KR102228116B1 - 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 사과 줄기 바이러스병 진단방법 - Google Patents

사과 줄기 홈 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 사과 줄기 바이러스병 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 사과 줄기 홈 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 사과 줄기 홈 바이러스병 진단방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 qRT-PCR의 방법은 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

사과 줄기 홈 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 사과 줄기 바이러스병 진단방법{Primer Set for detecting apple stem grooving virus and method for diagnosing apple stem grooving virus disease using the same}
본 발명은 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 사과 줄기 홈 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 사과 줄기 홈 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.
전 세계적인 지구 온난화로 인하여 새로운 바이러스의 출현과 피해가 급증하고 있다. 그 중 식물 바이러스 병은 곰팡이나 세균에 의한 다른 식물 병들과는 다르게 화학적 방제가 불가능하고, 소수의 친환경 방제 법이 있지만 효과는 크지 않은 문제가 있다. 그렇기 때문에 식물 바이러스 병은 방제보다는 신속한 진단으로 작물의 피해를 줄이고 병의 확산을 막는 것이 중요하다.
국내 과수 바이러스 감염률은 30~60 %로 높으며, 감염으로 인해 과수의 생산량 20~40 % 감소, 당도 감소 및 기형과 발생 등으로 품질이 저하되어 경쟁력이 취약하다(농촌진흥청 원예특작과학원). 특히, 개방화가 가속되는 상황에서 바이러스에 감염된 과수는 과수 산업의 경쟁력을 떨어뜨린다. 그 중 특히 배의 바이러스 감염률은 29 %(최저 감염률)이며, 피해도 증가하고 있다.
한편, 우리나라 배에서 발생하는 주요 바이러스는 사과 황화 반점 바이러스(Apple chlorotic leafspot virus; ACLSV), 사과 줄기 구멍 바이러스(Apple stem pitting virus; ASPV) 및 사과 줄기 홈 바이러스(Apple stem grooving virus; ASGV) 등이 있다.
특히 사과 줄기 구멍 바이러스(ASGV)는 배에서 잎검은점병(black necrotic leaf spot)을 일으키며 대부분의 농가에 발생하고, 잎의 많은 부분이 검게 변하는 병징으로 인해 광합성 작용에 영향을 주어 생산량, 당도에 많은 피해를 주는 바이러스이다.
기존에는 이러한 바이러스들을 검출 및 진단하기 위해 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR) 기법을 이용하였다. 그러나 PCR은 특별한 장비가 필요하고, 평균 90 분이라는 오랜 시간이 걸리기 때문에 신속한 검출 및 진단이 어렵다는 문제가 있으며, 프로브를 사용하지 않아 민감도가 낮다는 문제가 있다.
국내공개특허 제10-2016-0126654호
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 사과 줄기 구멍 바이러스를 검출 및 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용한 qRT-PCR의 방법을 이용하는 경우, 높은 민감도 및 특이도로 사과 줄기 구멍 바이러스를 검출이 가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스(Apple stem grooving virus; ASGV) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스(ASGV) 검출용 조성물을 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스병 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 사과 줄기 홈 바이러스병의 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 간편하고 신속하게 사과 줄기 구멍 바이러스를 검출 및 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용한 qRT-PCR의 방법을 이용하는 경우, 높은 민감도 및 특이도로 사과 줄기 구멍 바이러스를 검출이 가능함을 규명하였다.
본 발명은 사과 줄기 구멍 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 사과 줄기 구멍 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 사과 줄기 구멍 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 사과 줄기 구멍 바이러스병 진단방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스(Apple stem grooving virus; ASGV) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluoresceinisothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl)ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black) 및 MGB(minor groove binder)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "사과 줄기 구멍 바이러스(Apple stem pitting virus; ASPV)"는 배 바이러스병(고접병)의 원인균 중 하나로, ASPV에 감염된 나무는 일반적인 쇠약 증상을 나타내고 잎이 작아지며, 점진적으로 황화, 조기낙엽 등의 증상을 나타낸다. 또한, 꽃이 많이 피고 과실이 작아지며, 줄기를 가로로 잘라보면 방사상으로 고랑이 진 나이테를 볼 수 있다.
상기 ASPV는 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브에 의해 증폭되어 100 bp의 증폭산물을 나타내며, 상기 증폭산물을 통해 검출될 수 있다.
