KR102424329B1 - 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출방법 - Google Patents

토마토 반점 위조 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출방법 Download PDF

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Abstract

토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 경우, 단일 서열 DNA 결합 단백질 (Single strand DNA binding protein, SSB)와 재조합효소 (Recombinase)를 이용하여 빠르게 특정 염기서열을 증폭할 수 있으며, 역전사효소 (Reverse transcriptase)를 첨가함으로써 RNA 바이러스를 별도의 cDNA 합성과정 없이 한 번의 과정으로 증폭이 가능하며, 등온 조건에서 반응이 가능하기 때문에 온도 순환기 장비 없이도 식물의 바이러스 검출이 가능하고, 바이러스 특이적인 엔에프오 프로브와 래터럴 플로우 스트립을 사용하여 육안으로 증폭여부를 확인하여 식물의 바이러스 검출이 가능함으로써, 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

토마토 반점 위조 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출방법{Primer Set for recombinase polymerase amplification reaction for detecting Tomato spotted wilt virus and Method for detecting Tomato spotted wilt virus using the same}
본 발명은 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트 또는 이의 혼합물을 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
전 세계적인 지구 온난화로 인하여 새로운 바이러스의 출현과 피해가 급증하고 있으며, 특히 식물 바이러스는 많은 식물체에 병을 유발하고 각종 농작물의 생산량 및 품질 저하와 품종 퇴화 등 농업 생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다.
고추에 발생하는 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV)는 우리나라에서는 처음으로 20004년에 예산에 있는 파프리카 재배농가에서 발행하였으며, 현재는 주로 노지 고추 재배지에서 발생한다. 토마토 반점 위조 바이러스는 기주 범위가 넓어 고추뿐만 아니라 토마토, 파프리카, 국화 등 166종의 작물에서 발생하고 있다. 토마토 반점 위조 바이러스에 감염된 고추는 잎에 괴사증상이 나타나고 과실의 크기가 작아지며, 기형이 되고 색이 얼룩덜룩하여 고르게 착색이 되지 않기 때문에 상품성이 전혀 없다. 따라서, 농가에서는 토마토 반점 위조 바이러스의 피해를 예방하기 위해 농약 살포에 의존하고 있으나, 그 예방에 있어 큰 어려움을 겪고 있다.
현재 토마토 반점 위조 바이러스를 검출하기 위해서 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)의 기법을 이용하고 있다. 그러나 RT-PCR은 온도 변화가 가능한 고가의 장비 (Thermocycler)가 필요하고 평균 90분의 검출 시간이 걸리기 때문에 신속한 검출이 어렵다. 또한, 증폭 여부를 전기 영동을 통해 확인하여야 하기 때문에 추가적인 장비와 시간이 요구된다.
이러한 단점들을 보완할 수 있는 기술이 래터럴 플로우 (Lateral flow, LF) 스트립 기반의 RT-PCR방법이다. LF-스트립 기반 RT-RPA 방법은 바이러스 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 DNA 바인딩 단백질 (DNA binding protein)과 재조합효소 (Recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟하는 염기서열을 증폭시킬 수 있고, bsu DNA 폴리머라제를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하다. 또한, 역전사 효소 (Reverse transcriptase)를 첨가함으로써 RNA 바이러스인 토마토 반점 위조 바이러스를 별도의 cDNA 합성과정 없이 한번의 과정으로 증폭이 가능하다. 