CN104593493A

CN104593493A - 一种检测羊巴贝斯虫的实时荧光定量pcr试剂盒

Info

Publication number: CN104593493A
Application number: CN201510011313.1A
Authority: CN
Inventors: 刘爱红; 关贵全; 刘军龙; 谢俊仁; 牛庆丽; 罗建勋; 殷宏
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2035-01-09
Also published as: CN104593493B

Abstract

本发明公开一种用于检测羊巴贝斯虫的引物对，和包括有该引物对的检测试剂盒。本发明的引物对核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。本发明的引物能特异性的检测到感染羊的巴贝斯虫，且灵敏度较高，检测结果良好，可广泛适用于绵羊、山羊和传播媒介蜱体内羊巴贝斯虫的快速定量检测。

Description

一种检测羊巴贝斯虫的实时荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测动物血液原虫病的引物对及检测试剂盒。确切讲本发明涉及一种用于快速、特异、灵敏的检测绵羊、山羊和传播媒介蜱体内羊巴贝斯虫的引物对和检测试剂盒。

背景技术

巴贝斯虫病（Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ）是由媒介蜱传播的巴贝斯属的多种原虫寄生于脊椎动物红细胞内而引起的一种血液原虫病。目前，全世界已报道的巴贝斯虫有 100 多个种。该病在世界范围内广泛分布,由于某些巴贝斯虫,如田鼠巴贝斯虫(B. microti)和分歧巴贝斯虫(B.divergence)能够感染人,所以也将其划为人兽共患病病原的范畴。对人类健康和畜牧业有重要影响的巴贝斯虫主要有感染牛的牛巴贝斯虫(B. bovis)与双芽巴贝斯虫(B. bigemina)、感染羊的绵羊巴贝斯虫(B. ovis)与莫氏巴贝斯虫(B. motasi)。感染马属动物的弩巴贝斯虫(B. caballi)及能感染人和鼠的田鼠巴贝斯虫和可以感染多种脊椎动物的分歧巴贝斯虫等(Comillot et al.,2012; Levine,1988; Ristic, 1988)。

截至目前，已报道的感染羊的巴贝斯虫病病原有５种，即莫氏巴贝斯虫（B. motasi）、绵羊巴贝斯虫（B. ovis）、粗糙巴贝斯虫（Ｂ．cｒａｓｓａ）、叶状巴贝斯虫（Ｂ．ｆｏｌｉａｔａ）和泰氏巴贝斯虫（Ｂ．ｔａｙｌｏｒｉ）。我国对羊巴贝斯虫病的研究起步较晚，最早在四川（１９８２年）和黑龙江（１９８６年）有过相关报道。之后，在云南、山西、河南和甘肃等省份也有零星的报道，但一直没有分离到病原。直到1996年，兰州兽医研究所虫媒与虫媒病实验室长期从事梨形虫的研究工作过程中,先后从河北、辽宁、甘肃、新疆和湖北等地分离到了 9株羊的巴贝斯虫,通过分子分类学和生物学特性研究表明这些巴贝斯虫可以分为两个种群,即莫氏巴贝斯虫种群(B. motasi)和巴贝斯虫未定种种群(Babesia sp.) (Guan et al., 2002,2009; Liu et al., 2007; Niu et al., 2009)。其中羊巴贝斯虫临潭株、羊巴贝斯虫宁县株、羊巴贝斯虫天祝株、羊巴贝斯虫麻当株和羊巴贝斯虫河北株属于莫氏巴贝斯虫种群；而羊巴贝斯虫新疆株和羊巴贝斯虫敦煌株属于巴贝斯虫未定种(Bai et al., 2002; Guan et al., 2002; Liu et al.,2007b；Niu et al., 2009a)。同时也建立了各种分子生物学和血清学检测技术，通过流行病学调查显示，在中国，羊巴贝斯虫病感染的阳性率为１１．２％～３１．７％，在甘肃甘南牧区高达８２．３８％（Guan et al, 2012）。

