CN107779519A - 检测犬焦虫的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

检测犬焦虫的引物对、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭露检测犬焦虫的引物对、试剂盒及方法，该引物对具有一正向引物及一反向引物，该试剂盒具有该引物对及一探针，其中，该正向引物的序列如序列编号1所示，该反向引物的序列如序列编号2所示，该探针的序列如序列编号3所示。

Description

检测犬焦虫的引物对、试剂盒及方法
技术领域
本发明关于一种检测焦虫的引物对、试剂盒及方法，尤指一种检测犬焦虫的引物对、试剂盒及方法。
背景技术
全世界有许多种类的焦虫(Babesia spp.)可感染犬只，其中以犬焦虫(Babesiacanis)，又称大焦虫，以及小焦虫(Babesia gibsoni)最常见。犬焦虫(Babesia canis)是一种原生动物寄生虫，会感染犬只的红血球而造成贫血症状。犬焦虫主要是经由棕色犬璧虱(brown dog tick,Rhipicephalus sanguineus)而传播，且为最常见的梨形虫(piroplasm)感染之一。棕色犬璧虱适合生长在温暖的气候，因此南亚、东南亚、日本、南韩、中国华北地区、大洋洲、欧洲、及美国都是犬焦虫感染的流行范围。
由于犬焦虫及小焦虫的治疗方法不同，因此需要快速且正确诊断出犬焦虫感染，以免延误病情。然而，犬焦虫并不容易诊断。目前用于犬焦虫诊断的方法包括血液抹片、血清诊断及分子诊断，但前述方法皆有其限制。
虽然兽医师可透过Giemsa染色法直接从血液抹片上判断病原，但此方法不容易区别出大焦虫及小焦虫，且此方法有赖受过良好训练及经验丰富的技术人员，才能做出正确判断。此外，此方法须采用新鲜的检体，以保持生物活性及型态，故检体必须迅速进行处理。
血清诊断则有助于辨识犬焦虫抗体的存在，然而血清诊断无法区分出急性感染及慢性感染。血清诊断的限制更在于交叉反应，尤其在不同的焦虫种类之间，使得检测的专一性不佳，以及在年轻或免疫抑制的犬只上，或是在免疫转换发生前的感染初期，都可能产生伪阴性的检测结果。
而诊断犬焦虫最佳的方式便是分子诊断，尤其是利用聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)进行检测。聚合酶连锁反应是一种更灵敏且更具专一性的技术，提供了诊断焦虫症(babesiosis)的另一替代方案，而18S rRNA的基因序列即被用来分辨各种种类的焦虫及相关原生动物。举例而言，由引物设计有限公司(PrimerdesignLtd)所提供的焦虫检测试剂盒(canine babesiosis 18S ribosomal RNA(18S)genegenesig standard kit)可用来检测犬只所感染的焦虫症，然而，此试剂盒也无法区别大焦虫及小焦虫的感染。
因此，为了能选择适当的治疗方式以避免延误病情，实有必要提供一种能专一地检测出犬焦虫的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的引物对，以选择适当的治疗方式，避免延误病情。
本发明的另一目的在于提供一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的试剂盒，以选择适当的治疗方式，避免延误病情。
本发明的又一目的在于提供一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的方法，以选择适当的治疗方式，避免延误病情。
为达上述目的，本发明的一较广义实施方式为提供一种用以检测犬焦虫(Babesiacanis)的引物对，包含一正向引物及一反向引物，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’。该正向引物及该反向引物为用于实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)。
又，本发明的另一较广义实施方式为提供一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的试剂盒，包含一正向引物、一反向引物及一探针，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及该探针的序列为5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。该正向引物、该反向引物及该探针为用于实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)。又，该探针的5’端接上报导染剂(reporter dye)，且3’端接上淬灭体(quencher)。
又，本发明的另一较广义实施方式为提供一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应来扩增犬焦虫(Babesia canis)的核酸分子，且所采用的正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探针的序列为5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。该探针的5’端接上报导染剂(reporter dye)，且3’端接上淬灭体(quencher)。
又，本发明的另一较广义实施方式为提供一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的试剂盒，包含一正向引物、一反向引物及一探针，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及该探针的序列为5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
