KR102254155B1 - 신경 괴사 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신경 괴사 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로 a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하는 단계; c) 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 사용하여 엔도뉴클레아제의 존재 하에서 재조합효소 중합효소 증폭을 수행하는 단계; 및 d) 상기 재조합효소 중합효소 증폭으로 생성된 증폭산물 중 상기 역방향 프라이머 및 상기 프로브의 5' 부위가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 신경 괴사 바이러스 검출 방법, 및 상기 프라이머 및 프로브를 포함하는 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신경 괴사 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
바이러스성 신경 괴사증의 원인이 되는 신경 괴사 바이러스(nervous necrosis virus, NNV)는 게놈 및 물리적 특성에 따라 Nodaviridae과의 Betanodavirus 속으로 분류된다. NNV는 각각 RNA-의존 RNA 중합효소 및 캡시드 단백질을 암호화하는 2 개의 단일 가닥 포지티브-센스 RNA 게놈(RNA1 및 RNA2)을 갖는다.
많은 수의 해양 어류가 NNV에 감염될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 바이러스는 유럽에서 처음으로 보고된 질병인 전염성 뇌 망막 병증을 유발할 수 있으며, 많은 치어와 어린 해양 어류의 폐사를 유발할 수 있다. 이 바이러스는 부모 생식선, 수정란 및 치어에서의 검출에 의해 확인된 바와 같이 수직적으로도 전염될 수 있다. 따라서 NNV 감염에 대한 산란 물고기 검사는 이 바이러스의 수직 전파를 방지하고 줄이기 위해 중요하다.
검출 방법 중에서, 핵산의 등온증폭은 고정된 온도 조건에서 이루어지는 간단하고 빠르고 효율적인 기술이다. 최근 30년 동안, 루프매개 등온증폭(LAMP) 및 핵산서열기반 증폭(NASBA)과 같은 다양한 등온증폭방법이 도입되어 중합효소 연쇄반응(PCR)의 대안으로 적용되어왔다. 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)은 DNA 증폭의 새로운 등온기술로 고온에 의한 DNA 변성을 필요로 하지 않으며 일정한 저온에서 수행된다.
RPA에서는 PCR에서의 고온변성 과정을 대체하는 두 가지 주요 단백질 성분인 재조합효소와 단일가닥 DNA 결합 단백질(SSB)이 사용된다(도 1 참조). 재조합효소는 단일가닥 올리고뉴클레오티드인 프로브(probe) 및 프라이머(primer)와 함께 뉴클레오프로틴 필라멘트(nucleoprotein filament)를 형성한다. 이 뉴클레오프로틴 필라멘트는 표적 DNA에서 그 서열의 상동체를 찾는다. 이후 가닥-치환 DNA 합성(strand-displacement DNA synthesis)이 진행되는데, 이는 재조합효소-프라이머 가닥이 DNA 주형과 결합할 때 발생할 수 있다. SSB는 프라이머와 결합된 DNA 주형에 결합한다. 그런 다음, 중합효소(polymerase)에 의한 증폭이 일어나게 된다.
RPA는 전기 영동으로 감지할 수 있지만 측면흐름 딥스틱(lateral flow dipstick, LFD)으로 시각화할 수도 있다. LFD를 사용한 평가는 특수 장비없이 5 ~ 10분이면 완료되므로 RPA와 함께 사용하면 탐지 절차를 간소화할 수 있다.
이러한 RPA를 이용하여 박테리아 또는 바이러스 병원체를 검출하기 위한 시도가 이루어지고 있으나, 아직까지 NNV 검출에 관한 연구는 이루어지지 않았다.
본 발명자는 상기와 같은 RPA를 이용하여 NNV를 검출할 수 있는 방법, 특히 측면흐름분석을 적용할 수 있는 방법을 개발함으로써 현지에서 누구나 쉽고 빠르게 NNV의 감염 여부를 확인할 수 있도록 하여 NNV의 감염 및 확산을 보다 용이하게 관리할 수 있도록 하고자 하였다.
Chien, M.-H., Vo, T.T.M., Wu, S.-Y. and Lin, C.-H., 2017. Complete Genome Sequence of Nervous Necrosis Virus Isolated from Orange-Spotted Grouper (Epinephelus coioides) in Taiwan. Genome announcements 5, e00942-17.