그리고 전기 영동을 통해 증폭여부를 확인했던 일반적인 PCR, RPA 방법과는 다르게 바이러스 특이적인 엔에프오 (nfo) 프로브와 래터럴 플로우 스트립을 사용하여 육안으로 증폭여부를 확인할 수 있어, 빠르고 간편하게 현장에서 검출할 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 토마토 반점 위조 바이러스를 검출하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 래터럴 플로우 스트립 (Lateral flow (LF) strip) 기반 RT-RPA의 방법의 경우, 단일 서열 DNA 결합 단백질 (Single strand DNA binding protein, SSB)와 재조합효소 (Recombinase)를 이용하여 빠르게 특정 염기서열을 증폭할 수 있으며, 역전사효소 (Reverse transcriptase)를 첨가함으로써 RNA 바이러스를 별도의 cDNA 합성과정 없이 한 번의 과정으로 증폭이 가능하며, 등온 조건에서 반응이 가능하기 때문에 온도 순환기 장비 없이도 식물의 바이러스 검출이 가능하고, 바이러스 특이적인 엔에프오 (nfo) 프로브와 래터럴 플로우 스트립을 사용하여 육안으로 증폭 여부를 확인하여 식물의 바이러스 검출이 가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토마토 반점 위조 바이러스 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 토마토 반점 위조 바이러스를 검출하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 래터럴 플로우 스트립 (Lateral flow (LF) strip) 기반 RT-RPA의 방법의 경우, 단일 서열 DNA 결합 단백질 (Single strand DNA binding protein, SSB)와 재조합효소 (Recombinase)를 이용하여 빠르게 특정 염기서열을 증폭할 수 있으며, 역전사효소 (Reverse transcriptase)를 첨가함으로써 RNA 바이러스를 별도의 cDNA 합성과정 없이 한 번의 과정으로 증폭이 가능하며, 등온 조건에서 반응이 가능하기 때문에 온도 순환기 장비 없이도 식물의 바이러스 검출이 가능하고, 바이러스 특이적인 엔에프오 프로브와 래터럴 플로우 스트립을 사용하여 육안으로 증폭여부를 확인하여 식물의 바이러스 검출이 가능함을 규명하였다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명의 다른 일 예는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 역방향 프라이머는 서열번호 2의 염기서열의 5'말단이 형광 분자 또는 비오틴 (BIOTIN)으로 표지 된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형광 분자 또는 비오틴 (BIOTIN)은 래터럴 플로우 스트립 (Lateral flow detection strip)의 테스트 라인 (Test line) 부분의 이차 항체 (Secondary antibody)와 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 프로브는 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)가 부착되거나, 34번째 서열 및 35번째 서열 사이에 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran; THF)이 삽입되거나, 또는 3'말단에 C3-Spacer가 부착된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 부착된 플루오레세인아미다이트는 안티-FAM 항체 (Au labelled anti-FAM antibody)와 결합하여 형광을 방출할 수 있으며, 형광 방출은 래터럴 플루우 스트립 내 테스트 라인 (Test line)에서 육안으로 관찰이 가능하다.
본 발명에 있어서 서열번호 3의 염기서열의 34번째 서열 및 35번째 서열 사이에 삽입된 테트라하이드로퓨란은 대장균 엔도 뉴클레아제 (nfo)에 의해 인식된 후 절단되며, 3'말단에서 연장되는 Bsu 중합 효소를 통해 앰플리콘으로 통합된다.
본 발명에 있어서 서열번호 3의 염기서열의 3'말단에 부착된 C3-Spacer는 증폭이 시작되기 전에 5'말단에 부착된 플루오레세인아미다이트와 인접하여 형광을 흡수하는 역할을 한다. 부착된 C3-Spacer가 형광을 흡수하기 때문에 서열내의 형광을 확인할 수 없지만, 증폭이 시작되면 3'말단에 부착된 C3-Spacer는 대장균 엔도 뉴클레아제 (nfo)에 의해 같이 절단되므로 플루오레세인아미다이트가 형광을 방출할 수 있게 된다. 절단 이후, Bsu 중합 효소를 통해 5'말단에는 플루오레세인아미다이트가 3'말단에는 비오틴이 부착된 앰플리콘이 생성되게 된다.