该病在世界各地广泛流行，在我国许多地区也时有发生，尤其是在某些牧区，严重阻碍了畜牧业的发展。因此，建立快速、灵敏、准确又操作方便的检测方法十分必要。

目前常用的诊断方法为血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。还有很多血清学方法，但都存在一定的假阳性或假阴性以及交叉反应。分子生物学诊断方法有套式PCR检测方法, LAMP检测方法(Guan et al., 2010e；Guan et al, 2012)，但套式PCR检测过程中容易造成环境污染，LAMP检测过程中容易出现假阳性。中国发明专利201310566411.2虽然公开了鼠源巴贝斯虫的检测引物及实时荧光定量PCR试剂盒，从理论上讲可以用类似的方法建立一种用于检测羊的检测引物及实时荧光定量PCR试剂盒，但问题是所建立的引物是否能适用于其他反刍动物感染巴贝斯虫的情况，特别是我国牛、羊巴贝斯虫种类之多，能否专一性的检测到多种或所有的羊巴贝斯虫则是一个难于解决的难于解决的问题。目前我国已报道的牛、羊梨形虫已达 15 种之多，在流行区内这些梨形虫对哺乳动物宿主和自然媒介蜱常呈混合感染。由于自然界中媒介蜱与宿主的关系非常复杂，且每种病原都能独立的引起疾病，其混合感染和隐性感染的现象比较多。对流行区内放牧羊群和自然界存在媒介蜱感染状况进行调查过程中，如何提高检测的快速性与敏感性和对不同病原进行鉴别诊断是巴贝斯虫流行病学研究的弱点问题。因此建立一种特异性强、专一性的检测我国分布的羊巴贝斯虫的方法已迫在眉睫。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，能对多种羊羊巴贝斯虫进行检测的引物对，及用包括有所述的引物的检测羊巴贝斯虫的实时定量PCR试剂盒。

本发明的一种用于检测羊巴贝斯虫的引物对核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

本发明的一种用于检测羊巴贝斯虫的实时定量PCR试剂盒包括引物对和棎针，其中引物对为：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，棎针核苷酸序列为SEQ ID No.3，SEQ ID No.3的5端结合有荧光发光基团FAM， 3端结合有荧光猝灭基团BHQ1。

为方便使用，本发明的用于检测羊巴贝斯虫的试剂盒内还有标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18S rRNAOB、阴性质控标准品，荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq^TM，和荧光校正液ROX Reference DyeⅡ。

本发明实际上是一种利用核糖体18S rRNA基因检测绵羊、山羊和传播媒介蜱体内巴贝斯虫的实时荧光定量PCR方法。实时荧光定量PCR( real- time fluorescent quantitative polymerasechain reaction，real-time FQ-PCR)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR技术相比,它具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快和全封闭反应等优点，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。本发明利用梨形虫（巴贝斯虫和泰勒虫）常用来做为鉴别诊断的靶标基因核糖体18S rRNA基因，该基因在梨形虫中高度保守，但在不同虫种之间存在可变区，本发明准确利用该基因的这一特点作为实时荧光定量PCR检测的靶标基因，设计针对绵羊、山羊和蜱体内检测巴贝斯虫的特异性引物和探针，试验表明该引物对与探针只能特异性的检测到感染羊的巴贝斯虫，且灵敏度较高，但未能检测到感染牛的巴贝斯虫和其它相关的病原，其中巴贝斯虫检测组与对照组基本上囊括了国内现存的病原，检测结果良好，从而提供了一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测羊巴贝斯虫的方法，填补了技术空白。本发明中，所用的特异性引物和探针虽然是通过莫氏巴贝斯虫临潭株的18S rRNA基因设计的，试验表明，本发明的引物对和探针可适用于分离我国现发现的其它几株感染羊的巴贝斯虫（莫氏巴贝斯虫宁县株、莫氏巴贝斯虫天祝株和莫氏巴贝斯虫河北株，以及最近发现的羊巴贝斯虫未定种新疆株，这一点恰好体现了本发明所选的靶标基因核糖体18S rRNA基因的保守性和可变区的特点，这一优点是其它基因和本发明外的其它引物对无可比拟的，也是在试验中得到的其它引物所不具有的。通过相应的试验，经对实时荧光定量PCR反应条件的优化，使本发明具有良好的特异性、敏感性和重复性，可使本发明广泛适用于绵羊、山羊和传播媒介蜱体内羊巴贝斯虫的快速定量检测。

附图说明

图1 实时荧光定量PCR特异性扩增曲线。

图2 实时荧光定量PCR敏感性扩增曲线。

图3 实时荧光定量PCR敏感性检测的标准曲线。

具体实施方式

本发明以下结合实施例解说。

根据莫氏巴贝斯虫临潭株的18S rRNA基因设计出本发明的引物对：

SEQ ID No.1(正向引物)：

5’-GGCATATGTCTTGTAATTG-3’；

SEQ ID No.2（反向引物）

5-ACTGCAACAAGTTTAATATACA-3’；

SEQ ID No.3（荧光探针）：

5’(FAM)-TGATGCCGACTTAAAACCCTGG-(BHQ1)3’。

其中的荧光探针SEQ№3的5端结合有荧光发光基团FAM， 3端结合有荧光猝灭基团BHQ1。其扩增的目的片段大小为157bp，上述引物和探针均由大连宝生物工程有限公司合成。在具体应用时还需要有：荧光定量PCR反应液、标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18S rRNAOB、阴性质控标准品。在本实施案例中荧光定量PCR反应液由Premix Ex Taq^TM（2×）12.5μL，和正向引物SEQ№1和反向引物SEQ№2（10μΜ）各0.5μL，荧光探针SEQ№3溶液（5μM）1.0μL，荧光校正液ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5μL，灭菌蒸馏水8.0μL。