따라서 본 발명의 주된 목적은 재조합효소 중합효소 증폭법, 특히 측면흐름분석법이 함께 적용되는 방법을 사용하여 간단하고 빠르게 신경 괴사 바이러스를 검출할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 신경 괴사 바이러스 검출 방법에 적용하기 위한 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하는 단계; c) 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 사용하여 엔도뉴클레아제의 존재 하에서 재조합효소 중합효소 증폭을 수행하는 단계; 및 d) 상기 재조합효소 중합효소 증폭으로 생성된 증폭산물 중 상기 역방향 프라이머 및 상기 프로브의 5' 부위가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 신경 괴사 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 재조합효소 중합효소 증폭을 40 내지 42℃에서 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 재조합효소 중합효소 증폭을 15 내지 30분간 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 c)단계에서 표지물질로 표지된 역방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머의 표지물질과 다른 표지물질로 표지된 프로브를 사용하고, 상기 d)단계에서 상기 역방향 프라이머의 표지물질 및 프로브의 표지물질이 모두 포함된 증폭산물을 검출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 측면흐름검출법을 사용하여 상기 d)단계의 검출을 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 포함하는 재조합효소 중합효소 증폭법을 이용한 신경 괴사 바이러스 검출용 프라이머-프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머-프로브 세트에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 표지물질로 표지된 것이고, 상기 프로브는 상기 역방향 프라이머의 표지물질과 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 프라이머-프로브 세트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 포함하는 재조합효소 중합효소 증폭법을 이용한 신경 괴사 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 표지물질로 표지된 것이고, 상기 프로브는 상기 역방향 프라이머의 표지물질과 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 포함하는 재조합효소 중합효소 증폭법을 이용한 신경 괴사 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 표지물질로 표지된 것이고, 상기 프로브는 상기 역방향 프라이머의 표지물질과 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 키트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명에 따르면 재조합효소 중합효소 증폭법을 사용하여 간단하고 신속하며 높은 정확도로 신경 괴사 바이러스를 검출할 수 있다. 특히, 본 발명의 검출 방법, 프라이머-프로브 세트, 조성물, 키트는 측면흐름분석법에 적용할 수 있어 검출의 편의성을 더욱 높일 수 있다. 이에 따라 본 발명의 검출 방법, 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트는 해양 어류의 신경 괴사 바이러스 감염을 조기에 발견하고, 이의 확산을 방지하는데 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA)의 원리를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 적용된 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석의 원리를 나타낸 것이다. A: 재조합효소 중합효소 증폭의 원리, B: 측면흐름분석의 원리.
도 3은 본 발명의 프라이머 및 프로브에 의해 표적 증폭산물이 증폭되는 원리를 나타낸 것이다. A: 본 발명의 프라이머에 의한 증폭, B: 본 발명의 프라이머에 프로브가 더해지는 경우의 증폭.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 반응온도별(반응시간 30분) 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석에 의한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 반응시간별(반응온도 41℃) 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석에 의한 결과를 나타낸 것이다. A: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 측면흐름분석을 수행한 결과, B: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 서로 다른 종류의 바이러스 유래 DNA가 함유된 시료별 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석에 의한 결과를 나타낸 것이다. -: 물을 시료로 사용한 대조군, lane 1: 신경 괴사 바이러스 유래 DNA가 함유된 시료, lane 2: 신경 괴사 바이러스 유래 DNA가 함유된 시료, 적색 도미 이리도바이러스(red sea bream iridovirus, RSIV) 유래 DNA가 함유된 시료, lane 3: 해양 버나바이러스(marine birnavirus, MABV) 유래 DNA가 함유된 시료, lane 4: 바이러스성 출혈 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)유래 DNA가 함유된 시료, A: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 측면흐름분석을 수행한 결과, B: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 시료 내 신경 괴사 바이러스 유래 DNA의 농도별 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석에 의한 결과를 나타낸 것이다. A: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 측면흐름분석을 수행한 결과, B: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과, NTC: 물을 시료로 사용한 대조군.
도 2는 본 발명의 일실시예에 적용된 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석의 원리를 나타낸 것이다. A: 재조합효소 중합효소 증폭의 원리, B: 측면흐름분석의 원리.
