KR102482020B1 - 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 개 바베시아 검출세트 및 검출방법 - Google Patents

실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 개 바베시아 검출세트 및 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응으로, 개 바베시아 감염증의 주 원인인
바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(Babesia canis)를 검출할 수 있는 검출세트 및 검출방법에 관한 것이다.

Description

실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 개 바베시아 검출세트 및 검출방법{DETECTION SET FOR CANINE BABESIA USING REAL-TIME PCR AND DETECTION METHOD THEREOF}
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응으로, 개 바베시아 감염증의 주원인인 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(Babesia canis)를 검출할 수 있는 검출세트 및 검출방법에 관한 것이다.
바베시아 감염증(Babesiosis)는 진드기 매개로 인한 원생동물 기생충인 바베시아(Babesia) 종에 의해 발생한다. 숙주는 설치류, 사람, 개, 고양이, 말과 소 등이다. 바베시아는 포유류의 적혈구를 침범하여 빈혈을 유발한다. 개 바베시아는 혈액도말 김자(Giemsa) 염색상에서 적혈구 내 원충의 형태에 따라 대형과 소형으로 나눌 수 있는데, B. canis vogeli, B. canis canis, B. canis rossi, B.coco는 대형, Babesia gibsoni, B. conrada, B. microti, B. annae 는 소형에 속한다. 일반적으로 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni)의 병원성이 바베시아 캐니스(Babesia canis)보다 심하다.
개 바베시아 감염증은 전 세계적으로 발생하며, 지역별로 감염원이 되는 바베시아 종 또한 차이가 있다. 개 바베시아 감염증을 일으키는 대표적인 종은 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(B. canis) 하위 3종(Babesia canis canis, canis rossi, canis vogeli)이 있으며 아시아 지역에서는 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni)에 의한 감염이 많다(Irwin, P. J. (2010). Canine Babesiosis. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 40(6), 1141-1156.) 특히 우리나라를 비롯한 아시아 지역은 대부분 소형인 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni) 감염이 주로 발병하는 것으로 보고되었다.
개 바베시아증의 주된 임상증상은 용혈성 빈혈에 따른 점막창백, 혈색소뇨, 빈맥, 빈호흡, 발열, 식욕저하, 침울, 황달, 비장종대, 림프절 종대, 혈소판감소 등이다. 만성 혹은 저감염된 경우 무증상으로 진행되나, 스트레스나 부신피질호르몬제 투여와 같은 면역억제 상황에서 다시 증상을 발현될 수 있다.
개 바베시아 감염증을 진단하는 방법은 혈액도말, 효소 면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR) 등이 있으며, 현재 국내 동물병원의 경우 면역진단 기반의 항체가 검사 키트를 이용하거나 PCR 검사 위탁을 통해 개 바베시아 감염증을 진단하고 있다. 일반적으로 PCR 방법은 민감도가 높아 조기 진단에 유리하기 때문에 병원 현장에서 개 바베시아 감염증의 정확한 진단을 위해 항체가 검사 키트와 함께 이용될 필요가 있다.
대한민국 특허등록 제10-1419717호: 주혈원충, 바베스열원충, 범안열원충을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 중합효소 연쇄반응 키트, 상기 키트를 이용한 주혈원충, 바베스열원충, 범안열원충 진단 방법
본 발명의 과제는 개 바베시아 감염증을 일으키는 바베시아(바베스 열원충)인 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(Babesia canis)에 특이적인 프라이머와 프로브 세트를 이용하여 정확하게 확인할 수 있는 검출세트 및 검출방법을 제공하는 것이다.
상기한 과제를 달성하기 위해 본 발명은,
서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 바베시아 검출용 프라이머쌍과,
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 베바시아 검출용 프로브
를 포함하는, 바베시아 검출세트를 제공한다.
또한 본 발명은
시료로부터 추출한 DNA를 제1항의 검출세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 분석하는 단계
를 포함하는, 실시간 중합효소연쇄반응으로 바베시아를 검출하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은
상기한 검출세트, 반응완충액 및 데옥시뉴클레오티드(dNTP)를 포함하는 바베시아 검출키트를 제공한다.