본 명세서에서 용어 "토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, 이하, TSWV)는 우리나라에는 처음으로 2004년에 예산에 있는 파프리카 재배농장에서 발생하였으며, 현재는 노지 고추 재배지에서 전국적으로 발생하고 있다. 꽃노랑총채벌레, 꽃송이총채벌레, 담배총채벌레, 엉겅퀴총채벌레 및 파총채벌레 등 많은 종의 총채벌레에 의하여 전염된다. 토마토 반점 위조 바이러스에 감염된 고추는 잎에 괴사증상이 나타나고 과실의 크기가 작아지며 기형이 되고 색이 얼룩덜룩하여 고르게 착색이 되지 않는다. 고추 잎에 원형반점이 생기고, 생장점이 오그라들며 누렇게 위축되다 결국 말라 죽게 되므로 이를 예방하기 위한 정밀 진단이 반드시 필요하다.
본 발명에 있어서 검출은 예를 들어, 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA) 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 증폭산물을 얻는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘 (amplicon)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소 (mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단 시간 안에 바이러스를 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 다른 일 예는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 역방향 프라이머는 서열번호 2의 염기서열의 5'말단이 형광 분자 또는 비오틴 (BIOTIN)으로 표지 된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 프로브는 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)가 부착되거나, 34번째 서열 및 35번째 서열 사이에 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran; THF)이 삽입되거나, 또는 3'말단에 C3-Spacer가 부착된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 키트는 시료로부터 토마토 반점 위조 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 키트에 투입되는 시료는 예를 들어, 검체의 종자 (씨), 과실 또는 잎이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 키트는 RPA 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 각각의 상기 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 키트가 RPA 분석에 사용되는 경우, 별도로 cDNA를 수득할 필요없이 시료로부터 바로 RPA 증폭산물을 수득하여 아가로오스 겔 전기 영동(agarose gel electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머 세트에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 바이러스를 검출할 수 있다.
특히 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 검출용 키트의 경우, 각각의 프라이머 세트를 사용하는 검출이 별도로 수행될 수도 있고, 다수의 프라이머 세트를 하나의 반응에 혼합 사용하여 검출이 수행될 수도 있다.
본 발명에 있어서 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 용기 (예를 들어, 일회용 RPA 튜브 등)에 담겨 있는 동결 건조된 (lyophilized) 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 키트가 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 경우 다수의 프라이머 세트가 혼합되어 RPA 튜브에 담겨 있을 수도 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 하기의 단계를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) 검출 방법에 관한 것이다:
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트;
를 이용하여 시료로부터 역전사 재조합-중합효소 증폭법 (Reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계.
본 발명에 있어서 증폭 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
서열번호 2의 염기서열의 5'말단을 형광 분자 또는 비오틴 (BIOTIN)으로 표지하는 역방향 프라이머 준비 단계; 및
서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)을 부착하거나, 34번째 서열 및 35번째 서열 사이에 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran; THF)을 삽입하거나, 또는 3'말단에 C3-spacer를 부착하는 프로브 준비 단계.
본 발명에 있어서 증폭 단계는 30 내지 45 ℃, 30 내지 42 ℃, 30 내지 39 ℃, 33 내지 45 ℃, 33 내지 42 ℃, 33 내지 39 ℃, 36 내지 45 ℃, 36 내지 42 ℃, 36 내지 39 ℃, 예를 들어, 38 ℃에서 증폭 단계를 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 증폭 단계는 20 내지 40분, 20 내지 35분, 20 내지 30분, 25 내지 40분, 25 내지 35분, 25 내지 30분, 예를 들어, 30분 동안 배양을 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 증폭 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
RT-RPA 증폭산물을 스트립 (strip)으로 분석하는 분석 단계.
본 발명에 있어서 스트립은 항체나 분석 대상 물질이 고체 표면에 입혀진 형태로 신속하게 정성 시험분석을 할 수 있다. 짐작되는 샘플이 막 이용 스트립의 하나의 단부 가까이에 위치되는 막 이용 검사 장치이다. 샘플은 액체의 상태로 모세관 작용에 의해 막 스트립을 횡단하여 막 스트립의 반대 단부로 운반된다. 막 스트립을 횡단하는 동안, 검사 샘플 내의 분석 대상 물질이 존재한다면 하나 이상의 포획 시약과 충돌하여 검출 가능한 신호를 생성한다.
