KR102280441B1 - 해양 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트 - Google Patents

해양 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해양 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로 a) 시료로부터 DNA 또는 RNA를 분리하는 단계; b) 시료로부터 분리된 DNA; 또는 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 하여 합성된 cDNA;를 주형으로 하고, 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 c) 상기 중합효소연쇄반응으로 생성된 증폭산물 중 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 해양 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.

Description

해양 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트{Method for detecting maritime virus, and primer set, composition and kit for the same}
본 발명은 해양 바이러스 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)는 Rhabdoviridae의 Novirhabdovirus으로 분류된다. 다양한 해양 및 민물 어류종이 이 VHSV에 감염될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이 바이러스는 내부 장기, 피부, 근육 및 기타 어류 조직에서 전신 출혈을 일으킬 수 있으며, 해양 및 담수어 양식장에 심각한 피해를 줄 수 있다. 최근에는 많은 양의 어류를 사육하기 위해 양어장이 흔해졌으며, VHSV는 수로를 통해 수평으로 전파 될 수 있다. 유럽, 미국의 오대호 및 기타 지역에서 심각한 VHSV 발생이 발생하여 전세계적으로 문제가 되고 있다.
홍해 도미 이리도바이러스(red sea bream iridovirus, RSIV)는 megalocytivirus 중 하나이며, 다양한 척추 동물 및 무척추 동물에 감염될 수 있는 큰 dsDNA 게놈을 갖는다. RSIV 감염은 한국의 담수 및 해양 어종에서 발견되었으며, VHSV와 마찬가지로 물을 통해 수평으로 전염될 수 있으므로 감염률이 높다.
최근에, PCR 또는 다른 증폭 도구와 같은 분자 생물학적 방법 및 항체, 예를 들어 효소 결합 면역 흡수 분석(ELISA)에 기초한 혈청학적 방법이 대부분의 병원체 또는 미생물을 신속하게 검출하는데 사용되어 왔으며, 해양 병원체의 검출을 위한 많은 분자 생물학적 방법이 개발되었다. 일반 PCR은 해양 병원체를 검출하기 위한, 신뢰도가 높은 고전적인 분자 생물학적 방법이다. 그러나 PCR 산물은 겔 전기영동으로 시각화해야한다는 단점이 있어 시간이 오래 걸리고 기술적으로 번거로울 수 있다.
측면흐름분석(lateral flow assay, LFA)은 종이 기반 장치를 사용하여 혼합물 내의 대상 물질을 감지하는 기술이며 결과는 짧은 시간(5 ~ 30분) 내에 표시될 수 있다. PCR-LFA는 PCR과 LFA를 결합하여 PCR 산물을 빠르게 탐지하는 방법이다. 이때 PCR 산물은 유전자-특이적 프라이머 세트에 의해 이중-표지된다. 그리고 테스트 및 대조 라인을 보유한 측면흐름 스트립의 표면에서 이 표지된 PCR 산물을 인식함으로써 검출이 수행된다. PCR-LFA에는 몇 가지 장점이 있다. 이 방법은 기존의 PCR-겔 전기영동 방법보다 간단하여 최소한의 간단한 교육을 거친 인원만 있으면 가능하다. 또한 PCR-LFA는 현장 진단이 가능하여 현장 환경에서 병원체를 빠르고 쉽게 탐지 할 수 있다.
본 발명자는 PCR을 이용하여 상기와 같이 심각한 문제가 되고 있는 VHSV 및 RSIV와 같은 해양 바이러스를 검출할 수 있는 방법, 특히 측면흐름분석을 적용할 수 있는 방법을 개발함으로써 현지에서 누구나 쉽고 빠르게 이들 바이러스의 오염 여부를 확인할 수 있도록 하여 이들 바이러스에 의한 오염 및 확산을 보다 용이하게 관리할 수 있도록 하고자 하였다.
Al-Hussinee, L, and Lumsden, J (2011): Detection of VHSV IVb within the gonads of Great Lakes fish using in situ hybridization. Diseases of Aquatic Organisms 95, 81-86.