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 개 바베시아 감염증을 일으키는 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(Babesia canis)를 신속하게 검출할 수 있다. 기존 바베시아 감염증 검출 방법 경우 일반적인 중합효소 연쇄반응을 이용한 것으로 전기영동이 필수로 과정에 포함되어 분석시간이 크게 소모되고 오염의 위험이 있다. 본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 것으로 기존 방법 대비 시간 소모와 오염의 위험이 적기 때문에 병원 현장에서 진단용으로 쓰이기에 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 프라이머/프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 진행하여 바베시아 이외의 타 미생물에 대한
특이도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 프라이머/프로브를 이용하여 최소검출 한계 민감도를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다(R2: 0.99995, eff %: 102.14399).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1의 프라이머/프로브를 이용하여 판정기준치 (Cut-off)를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 바베시아 hsp 70 유전자를 표적 유전자로 하여 PCR을 통해 증폭시키고, 동시에 증폭 산물에 혼성가능하며 검출가능한 수단으로 표지된 프로브를 반응시킴으로써, 실시간 PCR 방법을 통해 개 바베시아 감염증을 일으키는 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(Babesia canis)를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 언급한 실시간 PCR 방법은 thermal cycler와 분광 형광광도계가 일체화된 장치를 이용하여, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 얻고자하는 DNA의 양을 분석하는 방법을 의미한다. 실시간 PCR방법은 PCR 증폭산물의 확인을 위한 전기영동이 필요 없으며, 증폭이 지수 함수적으로 일어나는 영역에서 증폭산물량을 비교하여 더욱 정확한 정량이 가능한, 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.
이러한 과정으로 제작한, 본 발명의 바베시아 검출 세트의 상세한 사항은 하기 표 1과 같다.
구분 염기서열 (5'->3') 타겟 유전자 비고
Babesia F1 CAACACYACCATCAGCCGTGC hsp70 서열번호 1
Babesia R1 TCGTGGATCTTCCTCTTGTCMAG 서열번호 2
Babesia FAM BHQ1 CGTTTCGAGGAGATGTGTGGTGAGAAGTTC 서열번호 3
본 발명의 바베시아 검출용 세트 중 프로브의 3' 및 5' 말단에 검출 가능한 수단을 포함하거나, 예컨대 표지되어 있을 수 있다. 상기 검출가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광 표지인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 예로, 형광 표지 인자가 가장 바람직하다. 형광 표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 용이하게 입수가능하다. 형광 표지 인자의 예로는, FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, RED610, RED670, Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 인자는 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
일 예로, 형광 표지 인자는 통상의 방법으로 본 발명에 따른 바베시아 검출세트에 포함된 프라이머, 또는 프로브에 표지된다. 표지 방법은 인터칼레이팅(intercalating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 인터칼레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-calator: SYBR Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 형광 억제 물질(quencher)에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3' 엑소뉴클레아제 활성으로주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 형광 억제 물질(quencher)에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘방법은 양 말단을 형광 표지인자(FAM, TAMRA 등)과 형광 억제 물질(quencher)(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광 표지인자와 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광 표지인자와 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.
이러한 방법을 본 발명의 바베시아를 검출하기 위한 실시간 PCR 방법에 적용할 수 있다. 상기한 방법들은 당업계에 공지된 것이므로, 반응 효율, 시간, 형광 표지인자 타입 등을 적절히 고려하여, 특정 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에서는 일 예로, TaqMan™ 프로브 방법을 사용할 수 있다. 이때 상기 프로브는 5'말단이 JOE, VIC, 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein, FAM), 시아닌-5(Cyanine-5, Cy5) 및 ROX로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질로 표지되며, 상기 프로브의 3'-말단은 BHQ(Black hole Quencher)-1, BHQ-2, BHQ-3, TAO 및 MGB로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된다.
본 발명의 바베시아를 검출하는 방법에 있어, 실시간 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있다.
또한, 본 발명의 바베시아 검출세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여, 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다.
이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명의 바베시아 검출세트 및 이를 이용한 바베시아 검출 방법에 의해, 기존의 바베시아를 검출하기 위한 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 검출 세트를 포함하는, 바베시아 검출용 키트를 제공한다. 상기 프라이머 쌍 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다.
또한, 본 발명의 키트는 택 중합효소(Taq. polymerase), MgCl2를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약, 예컨대 실시간 PCR용 마스터 믹스를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 프라이머 및 프로브 구성
바베시아 검출을 위한 표적 유전자를 hsp 70 유전자로 선정하였다. Reference 서열을 기준으로 NCBI DB에서 nucleotide blast를 진행하여 529개의 유사 서열을 수집하였고 수집된 서열을 비교하여 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(B. canis)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 디자인 하였다.
사용한 reference sequence는 다음과 같다: Accession No. AB083515(Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea4)
서열 수집을 위한 nucleotide blast의 조건은 아래와 같다:
- Max target sequences : 1,000
- Optimize for Highly similar sequences (Megablast)
- Database : Standard database_nucleotide collection (nr/nt)
디자인된 프라이머와 프로브의 서열은 표 2와 같다.