도 3은 본 발명의 프라이머 및 프로브에 의해 표적 증폭산물이 증폭되는 원리를 나타낸 것이다. A: 본 발명의 프라이머에 의한 증폭, B: 본 발명의 프라이머에 프로브가 더해지는 경우의 증폭.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 반응온도별(반응시간 30분) 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석에 의한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 반응시간별(반응온도 41℃) 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석에 의한 결과를 나타낸 것이다. A: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 측면흐름분석을 수행한 결과, B: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 서로 다른 종류의 바이러스 유래 DNA가 함유된 시료별 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석에 의한 결과를 나타낸 것이다. -: 물을 시료로 사용한 대조군, lane 1: 신경 괴사 바이러스 유래 DNA가 함유된 시료, lane 2: 신경 괴사 바이러스 유래 DNA가 함유된 시료, 적색 도미 이리도바이러스(red sea bream iridovirus, RSIV) 유래 DNA가 함유된 시료, lane 3: 해양 버나바이러스(marine birnavirus, MABV) 유래 DNA가 함유된 시료, lane 4: 바이러스성 출혈 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)유래 DNA가 함유된 시료, A: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 측면흐름분석을 수행한 결과, B: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 시료 내 신경 괴사 바이러스 유래 DNA의 농도별 재조합효소 중합효소 증폭 및 측면흐름분석에 의한 결과를 나타낸 것이다. A: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 측면흐름분석을 수행한 결과, B: 재조합효소 중합효소 증폭 이후 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과, NTC: 물을 시료로 사용한 대조군.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명은 신경 괴사 바이러스(nervous necrosis virus, NNV) 검출을 위해 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브는 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA)에 적합하도록 설계된 것이며, 특히 측면흐름분석법(lateral flow assay, LFA)에 적용될 수 있어, 매우 간단하고 신속한 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 신경 괴사 바이러스의 RNA로부터 합성되는 cDNA에 특이적으로 결합하여 이들 프라이머의 결합 부위 사이를 재조합효소 중합효소가 증폭하도록 유도할 수 있다.
본 발명의 프로브는 상기 프라이머에 의해 증폭된 증폭산물에 특이적으로 결합하며, 엔도뉴클레아제에 의해 비염기 형태로 치환된 부위를 포함한 3' 부분이 제거되어 또 다른 프라이머로서 작용할 수 있다.
결과적으로 시료에 신경 괴사 바이러스가 존재할 경우, 본 발명의 프라이머 및 프로브를 사용하여 엔도뉴클레아제의 존재 하에서 재조합효소 중합효소 증폭을 수행하면, 역방향 프라이머와 프로브의 5' 부위가 포함된 형태의 증폭산물이 생성되고, 이 증폭산물의 존재 여부를 확인하는 방법으로 시료 내 신경 괴사 바이러스를 검출할 수 있게 된다(도 2 참조).
본 발명에서 상기 역방향 프라이머 및 프로브는 서로 다른 종류의 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이러한 표지물질을 이용하면 상기와 같은 표적 증폭산물의 존재 여부를 보다 용이하게 확인할 수 있다. 이때 상기 표지물질은 올리고뉴클레오티드의 표지에 사용되는 통상의 표지물질일 수 있으며, 예를 들어 비오틴(biotin) 및 FAM(fluorescein amidites)일 수 있다.
상기와 같은 표지물질을 이용할 경우, 특히 측면흐름분석법에 용이하게 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 역방향 프라이머의 표지물질을 검출할 수 있는 검출물질 및 상기 프로브의 표지물질을 검출할 수 있는 검출물질을 함유하여 각각의 표지물질의 검출을 가시적으로 확인할 수 있는 측면흐름 딥스틱을 사용할 수 있다. 이때 상기 검출물질은 예를 들어 표지물질에 대한 항체일 수 있다.
본 발명의 프로브는 3' 말단에 스페이서가 포함되어 엔도뉴클레아제에 의해 3' 부위가 제거되지 않은 상태에서의 불필요한 증폭반응이 일어나지 않도록 이루어지는 것이 바람직하다. 이때 스페이서는 예를 들어, C3 스페이서(C3 spacer)일 수 있다.