본 발명에 있어서 스트립은 래터럴 플루오 스트립 (Lateral flow strip)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 래터럴 플루오 스트립은 샘플 패드 (Sample pad)부분, 콘쥬게이션 패드 (conjugation pad), 테스트 라인 (Test line) 및 컨트롤 라인 (Control line)으로 구성된다. 샘플 패드 부분에 분주된 시료는 접합체 콘쥬게이션 패드로 흘러간다. 접합체 패드에는 항원과 항체 간의 최적화된 화학 반응에 필요한 시약인 안티-FAM 항체 (Au labelled anti-FAM antibody)가 포함되어 있다. 시약에 포함되어 있는 안티-FAM 항체는 시료에 포함되어 있는 FAM (Fluorescein amidite; FAM)과 결합하게 된다. 시약과 결합한 시료는 테스트 라인 쪽으로 흘러가고, 시료에 포함되어 있는 비오틴이 테스트 라인에 고정되어 있는 이차 항체 (Secondary antibody)와 결합한다. 테스트 라인에 이차 항체과 비오틴, FAM과 안티-FAM 항체의 결합은 형광을 방출하게 되고 뚜렷한 밴드를 형성한다. 테스트 라인을 거친 시료는 컨트롤 라인 쪽으로 계속 흘러간다. 흘러가는 시료는 컨쥬게이션 패드에서 혼합된 시약 성분 중 안티-FAM 항체를 계속 포함하고 있다. 시료에 포함된 안티-FAM 항체는 컨트롤 라인에 부착된 안티-비오틴 항체와 결합하여 밴드를 형성하게 된다. 최종적으로 도달하는 컨트롤 라인은 컨쥬게이션 패드에 포함하는 시약인 안티-FAM 항체가 흘러가서 결합하는 것이기 때문에 RT-RPA 증폭 여부와 관계없이 래터럴 플루오 스트립이 잘 작동하는지 확인하는 역할을 한다.
본 발명에 있어서 분석단계는 상기 증폭산물로 TSWV 검출 여부를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 분석단계는 본 발명의 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)에 의해 증폭된 250 bp의 증폭산물을 확인하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 시료는 고추, 토마토, 방울 토마토, 파프리카, 시금치, 치커리, 적치커리, 적겨자, 용설채, 트레비소, 감자, 들깨, 참깨, 호박 및 국화로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 시료는 예를 들어, 검체의 종자 (씨), 과실 또는 잎이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함한 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 키트와 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명은 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 래터럴 플로우 스트립 (Lateral flow (LF) strip) 기반 RT-RPA의 방법은 단일 서열 DNA 결합 단백질 (Single strand DNA binding protein, SSB)와 재조합효소 (Recombinase)를 이용하여 빠르게 특정 염기서열을 증폭할 수 있으며, 역전사효소 (Reverse transcriptase)를 첨가함으로써 RNA 바이러스를 별도의 cDNA 합성과정 없이 한 번의 과정으로 증폭이 가능하며, 등온 조건에서 반응이 가능하기 때문에 온도 순환기 장비 없이도 식물의 바이러스의 검출이 가능하고, 바이러스 특이적인 엔에프오 프로브와 래터럴 플로우 스트립을 사용하여 육안으로 증폭여부를 확인하여 식물의 바이러스 검출이 가능함으로써, 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실험예에 따른 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, 이하, TSWV)의 외피 단백질 (Coat protein, CP)내의 프라이머 서열의 위치를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)를 이용한 LF RT-RPA 반응 결과 (증폭물)를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)를 이용한 온도에 따른 LF RT-RPA 반응 결과 (증폭물)를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)를 이용하여, 시간 경과 (1, 5, 10, 15 및 20분)에 따라 LF RT-RPA 반응 결과 (증폭물)를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)를 이용하여, TSWV 특이적인 프라이머 및 프로브의 특이성을 확인한 LF RT-RPA 반응 결과 (증폭물)를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)를 이용한 RT-RPA와 RT-PCR의 민감도를 비교한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)를 이용하여, 고추 재배지에서 채집한 고추 잎 추출 시료의 RT-RPA 및 RT-PCR 반응 결과를 비교하여 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
제조예. 프라이머 세트의 제조
우리나라 철원 지역에서, 전형적인 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus; 이하 TSWV)병 증상을 보이는 고추를 선별하여 잎 샘플을 채취하였다.