구분 염기서열 (5'->3') 타겟 유전자 비고
Babesia F1 CAACACYACCATCAGCCGTGC hsp70 서열번호 1
Babesia R1 TCGTGGATCTTCCTCTTGTCMAG 서열번호 2
Babesia FAM BHQ1 CGTTTCGAGGAGATGTGTGGTGAGAAGTTC 서열번호 3
실험예 1: 바베시아 깁소니 , 바베시아 캐니스 검출용 프라이머 , 프로브의 이론적 특이도 확인
타 균주, 기생충, 바이러스에 대한 교차반응 여부를 확인하기 위해 디자인 된 프라이머와 프로브를 각각 NCBI nucleotide blast를 이용하여 검증하였다.
이론적 특이도 확인을 위한 nucleotide blast의 조건은 아래와 같다:
- Max target sequences : 1,000
- Optimize for Highly similar sequences (Megablast)
- Database : Standard database_nucleotide collection (nr/nt)
서열번호 1의 정방향 프라이머(Babesia F1)에 대한 blast 결과를 아래 표 3에 나타내었다.
No. Description Max Score E value Per.
Ident*		 Accession 검출여부
1 Babesia canis vogeli isolate Bengaluru-490 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 39.4 0.9 95.24 MK947103.1 O
2 Babesia canis vogeli isolate Bengaluru-401 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 39.4 0.9 95.24 MK947102.1 O
3 Babesia canis vogeli isolate Bengaluru-102 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 39.4 0.9 95.24 MK947101.1 O
4 Babesia ovata heat shock 70 (BOVATA_024020), partial mRNA 39.4 0.9 95.24 XM_029011319.1 O
5 Babesia bigemina dnaK protein, putative partial mRNA 39.4 0.9 95.24 XM_012910642.1 O
6 Babesia bigemina genome assembly Bbig001, chromosome : I 39.4 0.9 95.24 LK391707.1 O
7 Babesia bovis BBOV_III010010 mRNA for dnaK protein, complete cds,
clone: XBBk017269, strain: Texas		 39.4 0.9 95.24 AK441590.1 O
8 Babesia bovis BBOV_III010010 mRNA for dnaK protein, complete cds,
clone: XBBk005181, strain: Texas		 39.4 0.9 95.24 AK440760.1 O
9 Babesia bovis BBOV_III010010 mRNA for dnaK protein, complete cds,
clone: XBBk004153, strain: Texas		 39.4 0.9 95.24 AK440686.1 O
10 Babesia gibsoni strain TWN2 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 39.4 0.9 95.24 FJ763842.1 O
11 Babesia gibsoni strain TWN5 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 39.4 0.9 95.24 FJ763841.1 O
12 Babesia gibsoni strain TWN3 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 39.4 0.9 95.24 FJ763839.1 O
13 Babesia bigemina HSP70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds 39.4 0.9 95.24 AB482178.1 O
14 Babesia gibsoni strain TWN1 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 39.4 0.9 95.24 EF584826.1 O
15 Babesia bovis dnaK protein (BBOV_III010010) mRNA, complete cds 39.4 0.9 95.24 XM_001612075.1 O
16 Babesia canis vogeli heat shock protein 70 (hsp70) gene, complete cds 39.4 0.9 95.24 EF527401.1 O
17 Babesia orientalis heat shock protein 70 mRNA, complete cds 39.4 0.9 95.24 EF512547.1 O
18 Babesia caballi hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: BcabUSDA 39.4 0.9 95.24 AB248742.1 O
19 Babesia odocoilei hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: Bodo625-3 39.4 0.9 95.24 AB248740.1 O
20 Babesia canis rossi hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: Bcr69 39.4 0.9 95.24 AB248737.1 O
21 Babesia canis rossi hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: Bcr44 39.4 0.9 95.24 AB248736.1 O
22 Babesia canis canis hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: Bcc450 39.4 0.9 95.24 AB248735.1 O
23 Babesia canis canis hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: Bcc295 39.4 0.9 95.24 AB248734.1 O
24 Babesia vogeli hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: BcvOki76 39.4 0.9 95.24 AB248733.1 O
25 Babesia vogeli hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: BcvOki64 39.4 0.9 95.24 AB248732.1 O
26 Babesia gibsoni hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: BgOki61 39.4 0.9 95.24 AB248730.1 O
27 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea4 39.4 0.9 95.24 AB083515.1 O
28 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea3 39.4 0.9 95.24 AB083514.1 O
29 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea2 39.4 0.9 95.24 AB083513.1 O
30 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea1 39.4 0.9 95.24 AB083512.1 O
31 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Japan2 39.4 0.9 95.24 AB083511.1 O