본 발명의 프로브에서 35번 염기의 비염기 형태는 엔도뉴클레아제의 작용을 위해 구성되는 것으로 엔도뉴클레아제가 인식하여 절단할 수 있는 통상적인 DNA의 비염기 형태일 수 있으며, 예를 들어 THF(tetrahydrofuran)일 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하는 단계; c) 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 및 프로브를 사용하여 엔도뉴클레아제의 존재 하에서 재조합효소 중합효소 증폭을 수행하는 단계; d) 상기 재조합효소 중합효소 증폭으로 생성된 증폭산물 중 상기 역방향 프라이머 및 상기 프로브의 5' 부위가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하여 이루어진다.
상기 a)단계는 신경 괴사 바이러스의 감염이 의심되는 시료로부터 신경 괴사 바이러스의 유전체인 RNA를 분리하기 위한 단계로 시료로부터 RNA를 분리하기 위해 사용되는 통상의 방법을 적용할 수 있다.
상기 b)단계는 상기 a)단계에서 분리된 RNA, 즉 신경 괴사 바이러스의 RNA가 포함될 수 있는 RNA를 이후의 재조합효소 중합효소 증폭을 위해 cDNA로 합성하는 단계로 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하는 통상의 cDNA 합성 방법을 적용할 수 있다.
상기 c)단계는 상기 b)단계에서 합성된 cDNA로부터 신경 괴사 바이러스 유래의 cDNA를 증폭하기 위한 단계로 본 발명의 프라이머 및 프로브와 함께 재조합효소(recombinase), 중합효소(polymerase), 단일가닥 DNA 결합 단백질(single-stranded DNA binding protein, SSB), 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 사용하는 통상의 재조합효소 중합효소 증폭 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이때 보다 효율적인 증폭을 위하여 40 ~ 42℃에서 재조합효소 중합효소 증폭을 수행하는 것이 바람직하며, 증폭시간은 15 ~ 30분으로 수행하는 것이 바람직하다.
상기 b)단계와 c)단계는 재조합효소 중합효소 증폭 반응액에 역전사효소(reverse transcriptase)를 첨가하는 방법으로 같은 반응액 내에서 동시에 수행할 수 있다.
상기 d)단계는 상기 c)단계에서 증폭되는 표적 증폭산물을 검출하는 단계로 중합효소에 의해 증폭된 증폭산물을 검출하기 위한 통상의 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 아가로스 겔 전기영동 등을 사용할 수 있으나, 보다 간단하고 신속한 검출을 위해 측면흐름분석법을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 표적 증폭산물은 본 발명의 역방향 프라이머, 그리고 본 발명 프로브의 5' 부위가 포함된 형태이므로, 이를 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명은 상기 프라이머 및 프로브를 포함하여 상기와 같은 신경 괴사 바이러스 검출 방법에 적용할 수 있는 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 신경 괴사 바이러스 검출용 조성물은 본 발명의 프라이머 및 프로브 이외에도 이들을 안정화시키기 위한 완충액, 상기와 같은 재조합효소 중합효소 증폭에 사용되는 시약 등이 더 포함될 수 있으며, 다른 표적의 증폭을 위한 프라이머 또는 프로브도 포함될 수 있다.
본 발명의 신경 괴사 바이러스 검출용 키트는 본 발명의 프라이머 및 프로브 이외에 재조합효소 중합효소 증폭에 사용되는 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있으며, 다른 표적의 증폭을 위한 프라이머 또는 프로브도 포함될 수 있다. 특히, 측면흐름 딥스틱과 같이 표적 증폭산물을 간단한 방법으로 신속하게 검출할 수 있는 기구가 포함되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
본 실시예는 신경 괴사 바이러스(nervous necrosis virus, NNV)의 DNA를 갖는 플라스미드를 사용하여 수행되었다.
바이러스 성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 및 마린 버나바이러스(marine birnavirus, MABV)와 같은 다른 바이러스의 DNA를 비교를 위해 사용하였다.
테스트에서 주형으로 사용하기 위해 NNV(NCBI GenBank 접근 번호 GU339227.1), VHSV(AY310918.1) 및 MABV(D87826.1)에 대한 부분 유전자를 합성하고(Macrogen, Seoul, Korea) pGEM T-에 클로닝하였다. 플라스미드를 대장균 DH5α로 형질 전환하고 -80℃에서 보관하였다. 플라스미드 DNA를 얻기 위해, 세포 스톡을 1% 암피실린과 함께 LB 배지에서 밤새 배양하고, AccuPrep® Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 세포 배양물로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다.
