KR102657952B1 - 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출방법 - Google Patents

복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출방법에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물, 키트 및 진단방법은 디지털 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 표준 물질 없이도 검출 목표 유전자를 실시간으로 절대 정량이 가능하며, 기존의 qRT-PCR 방법에 비하여 높은 민감도로 보다 간편하고 신속하게 복숭아 잠복 모자이크 바이로드를 검출하고 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출방법{Primer set for detecting Peach latent mosaic viroid and Method for detecting Peach latent mosaic viroid}
본 발명은 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 또는 이의 혼합물을 포함하는 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출용 키트 및 이를 이용한 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출 방법에 관한 것이다.
국제 교류 확대, 기후변화 등 환경적 변화에 따른 고위험 바이러스의 국내 유입 및 피해확산의 사례가 지속적으로 발생하고 있으며, 이에 따른 경제적으로 매우 심각한 피해를 주고 있어서 국가 주도의 대응 기술 마련이 시급하다.
식물 바이러스병을 예방하기 위해 과수 등 영양번식 작물의 무병묘를 생산 보급하고 있으나, 농업 현장에서의 무병묘 유통실적은 저조한 실정이다.
복숭아 잠복 모자이크 바이로이드 (Peach latent mosaic viroid; 이하, PLMVd)는 2016년 국내 복숭아 재배 농가에 처음 보고되어 검역 관리급 병원체로 지정되어 있으며, 접목 (Grafting) 또는 진딧물에 의해 전염된다. PLMVd에 감염된 복숭아 나무 잎은 모자이크 증상을 보이고, 심한 경우 백화현상과 기형 잎이 관찰된다. 백화된 잎이 붙어있는 줄기도 백화 증상이 나타나며, 과실은 정상 과보다 숙기가 늦고 착색이 불량하여 상품성이 현저히 떨어진다.
중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; 이하, PCR)은 1세대, 2세대 및 3세대 PCR로 나누어 정의할 수 있다. 1세대 PCR은 유전자를 증폭 후 아가로즈 겔 (agarose gel) 전기 영동을 통해 유전자의 정성분석이 가능한 시스템으로, 정량적 분석이 어렵다는 단점이 있다. 2세대 PCR은 1세대 PCR의 정량적 분석이 어렵다는 단점을 보완하여 형광물질을 이용하여 검출목표 유전자의 증폭을 실시간으로 확인하고 상대 정량분석을 기반으로 Ct value를 통해 유전자 발현의 정량 및 정성 분석이 모두 가능해 졌다. 하지만, 2세대 PCR은 절대 정량분석을 위해서는 표준곡선이 필수적이며 PCR의 효율에 따라 결과값에 편차가 생길 수 있다는 단점을 가지고 있다. 이러한 정량분석의 한계를 극복하기 위해 3세대 PCR이 개발되었다. 3세대 PCR인 디지털 PCR 방법은 표준물질 없이도 검출목표 유전자를 실시간으로 절대 정량이 가능하다. 디지털 PCR은 PCR 반응을 2만개의 미세방울 (Drolpet)로 분리하여 증폭시킨 후, 표적 유전자를 계수하는 시스템으로, 미세방울에서의 표적 유전자 증폭 여부에 따라 양성 방울 (Positive droplet)을 1로, 음성 방울 (Negative droplet)을 0으로 계수하여 푸아송 분포 (Poisson distribution)를 통해 표적 유전자의 복제 수를 계산해 최종적으로 표본의 ul당 복제 수를 확인할 수 있다.