32 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Japan1 39.4 0.9 95.24 AB083510.1 O
33 Babesia bovis heat shock protein 70 (HSP70) mRNA, complete cds 39.4 0.9 95.24 AF107118.1 O
34 Babesia ovata NAD-specific glutamate dehydrogenase (BOVATA_024010), partial mRNA 39.4 0.9 95.24 XM_029011318.1 O
35 [Mycobacterium] chelonae subsp. chelonae strain DSM 43804 chromosome, complete genome 39.4 0.9 95.24 CP034383.1 O
36 Mycobacterium phlei strain NCTC8151 genome assembly, chromosome: 1 39.4 0.9 95.24 LR134347.1 O
37 Mycobacterium chelonae CCUG 47445, complete genome 39.4 0.9 95.24 CP007220.1 O
38 Mycobacterium chelonae genome 39.4 0.9 95.24 CP010946.1 O
39 Parambassis ranga genome assembly, chromosome: 16 37.3 3.7 95 LR131966.1 X
40 Anabaena cylindrica PCC 7122 chromosome, complete genome 37.3 3.7 95 CP003659.1 X
41 Babesia divergens hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: BdivUK 37.3 3.7 95 AB248739.1 X
42 Chitinophaga sp. 1303 chromosome, complete genome 37.3 3.7 95 CP051204.1 X
43 Chitinophaga sp. 1310 chromosome, complete genome 37.3 3.7 95 CP051205.1 X
44 Sphaerospermopsis kisseleviana NIES-73 DNA, nearly complete genome 37.3 3.7 95 AP018314.1 X
45 Anabaena cylindrica PCC 7122 DNA, nearly complete genome 37.3 3.7 95 AP018166.1 X
46 Mycobacterium sp. EPM10906, complete genome 37.3 3.7 95 CP010271.1 X
47 Calothrix sp. PCC 7507 chromosome, complete genome 37.3 3.7 95 CP003943.1 X
48 Spirosoma sp. I-24 chromosome 35.3 15 94.74 CP045997.1 X
49 PREDICTED: Contarinia nasturtii protein kinase C-binding protein 1-like
(LOC116342390), transcript variant X2, mRNA		 35.3 15 94.74 XM_031769982.1 X
50 PREDICTED: Contarinia nasturtii protein kinase C-binding protein 1-like
(LOC116342390), transcript variant X1, mRNA		 35.3 15 94.74 XM_031769981.1 X
*per. Ident: Primer sequence에 mixed base code (Y)가 포함되어 프로그램에서 1 base pair 불일치 값인 95.24% 일치로 표시됨.
서열번호 2의 역방향 프라이머(Babesia R1)에 대한 blast 결과는 아래 표 4에 나타내었다.
No. Description Max Score E value Per. ident Accession 검출여부
1 Babesia canis vogeli isolate Bengaluru-490 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 43.3 0.11 95.65 MK947103.1 O
2 Babesia canis vogeli isolate Bengaluru-401 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 43.3 0.11 95.65 MK947102.1 O
3 Babesia canis vogeli isolate Bengaluru-102 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 43.3 0.11 95.65 MK947101.1 O
4 Babesia bigemina dnaK protein, putative partial mRNA 43.3 0.11 95.65 XM_012910642.1 O
5 Babesia bigemina genome assembly Bbig001, chromosome : I 43.3 0.11 95.65 LK391707.1 O
6 Babesia gibsoni strain TWN2 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 43.3 0.11 95.65 FJ763842.1 O
7 Babesia gibsoni strain TWN5 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 43.3 0.11 95.65 FJ763841.1 O
8 Babesia gibsoni strain TWN3 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 43.3 0.11 95.65 FJ763839.1 O
9 Babesia bigemina HSP70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds 43.3 0.11 95.65 AB482178.1 O
10 Babesia gibsoni strain TWN1 heat shock protein 70 (hsp70) gene, partial cds 43.3 0.11 95.65 EF584826.1 O
11 Babesia canis vogeli heat shock protein 70 (hsp70) gene, complete cds 43.3 0.11 95.65 EF527401.1 O
12 Babesia orientalis heat shock protein 70 mRNA, complete cds 43.3 0.11 95.65 EF512547.1 O
13 Babesia caballi hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: BcabUSDA 43.3 0.11 95.65 AB248742.1 O
14 Babesia ovis hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: BovTur 43.3 0.11 95.65 AB248741.1 O
15 Babesia canis rossi hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: Bcr69 43.3 0.11 95.65 AB248737.1 O
16 Babesia canis rossi hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: Bcr44 43.3 0.11 95.65 AB248736.1 O
17 Babesia canis canis hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: Bcc450 43.3 0.11 95.65 AB248735.1 O
18 Babesia canis canis hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: Bcc295 43.3 0.11 95.65 AB248734.1 O