本发明的试剂盒应用实例

1.构建重组质粒标准品。

（1）根据羊巴贝斯虫临潭株核糖体18S rRNA基因序列，使用Primer premier 5.0和Oligo 7设计引物，预获得的目的片段大小为661bp,由宝生物生物工程（大连）有限公司合成。引物对序列为：

BLTC-S（正向引物）：5’-AGAAACGGCTACCACATC-3’ SEQ ID No.4

BLTC-AS（反向引物）：5’-CTTGCGACCATACTCCC-3’ SEQ ID No.5

（2）以实验室保存的羊巴贝斯虫不同分离株的DNA为模板进行扩增，采用50μL的PCR反应体系，反应条件为94℃预变性4min，然后94℃1min、56℃1min、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min。取5μL扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒（TaKaRa，大连）进行纯化回收，将回收产物连接到pGEM-Teasy载体（Promega，America）后转化到大肠杆菌感受态细胞JM-109（TaKaRa，大连）中，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆（白班）进行PCR和测序鉴定。

（3）对鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用NanoDrop 2000/2000C（Thermo Scientific，America）超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μL，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0×10⁹ -1.0×10⁰拷贝/μL,以便进行定量PCR扩增。

实时荧光定量PCR方法

（1）反应性分析

定量PCR反应体系为25μL：Premix Ex Taq^TM（2×）12.5μL ，正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2（10μΜ）各0.5μL，荧光探针SEQ ID No.3（5μM）1.0μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.5μL，基因组DNA模板2μL，灭菌蒸馏水8.0μL。反应条件为：95℃预变性30s，然后95℃ 5s、55℃ 10s、72℃ 30s，45个循环。在每一循环的延伸温度结束时设定荧光信号采集点进行实时检测，每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数，实验均设阴性对照。其结果显示：模板量与对应的Ct值呈线性相关，扩增曲线呈S型。

（2）特异性分析

利用上述所建立的实时荧光定量PCR方法，每个样品重复两次分别检测感染羊的莫氏巴贝斯虫临潭株、莫氏巴贝斯虫宁县株、莫氏巴贝斯虫天祝株、莫氏巴贝斯虫河北株和最近发现羊巴贝斯虫未定种新疆株；同时设相关对照牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫未定种；吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、绵羊无浆体、干净羊基因组和灭菌水。结果显示:只有1-莫氏巴贝斯虫临潭株、2-莫氏巴贝斯虫天祝株、3-莫氏巴贝斯虫宁县株、4-莫氏巴贝斯虫河北株和5-羊巴贝斯虫未定种新疆株呈阳性反应，其它巴贝斯虫等相关病原体和水均呈阴性，参见图1。由此可见本发明的引物对可对现今找到的所有羊巴贝斯虫有特异性反应，而对其它的巴贝斯虫则呈阴性反应。

（3）敏感性分析

取不同稀释浓度1.0×10⁹-1.0×10⁰拷贝/μL的质粒标准品进行灵敏度试验，结果显示实时荧光定量PCR方法最低检出限为10⁰拷贝/μL，同时每个浓度进行三个平行样品，且每个浓度平行样品之间的Ct值差异甚小，参见图2和3。

（4）稳定性与重复性分析

取浓度为1.0×10⁶ -1.0×10¹ 拷贝/μL的5个浓度的标准品进行稳定性分析。先进行批内重复性试验，对同一批次稀释的标准品，每个浓度重复检测四次，分析Ct值的变异系数。然后再进行批间重复性试验，对3个不同批次的稀释的标准品进行检测，经分析Ct值变异系数分析来判定其稳定性。反复重复该实验三次，获得的数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有其可比性，具有良好的重复性。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种检测羊巴贝斯虫的实时荧光定量PCR试剂盒

<160> 3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（正向引物）

<400>

aggcatatgtc ttgtaattg 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（反向引物）

<400>

actgcaacaa gtttaatata ca 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（探针）

<400>

tgatgccgac ttaaaaccct gg 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（BLTC-S）

<400>

agaaacggct accacatc 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（BLTC-AS）

<400>

cttgcgacca tactccc 17

Claims

1.一种用于检测羊巴贝斯虫的引物对，其特征是引物对核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

2.一种用于检测羊巴贝斯虫的实时定量PCR试剂盒，其特征在于包括引物对和棎针，其中引物对为：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，棎针核苷酸序列为SEQ ID No.3，SEQ ID No.3的5端结合有荧光发光基团FAM， 3端结合有荧光猝灭基团BHQ1。

3.根据权利要求2所述的用于检测羊巴贝斯虫的试剂盒，其特征在于试剂盒内还有标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18S rRNAOB、阴性质控标准品，荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq^TM，和荧光校正液ROX Reference DyeⅡ。