재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA)을 위한 특이적 프라이머 및 프로브(표 1 참조)는 NNV의 서열(GU339227.1)을 사용하여 설계하였다(도 3 참조). 그리고 측면흐름분석(lateral flow assay, LFA)을 적용하기 위해, 비오틴을 역방향 프라이머의 5' 말단에 추가하였다. 프로브는 5' 말단에 FAM(fluorescein amidites) 표지, 중간에 THF(tetrahydrofuran) 잔기 및 3' 말단에 C3 스페이서(C3 spacer, SpC3)(Eurogentec, Seraing, Belgium)가 생성되도록 설계하였다.
| 서열 | |
| NNV F | 5'-AAGGTGAGAAGAAATTGGCAAAACCCGCGACC-3' |
| NNV R | 5'-Biotin-ATTTGGCAACGACTGCACCACGAGTTGCTTGAAGCG-3' |
| NNV Probe | 5'-(FAM)-TAGTAATCGCACTGACGCACCTGTGTCTAAGGCC-(THF)-CGACTGTGACTGGATTT -C3Spacer-3' |
RPA는 TwistAmp® nfo(TwistDX, Cambridge, UK)를 사용하여 수행하였다. 29.5㎕의 rehydration buffer, 2.1㎕의 각 프라이머(10μM), 0.6㎕의 프로브(10μM), 12.2㎕의 ddH2O 및 1㎕의 DNA 주형을 혼합하고, 이 혼합물 전부(47.5㎕)를 키트에 제공된 동결건조 펠렛이 함유된 시험관에 첨가하는 방법으로 수행하였다. 이후 2.5㎕의 280mM 아세트산 마그네슘(MgAc)을 튜브 뚜껑에 첨가하고, 튜브를 잠깐 원심분리하여 MgAc가 반응액에 첨가되도록 하여 반응을 시작하였다.
최적의 반응조건을 테스트하기 위하여 다양한 반응온도 및 반응시간을 조사 하였다(30 ~ 50℃ 및 5 ~ 45분). RPA 반응의 민감도는 97ng/ℓ ~ 9.7fg/ℓ 범위로 바이러스 DNA를 10배 연속희석하여 적용하는 방법으로 측정하였고, 물을 음성대조군으로 사용하였다.
이어서 LFA를 수행하였다(Milenia Biotec, Giessen, Germany).
본 실시예의 프로브는 5' 부분에 형광 태그(FAM)가 결합되고, 대장균 엔도뉴클레아 IV(Nfo)를 이용하기 위해 중간에 THF 잔기를 함유하여 THF가 Nfo에 의해 절단된 후 DNA 증폭 프라이머의 역할을 할 수 있다. 역방향 프라이머는 5' 부분에 비오틴을 함유하고, Nfo에 의해 절단된 프로브와 함께 DNA를 증폭하는데 관여한다. 증폭된 DNA는 LFA에서 금 나노 입자에 결합된 단일클론 항-FAM 항체에 인식된다. LFA의 검출 라인은 다른 고정화 항체에 의해 포획되는 비오틴의 존재에 의해 형성된다(도 2 참조).
최적의 RPA 온도를 결정하기 위해 다양한 반응온도(30, 31, 33, 37, 41, 44, 45 및 48℃)를 적용한 결과, 모든 온도 조건에서 밴드가 확인되었지만 가장 확실한 타겟 밴드는 41℃에서 확인되었다(도 4 참조). 아가로스 겔에서 확인한 결과에서도 41℃에서 최적의 증폭물이 확인되었다.
또한 5 ~ 45분의 다양한 반응시간을 적용한 결과, 최적 반응시간은 30분 이상이었다(도 5 참조). 5분의 반응시간을 적용한 경우, 아가로스 겔에서는 아무것도 검출되지 않았으며, LFA에서는 희미하게 검출될 수 있었다. 하지만 15분 이상의 반응시간을 적용한 경우에는 겔에서도 RPA 결과가 검출될 수 있었고, LFA에서도 명확하게 나타났다(도 5 참조). 이들 결과는 최소 15분의 반응 후 충분한 증폭물이 생성된다는 것을 의미한다.