19 Babesia vogeli hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: BcvOki76 43.3 0.11 95.65 AB248733.1 O
20 Babesia vogeli hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: BcvOki64 43.3 0.11 95.65 AB248732.1 O
21 Babesia gibsoni hsp70 gene for heat shock protein 70, complete cds, isolate: BgOki61 43.3 0.11 95.65 AB248730.1 O
22 Babesia gibsoni hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, strain: Aomori 2 43.3 0.11 95.65 AB118031.1 O
23 Babesia gibsoni hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, strain: Okinawa 1 43.3 0.11 95.65 AB118030.1 O
24 Babesia gibsoni hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, strain: Aomori 1 43.3 0.11 95.65 AB118028.1 O
25 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea4 43.3 0.11 95.65 AB083515.1 O
26 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea3 43.3 0.11 95.65 AB083514.1 O
27 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea2 43.3 0.11 95.65 AB083513.1 O
28 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Korea1 43.3 0.11 95.65 AB083512.1 O
29 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Japan2 43.3 0.11 95.65 AB083511.1 O
30 Babesia gibsoni hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds, strain: Japan1 43.3 0.11 95.65 AB083510.1 O
31 Babesia cf. odocoilei Fukui-766 hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds 41.3 0.44 100 LC430611.1 X
32 Babesia cf. odocoilei Akita-615 hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds 41.3 0.44 100 LC430610.1 X
33 Babesia cf. odocoilei Akita-610 hsp70 mRNA for heat shock protein 70, complete cds 41.3 0.44 100 LC430609.1 X
34 Babesia odocoilei hsp70 gene for heat shock protein 70, partial cds, isolate: Bodo625-3 41.3 0.44 100 AB248740.1 X
35 PREDICTED: Stomoxys calcitrans eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 3 (LOC106088297), transcript variant X1, mRNA 39.3 1.8 100 XM_013253735.1 X
36 Aspergillus flavus strain AF36 chromosome 2 37.2 7.4 100 CP051020.1 X
37 Mytilinidion resinicola vacuolar membrane PQ loop repeat protein (BDZ99DRAFT_444186), mRNA 37.2 7.4 100 XM_033717882.1 X
38 Lotus japonicus B-129 DNA, chromosome 3, complete sequence 37.2 7.4 100 AP022631.1 X
39 Ensifer adhaerens strain Corn53 plasmid AA, complete sequence 37.2 7.4 100 CP030263.1 X
40 Gadus morhua genome assembly, chromosome: 7 37.2 7.4 100 LR633949.1 X
41 PREDICTED: Carassius auratus collagen alpha-1(VII) chain-like (LOC113065579), transcript variant X5, mRNA 37.2 7.4 100 XM_026236973.1 X
42 PREDICTED: Carassius auratus collagen alpha-1(VII) chain-like (LOC113065579), transcript variant X4, mRNA 37.2 7.4 100 XM_026236962.1 X
43 PREDICTED: Carassius auratus collagen alpha-1(VII) chain-like (LOC113065579), transcript variant X3, mRNA 37.2 7.4 100 XM_026236952.1 X
44 PREDICTED: Carassius auratus collagen alpha-1(VII) chain-like (LOC113065579), transcript variant X2, mRNA 37.2 7.4 100 XM_026236942.1 X
45 PREDICTED: Carassius auratus collagen alpha-1(VII) chain-like (LOC113065579), transcript variant X1, mRNA 37.2 7.4 100 XM_026236933.1 X
46 PREDICTED: Carassius auratus collagen alpha-1(VII) chain-like (LOC113056736), mRNA 37.2 7.4 100 XM_026223566.1 X
47 Oryzias latipes strain HSOK chromosome 13 37.2 7.4 100 CP020633.1 X
48 Oryzias latipes strain HNI chromosome 13 37.2 7.4 100 CP020791.1 X
49 Oryzias latipes strain Hd-rR chromosome 13 sequence 37.2 7.4 100 CP020677.1 X
50 TPA: Oryzias latipes strain Hd-rR, complete genome assembly, chromosome 13 37.2 7.4 100 HF933219.1 X
*per. Ident: Primer sequence에 mixed base code (M)가 포함되어 프로그램에서 1 base pair 불일치 값인 95.45% 일치로 표시됨.
**No. 31~50의 per. Ident값이 100%인 이유는 R1 염기서열 23개 중 20개 이하로 100% 일치하는 결과임.
각 프라이머와 프로브 세트에 대하여 NCBI nucleotide blast를 통해 이론적 특이도를 확인한 결과, 서열번호 2 내지 3의 역방향 프라이머와 프로브 서열은 바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(Babesia canis) 이외의 타 미생물에 불일치 하는 것을 확인하였다. 서열번호 1의 정방향 프라이머 서열의 경우, 바베시아 이외에 Mycobacterium 일부의 서열에 일치하는 것으로 확인되었다. 그러나 중합효소 연쇄반응의 특성상 정방향 프라이머 서열과 역방향 프라이머 서열이 미생물에 동시에 일치하지 않는 경우 검출되지 않으므로 Mycobacterium에 대한 잘못된 검출은 없을 것으로 판단된다.