현재, PLMVd가 발생하면, 감염증상이 발생한 나무는 조속히 뿌리까지 굴취하여 소각 처리해야하기 때문에 초기 진단이 매우 중요하다. PLMVd를 진단하기 위해서는 2세대 PCR 기법 (예를 들어, qRT-PCR)이 많이 사용되고 있다. 그러나, 2세대 PCR 기법은 표적 유전자의 카피수까지는 확인할 수 없고, 극소량의 바이로이드를 정밀하게 검출할 수 없으므로 PLMVd를 빠르고, 정확하게 검출할 수 있는 검출 방법의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 보다 빠르고 정확하게 복숭아 잠복 모자이크 바이로드를 검출하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (Droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)의 방법의 경우, 극소량의 바이로이드를 정밀하게 검출할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은.서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;를 포함하는 복숭아 잠복 모자이크 바이로이드 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;를 포함하는 복숭아 잠복 모자이크 바이로이드 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 명세서 상 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에 있어서 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)가 부착되거나, 또는 3'말단에 블랙 홀 ??처 (Black hole Quencher; BHQ)가 부착된 프로브를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;를 포함하는 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid; PLMVd) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)가 부착되거나, 또는 3'말단에 블랙 홀 ??처 (Black hole Quencher; BHQ)가 부착된 프로브를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상 용어 "복숭아 잠복 모자이크 바이로드"는 Avsunviroidae과에 속하는 Pelamoviroid속의 유형종이다. 해머 헤드 리보자임을 갖는 클로로 플라스틱 바이로이드를 갖는 것이 특징이다. 복숭아 잠복 모자이크 바이로이드는 분지형 형성을 갖는 336-351 74 원형 RNA3이다. 2016년 국내 복숭아 재배 농가에 처음 보고되어 검역 관리급 병원체로 지정되어 있으며, 접목 또는 진딧물 (특히, 푸른 복숭아 진딧물)에 의해 전염된다. 증상이 발생하기 전에 복숭아 나무에 약 5 내지 7년 동안 잠복해 있으며, 질병의 증상으로는 새싹 괴사, 새싹 발달 지연, 가지의 괴사, 나무의 조기 노화, 꽃 줄무늬, 숙성 변형, 원형 변색 또는 일부의 모자이크 등이 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;를 포함하는 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid; PLMVd) 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)가 부착되거나, 또는 3'말단에 블랙 홀 ??처 (Black hole Quencher; BHQ)가 부착된 프로브를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 검출은 예를 들어, 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (Droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR) 및 qRT-PCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의해 증폭산물을 얻는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘 (amplicon)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상 용어 "ddPCR"은 20 ul의 PCR 반응을 2만개의 미세방울 (droplet)으로 쪼개어 증폭시킨 후, target DNA를 계수하는 시스템이다. 미세방울에서의 타겟 DNA의 증폭 여부에 따라 양성 방울 (1)과 음성 방울 (0)로 디지털 시그널처럼 받아들여 계수하고, 프아송 분포를 통해 타겟 DNA의 복제 수를 계산해 최종적으로 샘플 ul당 복제 수로 STD 물질 없이 바로 절대 정량 값을 확인할 수 있다. ddPCR에서 정량은 통계 분석 방법을 통해 이루어진다. 아무것도 없거나, 혹은 하나 혹은 그 이상의 반응이 이루어 지게 되면 이것이 기존의 프아송 분포를 통해 분석되어 음성 및 양성의 비율을 구하게 된다. 특히, ddPCR은 바이러스의 표준 시료를 사용할 수 없는 경우에 대조군 혹은 표준 시료를 제작할 수 있다. qRT-PCR은 preamplification 과정이 필요하나, ddPCR은 샘플의 preamplication과정이 없이도 절대 정량이 가능하며, 높은 민감도를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서 키트는 시료로부터 복숭아 잠복 모자이크 바이로드를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 키트에 투입되는 시료는 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 감염 질환 의심 또는 질환 진단 대상 개체 유래의 잎 및 꽃가루로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 키트는 ddPCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브, 다른 적절한 Supermix, 프로브 또는 DEPC-수(DEPCwater)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 키트가 ddPCR에 사용되는 경우, 별도로 cDNA를 수득하는 단계를 포함할 수 있으며, 사용된 프라이머 세트에 의해 중합된 타겟 DNA의 복제수를 계산해 최종적으로 ul당 복제수로 결과 값을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 하기의 단계를 포함하는 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid; PLMVd) 검출 방법에 관한 것이다:
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
를 이용하여 시료로부터 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (Droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계.
본 발명에 있어서 증폭 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
서열번호 3의 염기서열의 5'말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)를 부착하거나, 또는 3'말단에 블랙 홀 ??처 (Black hole Quencher)를 부착하는 프로브;를 프라이머 세트에 추가하는 단계.
본 발명에 있어서 증폭 단계는 하기와 같은 단계를 포함하는 것일 수 있다:
PCR 반응액과 오일을 혼합하여 미세방울을 생성하는 미세방울 생성 단계; 및
상기 미세방울을 증폭 시키는 가온 단계.
본 발명에 있어서 미세방울을 증폭 시키는 가온 단계는 하기와 같은 단계를 포함하는 것일 수 있다:
효소 활성 (Enzyme activation)을 위해 열을 가하는 제1 단계;
변성 (Denaturation)을 위해 열을 가하는 제2 단계;
결합 및 신장 (Annealing/extension)을 위해 냉각 시키는 제3 단계;
효소 불활성 (Enzyme deactivation)을 위해 열을 가하는 제4 단계.