상기 증폭은 당업계에서 증폭 대상(유전자 등)을 증폭하기 위하여 이용되는 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있고, 예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative real-time PCR; qRT-PCR)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브의 검출한계는 5 x 102 Copy number/μL 일 수 있다. 상기 범위에서 검출함으로써 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 민감도 높게 사과 줄기 구멍 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하면, 다른 회사의 제조방법으로 키트를 제조하여 이용하거나 다른 검출기기를 사용함에 있어서도 기존의 사과 줄기 구멍 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 프로브 보다 특이적으로 민감도 높게 검출해낼 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 배 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스병 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "사과 줄기 홈 바이러스병"은 사과 줄기 홈 바이러스의 감염에 의해서 배에서 발생하는 질병을 의미하며, 구체적으로는 잎검은점병(black necrotic leaf spot)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 조성물은 잎검은점병을 진단하기 위해 사용될 수 있다.
상기 키트는 시료로부터 사과 줄기 홈 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있는데, 특별히 제한되지 않으나, 상기 프라이머 세트뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.
상기 시료는 예를 들어, 나무(묘목)의 껍질, 잎, 열매, 줄기 또는 뿌리 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 키트는 qRT-PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 상기 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 용기(예컨대, 일회용 qRT-PCR 튜브 등)에 담겨 있는 동결 건조된(lyophilized) 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 하기의 단계를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스병의 진단방법에 관한 것이다.
제 1 항의 조성물을 이용하여 시료로부터 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative real-time PCR; qRT-PCR) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계; 및
qRT-PCR 증폭산물을 분석하는 분석 단계.
상기 분석 단계에서 100 bp의 증폭산물을 수득한 경우 시료에 ASGV가 감염되었다고 판정할 수 있다.
상기 시료는 예를 들어, 나무(묘목)의 껍질, 잎, 열매, 줄기 또는 뿌리 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머 세트를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함한 사과 줄기 홈 바이러스병 진단용 키트의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락한다.
본 발명은 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함한 진단용 키트 및 이를 이용한 사과 줄기 홈 바이러스병 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스 검출용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 이를 이용한 사과 줄기 홈 바이러스병 진단방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 qRT-PCR의 방법은 보다 간편하고 신속하게 바이러스를 검출하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 사과 줄기 홈 바이러스(ASGV)의 외피 단백질(CP)의 다중서열배치(multiple sequence alignment)를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV-F/R 프라이머 및 ASGV-P 프로브를 이용한 qRT-PCR 반응 결과를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV-F/R 프라이머 및 ASGV-P 프로브를 이용하여 시료의 농도에 따른 qRT-PCR 반응 결과를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV-F/R 프라이머 및 ASGV-P 프로브의 민감도를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV-F/R 프라이머 및 ASGV-P 프로브의 특이도를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV-F/R 프라이머 및 ASGV-P 프로브의 상용화 가능성을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV-F/R 프라이머 및 ASGV-P 프로브의 과수 종류에 따른 사용 가능성을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASGV-F/R 프라이머 및 ASGV-P 프로브의 디지털 PCR(Digital PCR)에의 사용 가능성을 확인한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예. 프라이머 세트 및 프로브의 제조
우리나라 배 주산지 5 지역(전남 나주, 충남 천안, 경북 상주, 경남 울산 및 경기도 남양주)에서 배 잎 샘플을 채취하여 ASGV 외피 단백질(coat protein; CP)의 염기서열(sequence)을 확보하였다. 확보한 상기 5 종(지역별)의 염기서열을 바탕으로, 보고되어 있는 여러 나라(중국, 인도, 브라질 및 일본)의 ASGV 외피 단백질 염기 서열을 비교하여 보존되어 있는 염기서열 부분을 확인하였다.
보다 구체적으로, 상기 5 지역의 ASGV 외피 단백질 및 기 보고된 ASGV의 외피 단백질의 염기서열(GQ330294, KR606324, JX885582, KR815877, LC086300, LN90143, JN792491, KX668488, LC184640 및 KX988001)의 다중서열배치(도 1)에서 고도로 보존된 영역을 선택하고, 이를 이용하여 프라이머 세트 및 프로브를 제작하였다.