실험예 2: 바베시아 깁소니 , 바베시아 캐니스 검출용 프라이머 , 프로브세트를 이용한 검출 방법
상기 표 2의 실시간 중합효소 연쇄반응에서 디자인된 프라이머와 프로브의 사용농도는 표 6과 같다.
타겟 이름 프라이머/ 프로브
사용농도 (nM)
초고속 Real-time PCR 10ul 반응 시 Real-time PCR
20ul 반응 시
바베시아 깁소니(Babesia gibsoni),
바베시아 캐니스(Babesia canis)		 Babesia F1
(서열번호 1)		 1500 750
Babesia R1
(서열번호 2)		 1500 750
Babesia FAM BHQ1
(서열번호 3)		 200 100
바베시아 깁소니(Babesia gibsoni), 바베시아 캐니스(Babesia canis) 검출용 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응의 반응 조건은 표 7과 같다.
본 발명 과정에 사용한 실시간 중합효소 연쇄반응 기기는 (주)진시스템의 UF-150 (초고속 실시간중합효소 연쇄반응)과 BIO-RAD사의 CFX connect이다. 그러나 본 발명의 프라이머와 프로브 세트는 위 2개 장비에 국한되지 않고 이용할 수 있다.
고속 실시간 PCR 장비 (UF-150) 실시간 PCR 장비
단계 온도 (℃) 시간 (초) 반복 단계 온도 (℃) 시간 (초) 반복
Pre-denaturation 50 300 1 Pre-denaturation 95 600 1
Denaturation 95 5 45 Denaturation 95 15 45
Annealing 60 15 Annealing/
extension		 60 60
Extension 72 5
실험예 3: 바베시아 깁소니, 바베시아 캐니스 검출용 프라이머, 프로브에 대한 특이도 실험
본 발명의 프라이머, 프로브 세트를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응의 특이도를 바베시아 깁소니 DNA 시료, 12종의 진드기 매개 감염성 박테리아 시료에 대한 검출여부로 확인하였다.
특이도 실험에 이용한 교차반응 리스트는 표 8과 같다.
No. Target Sample Ref.
1 Babesia 임상검체
 -
2 기타 Bartonella jaculi KCTC 23655
3 Bartonella pachyuromydis KCTC 23657
4 Bartonella acomydis KCTC 23908
5 Bartonella callosciuri KCTC 23909
6 Bartonella pachyuromys KCTC 23911
7 Leptospira interrogans(canicola) ATCC 23470
8 Anaplasma ovis ATCC VR-1437
9 Francisella philomiragia ATCC 25017D-5
10 Bartonella quintana Vircell MBC006
11 Borrelia garinii Vircell MBC077
12 Borrelia afzelii Vircell MBC078
바베시아 깁소니 시료의 경우 표준균주를 분양받을 수 없어 병원 진단 양성으로 판정된 바베시아 시료를 기준으로 시험하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 본 발명에서 디자인된 프라이머, 프라이머 세트는 바베시아 이외의 타 미생물에 대해 반응하지 않는 것으로 확인되었다.
실험예 4: 바베시아 깁소니, 바베시아 캐니스 검출용 프라이머, 프로브에 대한 민감도 실험
4-1. 최소검출한계 (Limit of detection, LOD )
실시간 중합효소연쇄반응 기술을 이용한 바베시아 깁소니, 바베시아 캐니스 프라이머, 프로브 세트의 민감도를 확인하였다. 0.91 x 105 copy/㎕로 정량한 plasmid DNA를 10배식 단계 희석하여 3반복으로 테스트 진행하였다. 실험결과 0.91 x 101 copy/㎕까지 100% 검출 가능한 것을 확인하였다.
4-2. 판정기준치 (Cut-off)
판정기준치를 확인하기 위해서 최소검출한계 시험에서 100% 검출된 0.91 x 101 copy/㎕ 농도와 66.7%로 검출된 0.91 x 100 copy/㎕를 5구간으로 세분화하여 각 20반복으로 테스트를 진행하였다.
도 3에 나타낸 결과에서 보듯이, 95% 이상 검출되는 판정기준치는 0.47 x 101 copies/㎕ (95% CI: 0.36 x 101 copies/㎕ - 0.74 x 101 copies/㎕) 로 확인되었다.
4-3. 정밀도- 반복성 실험
반복성을 평가하기 위해, 민감도 시험에서 100% 검출된 0.91 x 101 copy/㎕를 저농도로 선정하고, 각각 10배 농도인 0.91 x 102 copy/㎕를 중간 농도, 0.91 x 103 copy/㎕를 고농도로 선정하였다. 해당하는 세 가지 농도에 대해서 검사 내, 검사 간, 날짜 간, 검사실 내, 로트 간 반복성 실험을 진행하였고, 결과의 평균(mean), 표준편차(standard deviation, SD), 변동계수(coefficient of variation, CV)는 아래 표 9에 나타내었다.