본 발명에 있어서 제1 단계는 효소 활성을 위해 예를 들어, 95 ℃로 열을 가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제1 단계는 효소 활성을 위해 예를 들어, 10 분 동안 열을 가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2 단계는 변성을 위해 예를 들어, 94 ℃로 열을 가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2 단계는 변성을 위해 예를 들어, 30 초 동안 열을 가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제3 단계는 결합 및 신장을 위해 예를 들어, 56 ℃로 냉각 시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제3 단계는 결합 및 신장을 위해 예를 들어, 60 초 동안 냉각 시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2 및 제3 단계는 예를 들어, 40 회 반복하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제4 단계는 마지막 효소 불활성을 위해 예를 들어, 10분간 열을 가하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 증폭산물을 수득하는 증폭 단계는 PLMVd 검출 여부를 확인하는 분석 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분석 단계는 임계값에 의해 양성 및 음성 방울을 구분하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분석 단계는 양성 및 음성 방울 시그널 (droplet signal)이 분리되는 것과 동시에 최종 결과는 copies/ul 수치로 각 파장에 따른 유전자의 결과를 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출방법에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물, 키트 및 진단방법은 디지털 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 표준 물질 없이도 검출 목표 유전자를 실시간으로 절대 정량이 가능하며, 기존의 qRT-PCR 방법에 비하여 높은 민감도로 보다 간편하고 신속하게 복숭아 잠복 모자이크 바이로드를 검출하고 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid, 이하, PLMVd)의 외피 단백질 (Coat pretein, CP)내의 프라이머 서열의 위치를 나타낸 그림이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid, 이하, PLMVd)의 외피 단백질 (Coat pretein, CP)내의 프라이머 서열의 위치를 나타낸 그림이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid, 이하, PLMVd)의 외피 단백질 (Coat pretein, CP)내의 프라이머 서열의 위치를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (Droplet digital polymerase chain reaction, 이하, ddPCR)의 온도 별 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트의 PLMVd에 대한 특이적 반응 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 Cq 값에 따른 qRT-PCR의 선형회귀 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 복제수에 따른 ddPCR의 선형회귀 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 qRT-PCR 및 ddPCR의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
제조예. 프라이머 세트의 제조
우리나라 상주 지역에서, 전형적인 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid; 이하, PLMVd)병 증상을 보이는 복숭아 나무를 선별하여 잎 샘플을 채취하였다.
IQeasy+ 식물 RNA 추출 미니 키트 (iNtRON, Korea)를 사용하여 잎 조직에서 Total RNA를 추출하였다. PLMVd의 감염에 대해 양성인 샘플을 선택하여 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (Droplet digital polymerase chain reaction, 이하, ddPCR) 분석 템플릿으로 사용하기 위한 PLMVd 감염 시료를 제조하고, - 80 ℃에서 보관하였다.
상기 PLMVd의 염기 서열을 확보하고, 이를 바탕으로 보존되어 있는 염기서열 부분을 확인하였다.
보다 구체적으로, NCBI Basic Local Alignment Search Tool로부터 확보한 TSWV의 국내외 29개의 분리주의 외피 단백질(coat protein; CP)의 염기서열 (GenBank KY355293, KY355377, KX430156, GQ499315, JX479199, KF868404, JF898826, KY355300, KY355296, KY355333, KY355234, JF898825, KX430166, KX430164, KX430160, GQ499312, KF867859, KT005802, KT033052, KT033051, KY355381, KY355341, KY355301, KY355261, KY355201 및 AY685181)의 다중서열배치 (multiple sequence alignment, 도 1a 내지 1c)에서 고도로 보존된 영역을 선택하고, 이를 이용하여 ddPCR을 위한 프라이머 세트를 제작하였다. 또한, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 서열의 5'말단에는 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)를 부착하고, 3'말단에는 블랙 홀 ??처 (Black hole Quencher; BHQ)를 부착하여 프로브를 제작하였다.
제작한 프라이머 세트 및 프로브는 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 명명 염기서열(5'-3') 예상 산물 길이 (bp)
1 PLMVd-Foward ACCTCTCAGCCCCTCCAC 167 bp
2 PLMVd-Reverse CGTCGTAAYCCWGTTTCTACG
3 PLMVd-Probe AAAGGCTAAGMACBTCGCAATGAVGTAA
실험예 1. 디지털 중합 효소 연쇄 반응의 최적 온도 확인
제작한 프라이머 세트 (PLMVd-F/R/P)를 사용하여 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (Droplet digital polymerase chain reaction, 이하, ddPCR)의 최적 온도 조건을 확인하였다.