又，本发明的另一较广义实施方式为提供一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)来扩增犬焦虫(Babesia canis)的核酸分子，且所采用的正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探针的序列为5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
附图说明
图1显示正向引物、反向引物及探针对应于18S rRNA基因序列的位置。
图2显示正向引物、反向引物及探针的基因序列。
图3显示多种焦虫物种的18S rRNA序列比对。
图4A及图4B显示实时聚合酶链锁反应扩增结果的分析。
具体实施方式
体现本发明特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及附图示在本质上当作说明之用，而非用以限制本发明。
本发明利用实时聚合酶链锁反应(Real-time polymerase chain reaction，简称Real-time PCR)，又称定量聚合酶链锁反应(Quantitative polymerase chain reaction，简称为Q-PCR)来进行犬焦虫的检测，且采用探针检测系统(probe-based detection)。首先，具有专一性的正向引物、反向引物及探针会杂合到犬焦虫的目标DNA上，探针的5’端接上报导染剂(reporter dye)，3’端接上淬灭体(quencher)。在PCR扩增反应过程中，探针会被切割，使得报导染料与淬灭体分离，即可检测到报导染料所发出的荧光。在一实施例中，报导染料为FAM荧光基团，淬灭体为BHQ1基团。
在此试验中的目标DNA为犬焦虫(Babesia canis)的18S rRNA基因(基因库登录号为KP896299.1)中的一段可变区域(variable region)，其包含对犬焦虫具有特异性的序列。本发明PCR引物及探针利用Primer3软件所设计，且依GC含量及不含发夹结构(hairpinstructure)的基础进行选择。图1显示所采用的正向引物、反向引物及探针对应于18S rRNA基因序列的位置，其中，正向引物起始于基因序列第6个位置，探针起始于基因序列第69个位置，反向引物起始于基因序列第93位置。利用此正向引物、反向引物及探针的组合将可扩增犬焦虫DNA而得出大小为88-bp的扩增子(amplicon)片段。图2显示正向引物、反向引物及探针的基因序列，其中，正向引物(序列编号1)大小为18-mer，反向引物(序列编号2)大小为19-mer，探针(序列编号3)大小为22-mer。
为确认所采用的PCR引物及探针对犬焦虫具有专一性，利用美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)提供的Primer-BLAST系统对前述包含正向引物及反向引物的引物对及探针进行比对，结果显示没有其他相近的物种具有与本发明设计的引物对及探针完全相同的序列。
此外，为进一步了解本发明的引物对及探针的专一性信息，利用DNA并列比对工具(DNA alignment tool)与其他相似序列进行分析。图3即显示多种焦虫物种的18S rRNA序列比对，由图中可见，针对犬焦虫(Babesia canis)序列而言，正向引物位于第195至212碱基对的位置，探针位于第237至258碱基对的位置，反向引物位于第264至282碱基对的位置。在这些片段中，没有其他相近的物种具有完全相同的序列，此结果显示本发明的引物对及探针的专一性相当高，且只能用来扩增及检测犬焦虫的18S rRNA基因。
因此，本发明提供了一种用以检测犬焦虫的引物对，包含一正向引物及一反向引物，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’。本发明同时提供一种用以检测犬焦虫的试剂盒，包含一正向引物、一反向引物及一探针，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及该探针的序列为5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。另一方面，本发明亦提供一种用以检测犬焦虫的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应来扩增犬焦虫的核酸分子，且所采用的正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探针的序列为5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。
在另一些实施例中，由于本发明的引物对可专一地检测犬焦虫，故只要是位于正向引物及反向引物序列位置之间的序列，皆可设计为探针序列，因此，本发明提供的检测犬焦虫的试剂盒或方法亦可不限制采用前述的探针序列，且探针可选择杂合至DNA的任一股上，故相同位置的互补序列皆可做为探针序列。例如，与前述探针序列互补的序列5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’(序列编号4)亦可做为本发明的探针序列。
因此，本发明亦提供了一种用以检测犬焦虫的试剂盒，包含一正向引物、一反向引物及一探针，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及该探针的序列为5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。另一方面，本发明亦提供一种用以检测犬焦虫的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应来扩增犬焦虫的核酸分子，且所采用的正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探针的序列为5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