IQeasy+ 식물 RNA 추출 미니 키트(iNtRON, Korea)를 사용하여 잎 조직에서 Total RNA를 추출하였다. TSWV의 감염에 대해 양성인 샘플을 선택하여 RT-RPA (Reverse transcription RPA) 분석 템플릿으로 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관하였다.
상기 TSWV의 염기 서열(sequence)을 확보하고, 이를 바탕으로 보존되어 있는 염기서열 부분을 확인하였다.
보다 구체적으로, NCBI Basic Local Alignment Search Tool로부터 확보한 TSWV의 국내외 18개의 분리주의 외피 단백질(coat protein; CP)의 염기서열 (GenBank MK605252, MF159073, MG257896, MN064724, MF159066, KY021439, MF159068, LC273307, MF417648, MF159062, KU179571, KU179541, KU179537, MG983521, MG983519, MG878875, 및 MF688996)의 다중서열배치 (multiple sequence alignment, 도 1)에서, 고도로 보존된 영역을 선택하고 이를 이용하여 RT-RPA를 위한 프라이머 세트를 제작하였다. 구체적으로, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 염기서열의 5'말단에 비오틴 (BIOTIN)이 부착하여 역방향 프라이머 세트를 제작하였다. 또한, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)을 부착하고, 34번째 염기서열과 35번째 염기서열 사이에 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran; THF)을 삽입하고, 3'말단에 C3-Spacer를 부착하여 프로브를 제작하였다.
제작한 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 명명 염기서열(5'-3') 예상 산물 길이
(bp)
1 TSWV-Fwd GTATAGCAGCATACTCTTTCCCTTTCTTCACC 250 bp
2 TSWV Rev GATGCAAAGTCTGTGAGGCTTGCCATAATGCT
3 TSWV-nfo prove GTCATACTTCTTTGGATCGATCCCGAGGTCT
TTGATTTTGCATCCTGAT
실험예 1. 래터럴 플로우 스트립 기반 RT-RPA 반응 가부 확인
제작한 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)를 사용하여 래터럴 플로우 스트립 (Lateral flow (LF) strip) 기반 역전사 재조합-중합효소 (Reverse transcription Recombinase polymerase amplification; 이하, RT-RPA, Twist Amp basic RT kit, TwistDx Limited)를 진행하였다.
보다 구체적으로, 마이크로 튜브에 105 nM 정방향 및 역방향 프라이머, 15 nM 프로브, 280 mM 마그네슘 아세테이트 및 TSWV 주형 가닥 1 μL를 넣고 (총 부피 50 μL), 38 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. 50배 희석한 RT-RPA 생성물은 래터럴 플로우 스트립 (Lateral flow (LF) strip, TwistDx Limited, 영국)의 샘플 패드 부분에 분주 후, 접합체 패드로 흐르게 하였다. 접합체 패드에는 항원과 항체간의 최적화된 화학 반응에 필요한 시약인 안티-FAM 항체 (Au labelled anti-FAM antibody)가 포함되어 있다. 접합체 패드를 거친 후, 생성물이 테스트 라인까지 전달될 때까지 래터럴 플로우 스트립을 5분간 상온에 두었다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, N (Negative control, 건강한 고추 잎 시료) 및 NTC (No template control, 물)는 안티-FAM 항체가 포함된 접합체 패드를 거치며 안티-FAM 항체를 컨트롤 라인에 전달하였다. 전달된 안티-FAM 항체는 컨트롤 라인에 부착되어 있는 안티-비오틴 안티 바디와 결합하여 컨트롤 라인에 밴드를 나타내었다. 반면, TSWV는 증폭되지 않았기 때문에 테스트 라인에는 밴드를 나타내지 않았다.