PLMVd의 감염에 대해 양성인 샘플과 프로브 (FAM, BHQ)를 포함한 PCR 반응액을 준비하였다. 준비한 PCR 반응액과 오일 (Droplet Generation oil, elveflow사, 프랑스)을 DG8TM (Bio-Rad사, 미국) 카트리지의 각각의 홈에 20 ul씩 분주하고, DG8TM 개스킷 (Gaskets)로 덮은 다음 QX200TM 미세방울 생성기 (droplet generator; Bio-Rad사, 미국)에 장착하여 2분 동안 각 검체당 최대 2만개의 미세방울을 생성하였다.
미세방울이 생성되면, 전동 파이펫을 사용하여 40 ul씩 각각의 96-웰-PCR 플레이트에 옮긴 후, 호일 (pierceable foil heat seal; Bio-Rad사, 미국)을 덮고, PX1TM PCR 플레이트 실러 (plate sealer)를 사용하여 가열 밀봉하였다.
밀봉한 PCR 플레이트를 T100TM Thermal Cycler에 장착하였다. 그리고 제1 단계 (효소 활성 단계)인 95 ℃에서 10분의 열 변성 후, 제2 단계 (변성 단계)는 94 ℃에서 30초, 제3 단계 (결합 및 신장 단계)는 56 ℃에서 60초의 과정을 진행하였으며, 제2 및 제3 단계를 40회 반복 후, 마지막으로 제4 단계 (효소 불활성 단계)로 98 ℃에서 10분간 반응한 후, 최종 생성물을 4 ℃에서 보관하였다.
또한, ddPCR의 최적의 온도 조건을 확인하기 위하여, 제3 단계의 온도조건을 49 ℃, 49.7 ℃, 51.2 ℃, 53.3 ℃, 56 ℃, 58.2 ℃, 59.4 ℃ 및 60 ℃로 설정하고, 다른 방법은 모두 동일하게 ddPCR을 진행하여 ddPCR의 최적 온도 조건을 확인하였으며, ddPCR이 끝난 후, PCR 플레이트를 QX200TM 미세방울 리더기에 장착한 후, QuantaSoftTM 소프트웨어로 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 도 2 그래프의 가로축은 샘플 이름 또는 웰 번호를 나타내며, 세로축은 형광 강도를 나타낸다. 낮은 온도인 49 ℃의 경우 임계선(분홍색 선)을 기준으로 양성 방울 (파란색 방울)의 형광이 낮았으며, 높은 온도인 60 ℃에서는 양성 방울과 음성 방울 (회색 및 검정색 방울)이 완전히 분리가 안되었기 때문에, 임계선 기준으로 가장 많은 양성 방울의 숫자를 얻은 56 ℃가 ddPCR을 수행하는데 가장 적합한 온도임을 확인하였으며, 이후의 실험에서는 모두 세번째 단계를 최적의 온도 조건인 56 ℃로 수행하였다.
실험예 2. 디지털 중합 효소 연쇄 반응의 특이성 확인
제작한 프라이머 세트 (PLMVd-F/R/P)에 대하여, 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid; 이하, PLMVd)에 특이적인 프라이머 및 프로브의 특이성을 ddPCR로 확인하였다. ddPCR은 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 수행하였다.
보다 구체적으로, PLMVd, 사과 엽록소 잎 반점 바이러스 (apple chlorotic leaf spot virus; 이하, ASGV) 및 벚나무 괴사 고리 바이러스 (Prunus necrotic ringspot virus; PNRSV);의 감염 시료와 음성 대조군 (No template control; 이하, NTC)을 ddPCR을 수행하여 분석한 후, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, PLMVd 감염 시료에서만 양성 방울 (파랑색 방울)을 나타내었으며, 나머지 ACLSV, PNRSV 및 NTC 시료에서는 음성 방울 (회색 및 검은색 방울)을 나타내었다. 이를 통해, PLMVd 감염 시료에서만 프라이머 세트가 특이적으로 반응하여 증폭되는 것을 확인하였다.
실험예 3. 디지털 중합 효소 연쇄 반응의 민감성 확인
제작한 프라이머 세트 (PLMVd-F/R/P)에 대하여, 기존의 qRT-PCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction) 방법과 ddPCR 방법을 비교하였다.