따라서 본 발명의 주된 목적은 PCR, 특히 측면흐름분석법이 함께 적용되는 방법을 사용하여 간단하고 빠르게 VHSV 및 RSIV와 같은 해양 바이러스를 검출할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 검출 방법에 적용하기 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 a) 시료로부터 DNA 또는 RNA를 분리하는 단계; b) 시료로부터 분리된 DNA; 또는 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 하여 합성된 cDNA;를 주형으로 하고, 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 제1프라이머 세트; 및 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 제2프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 c) 상기 중합효소연쇄반응으로 생성된 증폭산물 중 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 해양 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 94 내지 96℃에서 20 내지 40초간의 변성, 54 내지 56℃에서 20 내지 40초간의 어닐링 및 71 내지 73℃에서 20 내지 40초간의 연장을 30 내지 40사이클 반복하는 조건으로 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 b)단계에서 서로 다른 표지물질로 표지된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하고, 상기 c)단계에서 상기 정방향 프라이머의 표지물질 및 역방향 프라이머의 표지물질이 모두 포함된 증폭산물을 검출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 측면흐름검출법을 사용하여 상기 c)단계의 검출을 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 해양 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 해양 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 프라이머 세트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 제1프라이머 세트; 및 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 제2프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 해양 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 제1프라이머 세트; 및 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 제2프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 해양 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 키트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명에 따르면 PCR을 사용하여 간단하고 신속하며 높은 정확도로 VHSV 및 RSIV와 같은 해양 바이러스를 검출할 수 있다. 특히, 본 발명의 검출 방법, 프라이머 세트, 조성물, 키트는 측면흐름분석법에 적용할 수 있어 검출의 편의성을 더욱 높일 수 있다. 이에 따라 본 발명의 검출 방법, 프라이머 세트, 조성물 및 키트는 상기와 같은 해양 바이러스의 오염 및 확산을 방지하는데 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 표적 바이러스의 게놈 상에서 본 발명 프라이머의 위치를 나타낸 것이다. A: RSIV, B: VHSV.
도 2는 본 발명의 일실시예에 적용된 PCR 및 측면흐름분석의 원리를 나타낸 것이다. A: PCR, B: 측면흐름분석.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 PCR 이후 아가로스 겔 전기영동에 의한 결과를 나타낸 것이다. A: RSIV 프라이머 사용, B: VHSV 프라이머 사용, NTC: 대조군(no template control), NNV: nervous necrosis virus, RSIV: red sea bream iridovirus, VHSV: viral hemorrhagic septicemia virus, EHNV: epizootic haematopoietic necrosis virus, IHNV: infectious haematopoietic necrosis virus, ISAV: infectious salmon anemia virus, KHV: koi herpesvirus, SAV: salmon alphavirus, SVC: spring viraemia of carp, IHHNV: infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, WSSV: white spot syndrome virus, YHV: yellow head virus 1, MrNV: macrobrachium rosenbergii nodavirus, LSNV: laem-singh virus, CCV: channel catfish virus, GIV: grouper iridovirus, AbHV: abalone herpesvirus, OsHV: osteroid herpesvirus 1, BP: baculovirus penaei.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 PCR 이후 LFA에 의한 결과를 나타낸 것이다. A: RSIV 프라이머 사용, B: VHSV 프라이머 사용, NTC: 대조군(no template control), NNV: nervous necrosis virus, RSIV: red sea bream iridovirus, VHSV: viral hemorrhagic septicemia virus, EHNV: epizootic haematopoietic necrosis virus, IHNV: infectious haematopoietic necrosis virus, ISAV: infectious salmon anemia virus, KHV: koi herpesvirus, SAV: salmon alphavirus, SVC: spring viraemia of carp, IHHNV: infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, WSSV: white spot syndrome virus, YHV: yellow head virus 1, MrNV: macrobrachium rosenbergii nodavirus, LSNV: laem-singh virus, CCV: channel catfish virus, GIV: grouper iridovirus, AbHV: abalone herpesvirus, OsHV: osteroid herpesvirus 1, BP: baculovirus penaei.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 주형 DNA 농도별 PCR 이후 아가로스 겔 전기영동 또는 LFA에 의한 결과를 나타낸 것이다. A: RSIV 프라이머 사용, B: VHSV 프라이머 사용, 상단: 아가로스 겔 전기영동 결과, 하단: LFA 결과, T: 테스트 라인, C: 대조 라인.