검사 내 반복성 (각 농도당 10일간 반복)
Target Concentration (copies/㎕)
High Middle Low
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.31±0.39 33.47±0.55 36.84±0.95
CV (%) 1.29 1.63 2.57
검사 간 반복성 (각 농도당 10일간 반복)
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.22±0.36 33.49±0.50 37.06±0.81
CV (%) 1.18 1.50 2.20
날짜 간 반복성 (각 농도당 10일간 반복)
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.51±0.42 33.69±0.47 37.04±0.82
CV (%) 1.39 1.41 2.22
검사실 내 반복성 (각 농도당 10일간 반복)
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.28±0.39 33.61±0.50 36.84±0.66
CV (%) 1.29 1.50 1.78
로트 간 반복성 (각 농도당 10일간 반복)
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.16±0.45 33.61±0.52 36.81±0.73
CV (%) 1.50 1.54 1.99
4-4. 재현성 실험
정밀도를 평가하기 위해, 민감도 시험에서 100% 검출된 0.91 x 101 copy/㎕를 저농도로 선정하고, 각각 10배 농도인 0.91 x 102 copy/㎕를 중간 농도, 0.91 x 103 copy/㎕를 고농도로 선정하였다. 해당하는 세 가지 농도에 대해서 검사 장소(기관)간, 장비 간, 검사자 간, 로트 간 재현성 실험을 진행하였고, 결과의 평균(mean), 표준편차(standard deviation, SD), 변동계수(coefficient of variation, CV)는 아래 표 10에 나타내었다.
장소 간 재현성 (각 농도당 5일간반복 )
Target Concentration (copies/㎕)
High Middle Low
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.14±0.34 33.24±0.40 36.74±0.80
CV (%) 1.13 1.22 2.17
장비 간 재현성 (각 농도당 5일간 반복)
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.59±0.73 33.88±0.95 37.18±1.26
CV (%) 2.4 2.81 3.38
검사자 간 재현성 (각 농도당 5일간 반복)
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.24±0.32 33.63±0.48 36.86±0.72
CV (%) 1.07 1.42 1.96
로트 간 재현성 (각 농도당 5일간 반복)
Babesia 0.91 x 103 0.91 x 102 0.91 x 101
Ct Mean± SD 30.13±0.31 33.33±0.46 36.65±0.71
CV (%) 1.02 1.39 1.95
실험예 4: 바베시아 깁소니 , 바베시아 캐니스 검출용 프라이머 , 프로브에 대한 임상 실험
병원현장에서 양성 49개, 음성 49개로 진단된 98개의 표 11의 임상시료를 이용하여 실험예 2와 동일하게 수행하여 임상 평가를 진행하였으며, 그에 따른 결과 총 일치율은 98.98% (95% CI: 94.45% - 99.97%)로 확인하였다.
No. Breed Age (Y, M) Gender (F/M) Weight (Kg) Animal hospital results
1 Pomeranian 14y F 3.56 -
2 Shih-tzu 10y F 4.97 -
3 Shih-tzu 10y F 6.1 -
4 Bichonfrise 3y F 2.96 -
5 Pomeranian 11y F 2.42 -
6 Maltese 8m F 2.08 -
7 Maltese 12y F 3.2 -
8 C. Spaniel 7y F 11.9 -
9 Golden Retriever 4y4m M 34 +
10 Yorkshire Terrier 7y M 4.55 +
11 Cocker Spaniel 7y F 9.46 +
12 Shetland Sheepdog 2y M 12.5 +
13 Welsh corgi 4y M 12.9 +
14 Pomeranian 13y M 2.6 +
15 Mixed 3y5m M 6.38 +
16 Mixed 1y M 11.2 +
17 Golden Retriever 5y F 33 +
18 Maltese 7y F 3.4 +
19 Golden Retriever 1y M 35 +
20 Maltese 14y F 2 +
21 Poodle 3y M 4 +
22 Poodle 6y M 10.9 +
23 Mixed 7y M 5 +
24 Shih-tzu 4y F 4.1 +
25 Poodle 12y F 3.8 +
26 Bedlington Terrier 1y F 9.35 +
27 Spitz 2y F 7.4 +
28 Pomeranian 2y F 2.9 +
29 Bichon Frise 5y M 8.2 +
30 Poodle 1y F 3.4 +
31 Maltese 10y M 6.3 +
32 Welsh corgi 3y F 8.4 +
33 Maltese 7y F 3.14 -
34 Shih-tzu 14y F 3.5 -
35 M. schnauzer 16y F 5.3 -
36 M. schnauzer 17y M 6.2 -
37 Maltese 10y F 4.88 -
38 Poodle 5y M 2.88 -
39 Maltese 12y M 2.7 -
40 Mixed 3y M 9.7 -
41 Y.T. 9y M 2.38 -
42 Pomeranian 1y M 2.1 -