보다 구체적으로, PLMVd 감염 시료를 각각 10 배씩 차례대로 희석하여 qRT-PCR 및 ddPCR 반응을 수행하였다. ddPCR 반응은 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 진행하였으며, qRT-PCR 반응은 다음과 같이 진행하였다:
단계 1, 95 ℃에서 15분;
단계 2, 95 ℃에서 20초;
단계 3, 60 ℃에서 40초;
단계 4, 72 ℃에서 30초; 및
단계 2 내지 4를 40 사이클 반복.
그리고 비교 분석한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Sample name Concentration of transcripts (copies/μL) qPCR ddPCR
Cq Mean ± SD Concentration (copies/μL) CV (%) Concentration (copies/μL) Mean ± SD CV (%)
NTC - N/A N/A N/A - - - 0 0 0 - -
1 2.6 X 107 24.36 24.17 24.01 24.18 ± 0.17 3543475 0.72 70400 70400 67000 69266.66 ± 1962 2.83
2 2.6 X 106 27.48 27.45 27.52 27.48 ± 0.03 385687 0.13 7840 7900 7620 7786.66 ± 147 1.89
3 2.6 X 105 32.33 31.23 31.04 31.53 ± 0.69 25359 2.21 736 820 774 776.66 ± 42 5.42
4 2.6 X 104 34.73 34.52 35.00 34.75 ± 0.24 2913 0.69 72 74 94 80 ± 12 15.21
5 1.3 X 104 36.02 35.61 36.07 35.9 ± 0.25 1345 0.7 46 44 42 44 ± 2 4.55
6 6.6 X 103 36.12 35.86 36.27 36.08 ± 0.21 1191 0.57 16.8 14.4 18.2 16.46 ± 1.92 11.67
7 3.3 X 103 38.32 37.20 38.35 37.95 ± 0.65 339 1.73 7 14.2 9.2 10.13 ± 3.68 36.41
8 1.6 X 103 N/A 38.95 N/A 38.95 173 - 2.6 2.6 3.8 3 ± 0.69 23.09
9 8.2 X 102 N/A N/A N/A - - - 1.2 1.6 1.2 1.33 ± 0.23 17.32
Cq, quantification cycle; SD, standard deviation; CV, coefficient of variation; N/A, not available.
상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, ddPCR 반응은 qRT-PCR 반응보다 2배 높은 민감도로 8.2 X 102 농도의 샘플 9에서 qRT-PCR은 유전자를 검출하지 못하였으나, ddPCR은 1.33 복제 수 까지 검출하였다.
또한, Cq값에 따른 qRT-PCR의 선형회귀 분석 결과를 도 4a에, 복제수에 따른 ddPCR의 선형회귀 분석 결과를 도 4b에 나타내었으며, qRT-PCR 및 ddPCR의 상관관계를 분석한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, 복제 수에 따른 R2는 0.9813로 비례 관계의 직선을 나타내었으며, 희석 농도에 따른 R2는 0.9937로 반비례 관계의 직선을 나타내었으며, qRT-PCR 및 ddPCR 모두 실험 데이터가 회귀선에 근접하게 잘 맞았으며, 증폭 효율이 템플릿 사본 수에 대해 동일하게 나타났다. 또한, 도 5에서 확인할 수 있듯이, qRT-PCR과 ddPCR의 복제 수는 R2가 0.992로 높은 상관관계를 가짐을 확인하였다.
실험예 4. 디지털 중합 효소 연쇄 반응의 반복성 및 재현성 확인
PLMVd 검출을 위한 ddPCR의 반복성과 재현성을 평가하기 위해 PLMVd cDNA을 연속 희석한 시료를 사용하여 ddPCR을 3회 반복 수행하여 반복성 (Intra-assay)을 측정하였고, 각각 다른 시간에 독립적으로 ddPCR을 3회 수행하여 재현성 (Inter-assay)를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Concentration (copies/μL) 반복성 (Intra-assay) 재현성 (Inter-assay)
Mean ± SD CV (%) Mean ± SD CV (%)
10-3 5683.33 ± 130.51 2.30 6633.33 ± 75.71 1.14
10-4 409.33 ± 10.69 2.61 542 ± 15.71 2.9
10-5 35.83 ± 1.25 3.51 53.33 ± 2.12 3.98
표 3에서 확인할 수 있듯이, ddPCR 분석의 반복성은 변동계수가 2.30 내지 3.51% 범위 였으며, 재현성은 변동계수가 1.14 내지 3.98% 범위로 확인되었다. 이는 본 발명의 프라이머 세트로 수행한 ddPCR 분석이 우수한 반복성과 재현성을 가지고 있음을 의미한다.