도 6은 물고기 조직을 대상으로 한 본 발명의 일실시예에 따른 PCR 이후 아가로스 겔 전기영동 또는 LFA에 의한 결과를 나타낸 것이다. A: RSIV 프라이머 사용, B: VHSV 프라이머 사용, 상단: 아가로스 겔 전기영동 결과, 하단: LFA 결과, T: 테스트 라인, C: 대조 라인.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명은 해양 바이러스의 검출을 위해 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트(제1프라이머 세트); 및 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트(제2프라이머 세트); 중에서 선택된 프라이머 세트를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프라이머는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 적합하도록 설계된 것이며, 특히 측면흐름분석법(lateral flow assay, LFA)에 적용될 수 있어, 매우 간단하고 신속한 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 표적 해양 바이러스 유래의 DNA에 특이적으로 결합하여 이들 프라이머의 결합 부위 사이를 중합효소가 증폭하도록 유도할 수 있다.
본 발명의 제1프라이머 세트는 해양 바이러스인 홍해 도미 이리도바이러스(red sea bream iridovirus, RSIV)를 검출하기 위한 프라이머 세트, 제2프라이머 세트는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)를 검출하기 위한 프라이머 세트로 설계된 것이다.
본 발명에서 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 종류의 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이러한 표지물질을 이용하면 상기와 같은 표적 증폭산물의 존재 여부를 보다 용이하게 확인할 수 있다. 이때 상기 표지물질은 올리고뉴클레오티드의 표지에 사용되는 통상의 표지물질일 수 있으며, 예를 들어 비오틴(biotin) 및 FAM(fluorescein amidites)일 수 있다.
상기와 같은 표지물질을 이용할 경우, 특히 측면흐름분석법에 용이하게 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 정방향 프라이머의 표지물질을 검출할 수 있는 검출물질 및 상기 역방향 프라이머의 표지물질을 검출할 수 있는 검출물질을 함유하여 각각의 표지물질의 검출을 가시적으로 확인할 수 있는 측면흐름 딥스틱을 사용할 수 있다. 이때 상기 검출물질은 예를 들어 표지물질에 대한 항체일 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 a) 시료로부터 DNA 또는 RNA를 분리하는 단계; b) 시료로부터 분리된 DNA; 또는 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 하여 합성된 cDNA;를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 c) 상기 PCR로 생성된 증폭산물 중 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하여 이루어진다.
상기 a)단계는 해양 바이러스의 감염이 의심되는 시료로부터 상기 바이러스의 유전체인 DNA 또는 RNA를 분리하기 위한 단계로 시료로부터 DNA 또는 RNA를 분리하기 위해 사용되는 통상의 방법을 적용할 수 있다.
RSIV는 DNA 바이러스이므로 제1프라이머 세트를 사용하여 RSIV를 검출하고자 하는 경우에는 DNA를 분리하는 방법을 사용하고, VHSV는 RNA 바이러스이므로 제2프라이머 세트를 사용하여 VHSV를 검출하고자 하는 경우에는 RNA를 분리하는 방법을 사용할 수 있다. 또한, VHSV의 경우에는 RNA를 분리한 다음 이를 cDNA로 합성하는 단계를 추가할 필요가 있다.
상기 b)단계는 상기 a)단계에서 분리된 DNA 또는 상기 cDNA로부터 해양 바이러스 유래의 DNA를 증폭하기 위한 단계로 본 발명의 프라이머와 함께 중합효소(polymerase)를 사용하는 통상의 PCR을 사용하여 수행할 수 있다.