제작한 프라이머 세트 및 프로브는 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 명명 염기서열(5’-3’) 예상 앰플리콘 길이
(Expected amplicon length, nt)
1 ASGV-F AGRCGCCACCGGGTAGG 100
2 ASGV-R CCTTCRAARCTTTCACCTTCTTTRA
3 ASGV-P FAM-ARVTTCTGACGGTTCCTCCCCCTGAA-BHQ
실험예 1. qRT-PCR 반응 가부 확인
상기 제조예에서 제작한 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 qRT-PCR을 진행하였다.
보다 구체적으로, 마이크로 튜브에 12.5μL DiaStar?? 2X OneStep Multiplex qRT-PCR smart mix(SolGent), 2μL 프라이머 세트(ASGV-F 및 ASGV-R), 0.5μL 프로브(ASGV-P) 및 ASGV에 감염된 배 잎의 total RNA 2μL를 넣고 50 ℃에서 30 분, 95 ℃에서 15 분 반응 후 40 사이클을 95 ℃에서 20 초, 61 ℃에서 40 초, 72 ℃에서 30 초 반응하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, ASGV에 감염된 잎(Positive), 감염되지 않은 잎(Negative) 및 물(non-template control, NTC)에 대한 qRT-PCR 결과, ASGV에 감염된 잎을 사용한 실험군에서만 ASGV가 검출되는 것을 알 수 있었다.
실험예 2. 시료(RNA) 농도에 따른 qRT-PCR 반응 가부 확인
상기 실험예 1의 결과에 기초하여, RNA의 농도에 따른 qRT-PCR을 진행하였다.
보다 구체적으로, ASGV 외피 단백질(CP) 유전자의 RNA 전사체(transcripts)는 T7 RNA 폴리머라아제(Promega)를 사용하여 합성하였고, 사용된 DNA 주형가닥은 RNase-free DNase1을 넣고 37 ℃에서 30분 반응하여 제거하였다. 합성된 RNA 전사체는 NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer(Nanodrop)를 이용하여 농도를 측정하였다. 농도를 측정한 RNA 전사체를 10 배씩 차례대로 희석하고(50 ~ 5 x 109 Copy number/μL) 상기 실험예 1의 방법과 동일한 방법을 이용하여 qRT-PCR 반응을 진행하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, Cq 값이 약 3.3씩 감소(-3.244의 기울기)하였으며, R2 값은 0.992로 나타나 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브의 정확성이 높다는 것을 알 수 있었다.
실험예 3. 프라이머 세트 및 프로브의 민감성 확인
상기 제조예에서 제조된 프라이머 세트 및 프로브에 대하여, 기존의 PCR 방법과 qRT-PCR 방법의 민감도를 비교하였다.
보다 구체적으로, RT-qPCR 반응은 상기 실험예 1의 방법과 동일하게 진행하였으며, RT-PCR은 다음과 같이 진행되었다:
단계 1, 50 ℃에서 30 분;
단계 2, 95 ℃에서 5 분;
단계 3, 30 초 동안 95 ℃ 30 초 동안 56 ℃ 40 초 동안 72 ℃의 35 사이클;
단계 4, 72 ℃에서 5 분.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 사용하는 경우(qRT-PCR) 기존의 RT-PCR 반응에 비하여 적어도 10배 민감하게 ASGV가 검출되는 것을 알 수 있었다.
실험예 4. 프라이머 세트 및 프로브의 특이성 확인
상기 제조예에서 제조된 프라이머 세트 및 프로브에 대하여, 과수를 감염시키는 다른 바이러스들이 감염된 잎에서 total RNA를 추출하고, 상기 실험예 1의 방법과 동일한 방법을 이용하여 qRT-PCR 반응을 진행하였다. 비교를 위하여 사용된 다른 바이러스의 정보는 하기와 같다:
ACLSV와 ASPV는 ASGV와 더불어 배를 감염시키는 바이러스이며, 채집한 샘플 중 ACLSV와 ASPV가 감염된 샘플과 virus-free한 샘플은 각 프라이머 세트 [ACLSV-F31 (GCAGACCCCTTCATGGAAAGA) & ACLSV-R31 (CGCAAAGATCAGTCGTAACAGA), ASPV-F001 (AAGCATGTCTGGAACCTCATG) & ASPV-R001-2 (GATCAACTTTACTAAAAAGCATAAGT)]를 사용하여 확인하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 사용하는 경우 ACLSV 및 ASPV로 감염된 샘플에서는 증폭되지 않았고, ASGV가 감염된 샘플에서만 증폭되는 것을 알 수 있었다.