본 발명의 프라이머와 프로브가 NNV에 특이적인지 확인하기 위해 특이성 실험을 진행하였다. 이 실험에서 RSIV, VHSV 및 MABV와 같은 다른 해양 바이러스를 사용하여 비교평가를 수행하였다. 도 6에서와 같이 본 발명의 특이적인 프로브와 프라이머를 이용한 RPA는 NNV를 특이적으로 검출했으며, 다른 바이러스는 검출되지 않았다.
NNV 검출 민감도를 평가하기 위해 반응액 중 NNV DNA의 농도를 9.7fg/ℓ까지 조절하여 수행한 결과, 9.7pg/ℓ까지 명확한 NNV 검출이 가능한 것으로 나타났다(도 7의 A 참조). 겔 로딩으로는 97pg에서 검출 가능하지만, 그 이하에서는 검출되지 않았다(도 7의 B 참조). 이는 본 발명의 검출에 있어서 LFA가 겔 로딩보다 더 민감성이 높다는 것을 의미한다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology
Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> Method for detecting nervous necrosis virus, and primer-probe
set, composition and kit for the same
<130> 01
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 1
aaggtgagaa gaaattggca aaacccgcga cc 32
<210> 2
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atttggcaac gactgcacca cgagttgctt gaagcg 36
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 3
tagtaatcgc actgacgcac ctgtgtctaa ggcctcgact gtgactggat tt 52
Claims (14)
- a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하는 단계;
c) 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고,
서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머;
서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 사용하여 엔도뉴클레아제의 존재 하에서 재조합효소 중합효소 증폭을 수행하는 단계; 및
d) 상기 재조합효소 중합효소 증폭으로 생성된 증폭산물 중 상기 역방향 프라이머 및 상기 프로브의 5' 부위가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 신경 괴사 바이러스(nervous necrosis virus, NNV) 검출 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 역방향 프라이머는 5' 말단에 비오틴(Biotin)을 표지물질로 가지고,
상기 프로브는 5' 말단에 FAM(Fluorescein amidites)을 표지물질로 가지는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머;
서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 포함하는 재조합효소 중합효소 증폭법을 이용한 신경 괴사 바이러스(nervous necrosis virus, NNV) 검출용 프라이머-프로브 세트.
- 제 6항에 있어서,
상기 역방향 프라이머는 5' 말단에 비오틴(Biotin)을 표지물질로 가지고,
상기 프로브는 5' 말단에 FAM(Fluorescein amidites)을 표지물질로 가지는 것을 특징으로 하는 프라이머-프로브 세트.
- 삭제
- 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머;
서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 포함하는 재조합효소 중합효소 증폭법을 이용한 신경 괴사 바이러스(nervous necrosis virus, NNV) 검출용 조성물.
- 제 9항에 있어서,
상기 역방향 프라이머는 5' 말단에 비오틴(Biotin)을 표지물질로 가지고,
상기 프로브는 5' 말단에 FAM(Fluorescein amidites)을 표지물질로 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머;
서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 서열 중 35번 염기가 비염기 형태로 치환된 서열로 이루어지는 프로브;를 포함하는 재조합효소 중합효소 증폭법을 이용한 신경 괴사 바이러스(nervous necrosis virus, NNV) 검출용 키트.
- 제 12항에 있어서,
상기 역방향 프라이머는 5' 말단에 비오틴(Biotin)을 표지물질로 가지고,
상기 프로브는 5' 말단에 FAM(Fluorescein amidites)을 표지물질로 가지는 것을 특징으로 하는 키트.
- 삭제
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| KR1020190154756A KR102254155B1 (ko) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 신경 괴사 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020190154756A KR102254155B1 (ko) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 신경 괴사 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트 |
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| KR1020190154756A KR102254155B1 (ko) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 신경 괴사 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머-프로브 세트, 조성물 및 키트 |
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| KR (1) | KR102254155B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113637797A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-11-12 | 中山大学 | 用于检测鱼类神经坏死病毒的微滴式数字pcr方法及相应的试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107012258A (zh) * | 2017-03-22 | 2017-08-04 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列 |
-
2019
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113637797A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-11-12 | 中山大学 | 用于检测鱼类神经坏死病毒的微滴式数字pcr方法及相应的试剂盒 |
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