이때 보다 효율적인 증폭을 위하여 PCR 조건을 94 ~ 96℃에서 20 ~ 40초간의 변성, 54 ~ 56℃에서 20 ~ 40초간의 어닐링 및 71 ~ 73℃에서 20 ~ 40초간의 연장을 30 ~ 40사이클 반복하는 조건으로 수행하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 94.5 ~ 95.5℃에서 25 ~ 35초간의 변성, 54.5 ~ 55.5℃에서 25 ~ 35초간의 어닐링 및 71.5 ~ 72.5℃에서 25 ~ 35초간의 연장을 33 내지 37사이클 반복하는 조건으로 수행하는 것이 좋다.
상기 c)단계는 상기 b)단계에서 증폭되는 표적 증폭산물을 검출하는 단계로 중합효소에 의해 증폭된 증폭산물을 검출하기 위한 통상의 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 아가로스 겔 전기영동 등을 사용할 수 있으나, 보다 간단하고 신속한 검출을 위해 측면흐름분석법을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 표적 증폭산물은 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 포함된 형태이므로, 이를 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명은 상기 프라이머를 포함하여 상기와 같은 해양 바이러스 검출 방법에 적용할 수 있는 프라이머 세트, 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 해양 바이러스 검출용 조성물은 본 발명의 프라이머 이외에도 이들을 안정화시키기 위한 완충액, PCR에 사용되는 시약 등이 더 포함될 수 있으며, 다른 표적의 증폭을 위한 프라이머 또는 프로브도 포함될 수 있다.
본 발명의 해양 바이러스 검출용 키트는 본 발명의 프라이머 이외에 PCR에 사용되는 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있으며, 다른 표적의 증폭을 위한 프라이머 또는 프로브도 포함될 수 있다. 특히, 측면흐름 딥스틱과 같이 표적 증폭산물을 간단한 방법으로 신속하게 검출할 수 있는 기구가 포함되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 방법
1-1. 주형 DNA 준비
홍해 도미 이리도바이러스(red sea bream iridovirus, RSIV)의 표면 단백질(CP) 유전자를 PCR-LFA를 사용한 RSIV 검출의 대상 유전자로 이용하였다. CP는 많은 바이러스에서 중요하고 일반적인 단백질 중 하나이다. 단백질은 바이러스 감염 동안 생산되므로, 그 유전자는 표적 검출을 위한 훌륭한 후보이다. 다수의 RSIV 균주로부터 완전한 CP 유전자의 서열을 확인하였고, 보존된 영역을 대상 유전자로 사용하였다. 이 유전자는 Macrogen에 의뢰하여 합성하였다. 합성 후, RSIV CP 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하여 삽입하였다(도 1 참조).
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 경우, 표면 당 단백질(G) 유전자를 PCR-LFA를 사용한 검출의 대상으로 사용하였다. 다양한 VHSV 균주로부터 G 유전자 서열을 분석하였고, 매우 보존된 영역을 표적 유전자로 사용하였다. 이 유전자를 Bioneer에 의뢰하여 합성한 후 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다(도 1 참조).
다른 17가지 해양 바이러스에 대한 부분 유전자[NNV, Nervous necrosis virus; EHNV, Epizootic haematopoietic necrosis virus(AY187045.1); IHNV, Infectious haematopoietic necrosis virus(X89213.1); ISAV, Infectious salmon anemia virus(NC_006499.1); KHV, Koi herpesvirus(DQ177346.1); SAV, Salmon alphavirus(JQ799139.1); SVC, Spring viraemia of carp(NC_002803.1); IHHNV, Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus(NC_002190.2); WSSV, White spot syndrome virus(AY126666); YHV, Yellow head virus 1(EU487200.1); MrNV, Macrobrachium rosenbergii nodavirus(AY222840.1); LSNV, Laem-singh virus(DQ127905.1); CCV, Channel catfish virus(NC_001493.2); GIV, Grouper iridovirus(KX284838); AbHV, Abalone herpesvirus(NC_018874.1); OsHV, Osteroid herpesvirus 1(NC_005881.2); 및 BP, Baculovirus penaei(DQ496179.1)]를 마크로젠에서 합성하고 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하여 특이성 테스트에서 주형으로 사용하였다.