TSWV 감염 시료인 P (Positive)는 TSWV가 증폭되어 서열번호 2의 염기서열의 5'말단에 표지되어 있는 비오틴이 테스트 라인에 있는 이차 항체 (Secomdary antibody)와 복합체를 형성하고, 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 부착된 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)가 안티-FAM 항체와 결합하여 형광을 방출하며 테스트 라인에 선명한 밴드를 나타내었다.
이를 통하여, TSWV의 증폭 결과물은 정상적으로 생성되었으며, 래터럴 플로우 스트립에서도 잘 검출되는 것을 확인하였다.
실험예 2. 래터럴 플로우 스트립 기반 RT-RPA 반응의 최적 온도 확인
제작한 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)를 사용하여 LF RT-RPA의 최적 온도 조건을 확인하였다. 온도 조건은 32 ℃, 35 ℃, 38 ℃, 41 ℃, 44 ℃ 및 47 ℃으로 설정하고, 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 LF RT-RPA를 수행하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 38 ℃에서 가장 진한 밴드가 확인되었다. 따라서, LF RT-RPA 반응 최적 온도인 38 ℃로 이후 실험을 진행하였다.
실험예 3. 래터럴 플로우 스트립 기반 RT-RPA 반응의 최소 반응시간 확인
프라이머 세트 (TSWV F/R/P)에 대하여, 반응 시간을 1, 5, 10, 15 및 20분 (t)으로 설정하고 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 LF RT-RPA를 수행하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)에서 10분 반응하였을 때부터 예상된 사이즈에서 증폭되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 일반적인 RT-PCR보다 신속하게 TSWV를 검출할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4. 래터럴 플로우 스트립 기반 RT-RPA 반응의 특이성 확인
프라이머 세트 (TSWV F/R/P)에 대하여, TSWV 특이적인 프라이머 및 프로브의 특이성을 확인하기 위하여, 고추에서 발생하는 오이 모자이크 바이러스 (Cucumber mosaic virus; 이하, CMV), 페퍼 모틀 바이러스 (Pepper mottle virus; 이하, PepMoV), 페퍼 마일드 모틀 바이러스 (Pepper mild mottle virus; 이하, PMMoV), 잠두위조 바이러스 2 (Bean wilt virus 2; 이하, BBWV2)에 감염된 시료, 음성 대조군인 NC (Negative Control) 및 NTC (No template control)를 사용하여 TSWV 에 대한 LF RT-RPA의 특이성을 확인하였다. 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 LF RT-RPA를 수행하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, TSWV 감염 시료에서만 특이적으로 반응하여 예상된 사이즈에서 증폭되는 것을 확인하였다.
실험예 5. 래터럴 플로우 스트립 기반 RT-RPA 반응의 민감성 확인
프라이머 세트 (TSWV F/R/P)에 대하여, 기존의 RT-PCR 방법과 LF RT-RPA 방법을 비교하였다.
보다 구체적으로, TSWV에 감염된 고추잎에서 Total RNA를 추출하고, 각각 10배씩 차례대로 희석하여 RT-PCR 및 LF RT-RPA 반응을 진행하였다. LF RPA 반응은 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 진행하였으며, RT-PCR은 다음과 같이 진행하였다:
단계 1, 50 ℃에서 30 분;
단계 2, 95 ℃에서 5 분;
단계 3, 30 초 동안 95 ℃, 30 초 동안 56 ℃, 30 초 동안 72 ℃의 35 사이클;
단계 4, 72 ℃에서 5 분.