以下将以实例说明利用本发明设计的引物对及探针进行犬焦虫的检测。首先，取200μl以EDTA保存的待测全血样品进行DNA萃取，其利用Qiagen提供的萃取试剂盒QIAampDNA Blood Mini Kit来萃取，并溶在100μl的冲提缓冲液中。接着进行实时聚合酶链锁反应，其利用Bio-Rad实时聚合酶链锁反应机器(CFX96)来执行。PCR反应混合物中包含10μl的KAPA Fast probe universal master mix，250nM的正向引物及反向引物，及250nM的探针，其中，正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探针的序列为5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。将3μl的萃取DNA模板加入至每一反应管中，并使总体积达20μl。PCR循环条件则先95℃3分钟，接着进行95℃3秒钟的变性(denaturation)及60℃20秒钟的退火(annealing)及延伸(extension)，重复40个循环。
正控制组(positive control)为具有犬焦虫456-bp的18S rRNA的基因片段的克隆载体(RBC Cloning System)。将此重组DNA质体制备一系列十倍稀释液，分别为1.25×10,1.25×102,1.25×103,1.25×104,1.25×105,1.25×106,1.25×108copies/μl的稀释液。每一稀释液进行二次重复分析，以测定犬焦虫DNA检测的下限，以及实时聚合酶链锁反应扩增的线性关系及效率。
图4A及图4B显示实时聚合酶链锁反应扩增结果的分析。图4A显示不同拷贝数的质体样本的扩增曲线，可看出本发明的检测方法具有相当高的灵敏度。图4B显示本发明的检测方法具有相当好的线性关系，因此，本发明的检测方法可进行定量分析，用以估计基因的拷贝数，进而估计临床样本中原虫寄生(parasitemia)的百分比。
综上所述，本发明提供一种检测犬焦虫的方法，其利用实时聚合酶链锁反应及具有特异性的引物对及探针来进行检测。本发明提供的方法具有高灵敏性，可在无临床症状的感染案例中检测到低原虫寄生量。本发明提供的方法更具有高专一性，可区别出焦虫的不同种类，而这对于犬焦虫的治疗非常重要，因为犬焦虫及小焦虫的治疗方法不同，因此需要快速且正确诊断出犬焦虫感染，以免延误病情。
纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由本领域技术人员任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附权利要求书所欲保护的范围。

Claims (9)

1.一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的引物对，包含一正向引物及一反向引物，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’。
2.如权利要求1所述的引物对，其中该正向引物及该反向引物为用于实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)。
3.一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的试剂盒，包含一正向引物、一反向引物及一探针，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及该探针的序列为5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中该正向引物、该反向引物及该探针为用于实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其中该探针的5’端接上报导染剂(reporter dye)，且3’端接上淬灭体(quencher)。
6.一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应来扩增犬焦虫(Babesia canis)的核酸分子，且所采用的正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探针的序列为5’-CATCGCTAAATGCGATTCGCCA-3’。
7.如权利要求6所述的方法，其中该探针的5’端接上报导染剂(reporter dye)，且3’端接上淬灭体(quencher)。
8.一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的试剂盒，包含一正向引物、一反向引物及一探针，其中，该正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，该反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及该探针的序列为5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
9.一种用以检测犬焦虫(Babesia canis)的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)来扩增犬焦虫(Babesia canis)的核酸分子，且所采用的正向引物的序列为5’-TAGTTTGAAACCCGCCTT-3’，反向引物的序列为5’-GATGGGTCAGAAACTTGAA-3’，以及探针的序列为5’-TGGCGAATCGCATTTAGCGATG-3’。
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