1-2. 플라스미드 DNA 분리
RSIV 및 VHSV 표적 유전자를 함유하는 E. coli 콜로니를 진탕 배양기에 넣고 15시간 동안 37℃에서 1%의 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 배양하였다. 배양된 대장균을 얻은 후, AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit(Bioneer)로 플라스미드를 추출하였다. 키트에 포함된 elution buffer를 이용해 확보한 플라스미드를 PCR 및 PCR-LFA 주형으로 사용하였다.
1-3. 프라이머 및 PCR-LFA
각 바이러스의 유전자 서열 정보를 기반으로 표 1과 같은 프라이머를 설계하였다.
프라이머명 프라이머 서열
RSIV F 5'-FAM-aacgtaaccagtgggttca tc-3'
RSIV R 5'-Biotin-atgggcaaattaaggtaggcg-3'
VHSV F 5'-FAM-aagggcttggtctctgtcc-3'
VHSV R 5'-Biotin-aggcagtgatatcactgtgg-3'
PCR용 반응 혼합물은 10㎕의 AccuPower® PCR PreMix & Master Mix(Bioneer, Korea), 7㎕의 증류수, 1㎕의 주형 DNA 및 각 프라이머를 10pmol의 농도로 혼합하여 총 20㎕로 제조하였다.
PCR 조건은 다음과 같은 조건으로 하였다 : 95℃에서 5분 동안 개시 변성(initial denaturation); 95℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 55℃에서 30초 동안(annealing), 72℃에서 30초 동안 연장(extension), 35사이클; 및 72℃에서 5분 동안의 최종 연장(final extension). 증폭된 대상 유전자의 검출을 위해 EtBr를 함유하는 1% 아가로스 겔에서 PCR 생성물을 전기영동하였다. 아가로스 겔 전기영동 후, PCR 산물을 시퀀싱에 의해 확인하였다. 시퀀싱은 Macrogen에 의뢰하여 수행하였으며, 시퀀싱 결과는 NCBI GenBank에서 RSIV 및 VHSV 유전자의 알려진 서열과 비교하였다.
측면흐름분석(lateral flow assay, LFA)에는 Genline Hybridetect 1 스트립(Milenia Biotec, Gieβen, Germany)을 사용하였다. 상기 PCR 후의 PCR 산물을 LFA에 사용하였고, LFA를 위한 샘플은 1㎕의 PCR 산물을 99㎕의 Dipstick Assay Buffer에 첨가하여 제조하였다. PCR 산물과 Dipstick Assay Buffer를 혼합한 후, 스트립을 혼합물에 침지시키고 10분 동안 실온에서 반응시켰다. PCR-LFA의 결과는 육안으로 테스트 및 대조 라인을 검사함으로써 확인하였다(도 2 참조).
1-4. 어류 시료를 사용한 PCR-LFA
넙치(Paralichthys olivaceus)의 조직 시료를 사용하여 PCR-LFA를 시도하였다. 바이러스 게놈은 바이러스 DNA/RNA 추출 키트를 사용하여 추출하였다.
RSIV 검출에서는 추출한 DNA를 직접 주형으로 사용하여 PCR-LFA를 수행하였고, VHSV 검출에서는 추출된 RNA를 SuPrimeScript RT-PCR Premix의 템플릿으로 사용하여 cDNA로 합성한 다음 주형으로 사용하였다.
cDNA 합성을 위한 반응 혼합물은 최종 20㎕를 맞추기 위해 증류수 7㎕, 주형 1㎕ 및 각 프라이머의 농도 10pmol로 준비하였고, 50℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후의 과정은 상기 PCR 방법과 동일하였다. 결과는 아가로스 겔 전기영동 및 LFA의 두 가지 모두를 이용하여 확인하였다.
2. 결과
2-1. 프라이머 세트의 특이성
증폭된 PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동하고, DNA 밴드를 EtBr에 의해 시각화한후 예상했던 밴드 크기와 비교하여 확인하였다. 예상되었던 목표 밴드 크기는 RSIV의 경우 319bp, VHSV의 경우 302bp였다.