도 6에서 확인할 수 있듯이, LF RT-RPA 방법과 RT-PCR 방법은 동일한 민감도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는, LF RT-RPA 방법은 RT-PCR과 동일한 민감도를 나타내면서도 시간을 단축하여 빠르게 TSWV를 검출할 수 있음을 의미한다.
실험예 6. 고추 재배지 시료의 래터럴 플로우 스트립 기반 RT-RPA 반응 가부 확인
TSWV의 여러 종류의 검체도 검출이 가능한지 확인하기 위하여 고추 잎 재배지에서 무작위로 시료 13개를 채집하여 Total RNA를 추출였다. 추출 후, 바로 프라이머 세트 (TSWV F/R/P)로 LF RT-RPA 및 RT-PCR을 진행하여 반응 가부를 확인하였다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, LF RT-RPA 와 RT-PCR 모두 동일한 검출 결과를 나타내었다. 이를 통하여, LF RT-RPA로 고추잎 시료에서 손쉽게 TSWV를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 복잡하고 시간이 오래 소요되는 RT-PCR 보다 빠르게 검출할 수 있음을 확인하였다.
<110> University Cooperation Foundation Chonnam University <120> Primer Set for recombinase polymerase amplification reaction for detecting Tomato spotted wilt virus and Method for detecting Tomato spotted wilt virus using the same <130> PN200254 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSWV-Fwd <400> 1 gtatagcagc atactctttc cctttcttca cc 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSWV-Rev <400> 2 gatgcaaagt ctgtgaggct tgccataatg ct 32 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSWV-nfo prove <400> 3 gtcatacttc tttggatcga tcccgaggtc tttgattttg catcctgat 49

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브
    를 포함하는 역전사 재조합-중합효소 증폭법(Reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 역전사 재조합-중합효소 증폭법(Reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)용 프라이머 세트;
    를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 2의 염기서열의 5'말단이 형광 분자 또는 비오틴 (BIOTIN)으로 표지 된 것인, 검출용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)가 부착되거나, 34번째 서열 및 35번째 서열 사이에 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran; THF)이 삽입되거나, 또는 3'말단에 C3-Spacer가 부착된 것인, 검출용 조성물.
  5. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 역전사 재조합-중합효소 증폭법(Reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)용 프라이머 세트;
    를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 2의 염기서열의 5'말단이 형광 분자 또는 비오틴 (BIOTIN)으로 표지 된 것인, 검출용 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)가 부착되거나, 34번째 서열 및 35번째 서열 사이에 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran; THF)이 삽입되거나, 또는 3'말단에 C3-Spacer가 부착된 것인, 검출용 키트.
  8. 하기의 단계를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) 검출 방법:
    서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 역전사 재조합-중합효소 증폭법(Reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA)용 프라이머 세트;
    를 이용하여 시료로부터 역전사 재조합-중합효소 증폭법 (Reverse transcription recombinase polymerase amplification, RT-RPA) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 증폭 단계는 하기의 단계를 포함하는 것인 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) 검출 방법:
    서열번호 2의 염기서열의 5'말단을 형광 분자 또는 비오틴 (BIOTIN)으로 표지하는 역방향 프라이머 준비 단계; 및
    서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)을 부착하거나, 34번째 서열 및 35번째 서열 사이에 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran; THF)을 삽입하거나, 또는 3'말단에 C3-spacer를 부착하는 프로브 준비 단계.
  10. 제8항에 있어서, 상기 증폭 단계는 하기의 단계를 포함하는 것인 토마토 반점 위조 바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) 검출 방법:
    RT-RPA 증폭산물을 스트립 (strip)으로 분석하는 분석 단계.
  11. 제8항에 있어서, 상기 시료는 고추, 토마토, 방울 토마토, 파프리카, 시금치, 치커리, 적치커리, 적겨자, 용설채, 트레비소, 감자, 들깨, 참깨, 호박 및 국화로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 검출 방법.
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