실험예 5. 디지털 중합 효소 연쇄 반응의 현장 시료의 진단 비교
PLMVd을 검출하기 위해 PLMVd 병 증상을 보이는 복숭아 나무를 선별하여 잎샘플을 채취하여, 실험예 3과 같은 방법으로 qRT-PCR 및 ddPCR로 23개의 샘플을 분석하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
qPCR ddPCR Total
Positive Negative
Positive 9 0 9
Negative 8 6 14
Total 17 6 23
그리고 qRT-PCR에서는 증폭이 되지 않고, ddPCR에서만 증폭된 8개의 시료를 확인하고, 각각의 PLMVd의 복제 수를 확인하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Samples Concentration (copies/μL)
1 2.4 ± 2.4
2 2.06 ± 0.76
3 2.06 ± 0.76
4 0.93 ± 0.80
5 1.73 ± 1.50
6 1.87 ± 0.80
7 2.4 ± 0.72
8 4.67 ± 2.91
상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, qRT-PCR에서는 증폭 안 되고 ddPCR에서만 증폭된 8개의 시료는 ul당 복제수로 샘플 1은 2.4 ± 2.4 copies/μL, 샘플 2는 2.06 ± 0.76 copies/μL, 샘플 3은 2.06 ± 0.76 copies/μL, 샘플 4는 0.93 ± 0.80 copies/μL, 샘플 5는 1.73 ± 1.50 copies/μL, 샘플 6은 1.87 ± 0.80 copies/μL, 샘플 7은 2.4 ± 0.72 및 샘플 8은 4.67 ± 2.91을 나타내었다.
이를 통해, qRT-PCR에서는 증폭이 되지 않는 시료를 ddPCR로 검출하였으며, 복제수가 4.67 내지 0.93으로 표적 유전자의 0.93 복제수까지 검출이 가능하므로 높은 민감도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Primer set for detecting Peach latent mosaic viroid and Method for detecting Peach latent mosaic viroid <130> PN210238 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLMVd-Foward <400> 1 acctctcagc ccctccac 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLMVd-Reverse <400> 2 cgtcgtaayc cwgtttctac g 21 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLMVd-Probe <400> 3 aaaggctaag macbtcgcaa tgavgtaa 28

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  8. 하기의 단계를 포함하는 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid; PLMVd) 검출 방법:
    서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (Droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)용 프라이머 세트;
    를 이용하여 시료로부터 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (Droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계에 있어서,
    상기 증폭 단계는 서열번호 3의 염기서열의 5’말단에 플루오레세인아미다이트 (Fluorescein amidite; FAM)를 부착하거나, 또는 3’말단에 블랙 홀 ??처 (Black hole Quencher; BHQ)를 부착하는 프로브;를 프라이머 세트에 추가하는 단계;
    상기 프라이머 세트 및 상기 시료가 포함된 PCR 반응액과 오일을 혼합하여 미세방울을 생성하는 미세방울 생성 단계;
    상기 미세방울을 증폭 시키는 가온 단계; 및
    PLMVd 검출 여부를 확인하는 분석 단계를 추가로 포함하는 것이며,
    상기 분석 단계는 임계값에 의해 양성 및 음성 방울을 구분하는 것이며,
    상기 분석 단계는 양성 및 음성 방울 시그널 (droplet signal)이 분리되는 것과 동시에 최종 결과는 copies/ul 수치로 각 파장에 따른 유전자의 결과를 확인하는 것이며,
    상기 가온 단계는 하기의 단계를 포함하는 것인, 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 (Peach latent mosaic viroid; PLMVd) 검출 방법:
    효소 활성 (Enzyme activation)을 위해 95 ℃로 10 분 동안 열을 가하는 제1 단계;
    변성 (Denaturation)을 위해 94 ℃로 30 초 동안 열을 가하는 제2 단계; 및
    결합 및 신장 (Annealing/extension)을 위해 56 ℃로 60 초 동안 냉각 시키는 제3 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2 단계 및 제3 단계는 40 회 반복하는 것인, 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출 방법.
  10. 제8항에 있어서, 시료는 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 감염 질환 의심 또는 질환 진단 대상 개체 유래의 잎 및 꽃가루로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 복숭아 잠복 모자이크 바이로드 검출 방법.
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Boubourakas 등, Journal of Virological Methods, Vol. 160, 페이지 63-68 (2009.05.03.)*
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