각 바이러스 유전자가 클로닝된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 PCR한 결과 RSIV 및 VHSV 모두에 대해 명확하고 적절한 크기의 밴드가 관찰되었다(도 3 참조). 이들 PCR 결과는 프라이머 세트가 각각의 표적 바이러스 유전자에 대해 특이성을 갖고, 18개의 다른 해양 바이러스 유전자에 대해 교차 반응성이 없다는 것을 나타낸다.
2-2. PCR-LFA 특이성
PCR-LFA를 시험하기 위해, 5'-FAM 표지된 정방향 프라이머 및 5'-비오틴 표지된 역방향 프라이머를 사용하였다. PCR-LFA에 대해 전술한 것과 동일한 PCR 방법을 사용하였고, 1㎕의 PCR 산물을 99㎕의 딥스틱 분석 완충액과 혼합하였다. LFA 스트립이 혼합물에 침지된 후 10분 안에 결과를 확인할 수 있었다(도 4 참조). PCR-LFA 결과는 통상적인 PCR의 결과만큼 신뢰할 수 있는 것으로 나타났다.
2-3. PCR-LFA 감도
200ng ~ 2fg의 각 바이러스 유전자 함유 플라스미드의 연속적 희석액을 제조하였다. 이들 희석액을 PCR-LFA 감도와 종래의 PCR의 감도를 비교하기 위해 주형으로 사용하였다.
이의 결과, 통상적인 PCR은 2fg까지의 RSIV 주형 및 200fg까지의 VHSV 주형을 검출할 수 있었다. PCR-LFA는 RSIV 및 VHSV 주형 모두 2fg까지를 검출할 수 있었다(도 5 참조). 이들 결과는 이들 두 바이러스를 대상으로 하는 PCR-LFA가 적어도 일반적인 PCR만큼 민감하고, 상황에 따라 더 민감할 수 있음을 나타낸다.
2-4. 바이러스 감염 물고기의 진단
바이러스에 감염된 물고기 조직에서의 진단도 잘 작동하는지 여부를 확인하기 위해 건강한 넙치, RSIV 감염 및 VHSV 감염 넙치를 사용하였다.
각 물고기로부터 근육 조직을 수득하고, 바이러스성 DNA 및 RNA를 추출하였다. PCR(RSIV의 경우) 및 RT-PCR(VHSV의 경우)을 수행하고 아가로스 겔 전기영동 및 LFA를 이용하여 각각 결과를 확인하였다.
이의 결과, PCR-LFA를 사용한 진단이 바이러스 유전자 함유 플라스미드뿐만 아니라 감염된 물고기 시료에서도 신뢰할 수 있는 것으로 나타났다(도 6 참조).
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Method for detecting maritime virus, and primer set, composition and kit for the same <130> 04 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 aacgtaacca gtgggttcat c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 atgggcaaat taaggtaggc g 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 aagggcttgg tctctgtcc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 aggcagtgat atcactgtgg 20

Claims (16)

  1. a) 시료로부터 DNA 또는 RNA를 분리하는 단계;
    b) 시료로부터 분리된 DNA; 또는 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 하여 합성된 cDNA;를 주형으로 하고,
    서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    c) 상기 중합효소연쇄반응으로 생성된 증폭산물 중 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV) 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 중합효소연쇄반응은 94 내지 96℃에서 20 내지 40초간의 변성, 54 내지 56℃에서 20 내지 40초간의 어닐링 및 71 내지 73℃에서 20 내지 40초간의 연장을 30 내지 40사이클 반복하는 것을 특징으로 하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 검출 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 b)단계에서 서로 다른 표지물질로 표지된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하고,
    상기 c)단계에서 상기 정방향 프라이머의 표지물질 및 역방향 프라이머의 표지물질이 모두 포함된 증폭산물을 검출하는 것을 특징으로 하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 검출 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    측면흐름검출법을 사용하여 상기 c)단계의 검출을 수행하는 것을 특징으로 하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 검출 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
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  8. 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV) 검출용 프라이머 세트.
  9. 삭제
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  11. 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV) 검출용 조성물.
  12. 삭제
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  14. 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV) 검출용 키트.
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