43 Mixed 7y F 9.46 -
44 Mixed 13y F 5.98 -
45 Maltese 7y M 3.6 -
46 Poodle 5y F 5.64 -
47 Labrador Retriever 4y F 32 -
48 Bichonfrise 15y M 13.6 -
49 Maltese 5y F 6.16 -
50 Maltese 9y M 2.61 -
51 Poodle 10y M 5.4 -
52 Pomeranian 7y M 5.42 -
53 Mixed 3y F 5.7 -
54 Shih-tzu 3y F 4.5 +
55 Dachshund 8y M 9.15 +
56 Poodle 6y M 3.8 +
57 Kerry Blue Terrier 5y F 12.1 +
58 Pomeranian 5y F 5.1 +
59 Maltese 1y F 3.76 +
60 Border Collie 4y F 13.5 +
61 Mixed 7y M 10.98 +
62 Cocker Spaniel 1y F 8.6 +
63 Goldendoodle 4y M 27.5 +
64 Shih-tzu 8y F 2.5 +
65 Schnauzer 10y F 3.8 +
66 Pomeranian 9y M 3.7 +
67 Shih-tzu 4y M 6.45 -
68 C. Spaniel 8y M 18.5 -
69 Maltese 11y M 6.96 -
70 Maltese 4y F 3.7 -
71 Maltese 5y F 3.63 -
72 Maltese 11y M 3.2 -
73 Maltese 7y M 4.3 -
74 M. schnauzer 9y F 5.88 -
75 Y.T. 17y F 1.68 -
76 white terrier 6y F 6.6 -
77 Maltese 8y F 2.24 -
78 Pomeranian 8y M 5.58 -
79 Poodle 7y M 4.16 -
80 Shih-tzu 8y M 3.8 -
81 Maltese 4y M 5.8 -
82 Maltese 8y M 2.57 -
83 Poodle 9y M 3.7 -
84 Shih-tzu 11y F 7 -
85 Poodle 18y M 4.8 -
86 Pomeranian 1y M 3.45 +
87 Shih-tzu 12y F 4.7 +
88 Border Collie 2y M 15 +
89 Maltese 3y M 3.8 +
90 Maltese 6y M 4.6 +
91 Pomeranian 3y M 5.1 +
92 Poodle 4y M 8 +
93 Maltese 3y F 3.8 +
94 Jindo 1Y F 17.5 +
95 Poodle 1Y11M F 6.42 +
96 Pomeranian 8Y F 3.16 +
97 Maltese 11M M 3.2 +
98 Maltese 11y M 3.66 -
상관성 평가 병원 진단 결과 합계
양성 음성
검출세트 양성 48 0 48
음성 1 49 50
합계 49 49 98
양성 일치율 = 97.96% (95% CI: 89.15% - 99.95%)
음성 일치율 = 100.00% (95% CI: 92.75% - 100.00%)
총 일치율 = 98.98% (95% CI: 94.45% - 99.97%)
<110> CAREVET Co., Ltd. <120> DETECTION SET FOR CANINE BABESIA USING REAL-TIME PCR AND DETECTION METHOD THEREOF <130> DP200047 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Babesia specific forward primer Babesia F1 <400> 1 caacacyacc atcagccgtg c 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Babesia specific reverse primer Babesia R1 <400> 2 tcgtggatct tcctcttgtc mag 23 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Babesia specific probe Babesia FAM BHQ1 <400> 3 cgtttcgagg agatgtgtgg tgagaagttc 30

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 바베시아 검출용 프라이머쌍과,
    서열번호 3의 염기서열로 이루어진 베바시아 검출용 프로브를 포함하고,
    상기 프로브의 5'말단과 3'말단은 형광물질로 표지된 것을 특징으로 하며,
    바베시아 깁소니(Babesia gibsoni) 및 바베시아 캐니스(Babesia canis)를 검출하는 바베시아 검출세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바베시아 캐니스(Babesia canis)는
    바베시아 캐니스 보겔리(Babesia canis vogeli), 바베시아 캐니스 로시(Babesia canis rossi) 또는 바베시아 캐니스 캐니스(Babesia canis canis)인 것을 특징으로 하는 바베시아 검출세트.
  3. 분리된 시료로부터 추출한 DNA를 제1항의 검출세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 분석하는 단계
    를 포함하는, 바베시아 검출방법.
  4. 제1항의 검출세트, 반응완충액 및 데옥시뉴클레오티드(dNTP)를 포함하는 바베시아 검출키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검출키트는 하나의 반응 용기, 스트립(strip) 또는 마이크로플레이트에 패키징 되는 것을 특징으로 하는 바베시아 검출키트.
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