体外转染效率。

(4)将BMPs-PEI/DNA复合物与BHK-21、CHO、Hela三种细胞系(三种细胞系均购自中国医学科学院肿瘤研究所中心实验室)共培养，用MTT法(具体操作参见Mosmann T.(1983)Rapid colorimetricassay for cellular growth and survival：application to proliferation andcytotoxicity assays.JImmunol Methods，65∶55-63.)检测该复合物的细胞毒性情况。从附图4可以看出：BMPs能降低PEI单独作用时的细胞毒性。

实施例2BMPs-PEI/目的DNA复合物的制备及体内基因传递实验

(1)BMPs-PEI/目的DNA复合物的制备：目的DNA选取表达β-半乳糖苷酶的pCMVβ质粒(购自Clontech公司，大小为7.2kb)，对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并将BMPs，PEI和DNA三者准确定量(具体操作方法参见说明书技术方案的相应部分)。

将PEI和EGFP-N2质粒按照N/P＝9的比例在150mM NaCl溶液中混合，再将BMPs加入混合物中，加入的BMPs与EGFP-N2质粒的质量比为1.5，室温下反应30分钟，制得BMPs-PEI/DNA复合物。

(2)给小鼠(品种为昆明白，购自协和医科大学动物实验中心)肌肉注射之前，BMPs-PEI/DNA复合物需用超声波轻微击打(所用超声波功率是45W)使该复合物更好的分散。

(3)给小鼠肌肉注射后，带BMPs组需在注射部位固定永磁铁20分钟(磁场强度＝300mT)。

(4)小鼠在注射七天后处死，用PBS溶液清洗，将组织放入试管，加入固定液A(固定液A的用量相当于组织样品的20倍体积；其配制方法为：4g多聚甲醛溶解于80mL去离子水，加入4mL 25％的戊二醛，10uL NP-40，0.01g脱氧胆酸钠，溶解混匀后定容至100mL，高压灭菌，4℃保存)，在4℃条件下固定36小时。然后配制染色液A(染色液A的配制方法为：10mg X-gal溶解于0.5mL DMSO和9.5mL染色底液混合液中，避光保存；其中染色底液的配制方法为：0.123g MgCl₂，0.984g K₃Fe(CN)₆，1.103g 3K₄Fe(CN)₆，溶解于800mL磷酸缓冲液中，定容至1L，分装，高压灭菌，4℃避光保存)，将固定好的组织用PBS溶液洗3遍后加入染色液A(染色液A的用量相当于组织样品的20倍体积)，避光、室温下染色过夜。洗除染色液A，用PBS溶液清洗组织3次，在试管内加入75％的乙醇，观察染色情况并照相记录。附图5(a)显示BMPs-PEI复合物能增强β-半乳糖苷酶质粒的体内表达。

(5)将注射部位的组织做石蜡切片分析并拍照，附图5(b)显示BMPs在肌肉细胞中的分布情况。

上述实验结果表明：用BMPs-PEI载体系统进行基因的体外转染和体内传递，可操作性强，效率高，毒性小。

Claims (2)

1.一种基因传递复合物，其特征在于它是由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的复合物，其中聚乙烯亚胺和目的DNA的N/P比为7-9，细菌纳米磁小体与目的DNA的质量比为0.3-1.5，目的DNA的大小为4-8kb，所述N/P比是聚乙烯亚胺中质子化的N元素与目的DNA中P元素的比值，所述细菌纳米磁小体是根据1OD₆₆₀＝172μg细菌纳米磁小体进行定量的，所述基因传递复合物的制备方法步骤如下：

(1)对纯净的细菌纳米磁小体进行灭菌处理，并定量；

(2)将聚乙烯亚胺的浓度调节至1mg/ml；

(3)将目的DNA定量；

(4)将聚乙烯亚胺和目的DNA按照N/P比为7-9的比例在150mM NaCl溶液中混合；再将细菌纳米磁小体加入混合物中，加入的细菌纳米磁小体与目的DNA的质量比为0.3-1.5；反应20-30分钟，制得细菌纳米磁小体-聚乙烯亚胺/目的DNA的复合物。

2.根据权利要求1所述的基因传递复合物的使用方法，其特征在于用该复合物进行体外转染时，需要在细胞的培养皿下放置磁铁10-30分钟，所用磁铁的磁场强度是200-300mT。

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