실험예 5. 상용화 가능성 확인
상기 실험예 3 및 4의 결과를 바탕으로, 배 주요 재배지인 5개 지역에서 임의로 채집한 샘플들(25 개)에서 total RNA를 추출하고, 상기 실험예 1의 방법과 동일한 방법을 이용하여 qRT-PCR 반응을 진행하였다. 이때, 비교를 위하여 상기 5개 지역에서 감염되지 않은 샘플 7개(샘플의 감염여부 미리 확인)를 함께 테스트하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, 25개 샘플 모두에서 ASGV가 검출되었으며, 상기 5개 지역에서 감염되지 않은 7개 샘플 모두에서 ASGV가 검출되지 않았다.
이러한 결과는, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 실제 현장에서도 바로 사용이 가능할 것을 의미한다.
실험예 6. 과수 종류에 따른 사용 가능성 확인
상기 실험예 5의 결과를 바탕으로, 배가 아닌 ASGV가 감염된 사과 시료(경북 청송)로부터 total RNA를 추출하고, 상기 실험예 1의 방법과 동일한 방법을 이용하여 qRT-PCR 반응을 진행하였다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, ASGV가 감염된 기타 과수(사과) 시료에서도 ASGV 검출이 가능하였다.
이러한 결과는, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 ASGV가 감염될 수 있는 것이라면 배뿐만이 아니라 기타 과수에서도 사용이 가능할 것을 의미한다.
실험예 7. 디지털 PCR(Digital PCR)에의 사용 가능성 확인
상기 실험예 5의 결과를 바탕으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 디지털 PCR 반응을 진행하였다.
보다 구체적으로, ASGV가 감염된 배 잎에서 total RNA를 추출하고, Clarity?? digital PCR(JN Medsys, 싱가포르)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 반응을 진행하였다.
한편, 디지털 PCR은 3세대 PCR이라고 불리며, 기존의 1세대 PCR 및 2세대 real-time PCR의 단점을 보완한 기법이다. 기존 1세대 및 2세대 PCR에서 불가능했던 절대정량이 가능해졌고, 민감도와 특이성이 더 높아졌다. 따라서, 아주 낮은 농도로 존재하는 병원균을 검출할 수 있다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, ASGV에 감염된 잎은 낮은 농도(10-9)에서도 ASGV가 검출되었고, 감염되지 않은 잎(Negative)을 사용한 샘플 및 RNA 대신 물을 넣은 샘플(NTC)에서는 반응이 나타나지 않은 것을 알 수 있었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Primer Set for detecting apple stem grooving virus and method for diagnosing apple stem grooving virus disease using the same <130> PN190246 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV-F <400> 1 agrcgccacc gggtagg 17 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV-R <400> 2 ccttcraarc tttcaccttc tttra 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV-P <400> 3 ttctgacggt tcctccccct gaa 23

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
    서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스(Apple stem grooving virus; ASGV) 검출용 조성물.
  2. 제 1 항의 조성물을 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스병 검출용 키트.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 사과 줄기 홈 바이러스병은 잎검은점병(black necrotic leaf spot)인, 키트.
  4. 하기의 단계를 포함하는 사과 줄기 홈 바이러스병의 검출방법:
    제 1 항의 조성물을 이용하여 시료로부터 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative real-time PCR; qRT-PCR) 증폭산물을 수득하는 증폭 단계; 및
    qRT-PCR 증폭산물을 분석하는 분석 단계.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 시료는 나무(묘목)의 껍질, 잎, 열매, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것인, 사과 줄기 홈 바이러스병의 검출방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 사과 줄기 홈 바이러스병은 잎검은점병(black necrotic leaf spot)인, 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 분석 단계는 qRT-PCR 증폭산물 중 100 bp의 증폭산물의 포함여부를 확인하는 것인, 방법.
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Qin 등. Journal of Agricultural Biotechnology. Vol. 23, No. 6, 페이지 816-822(2015.04.13)*
김대현, 과수 바이러스 주요특성 및 무병묘 생산기술, 농촌진흥청 발표자료, (2016.06.10.)*

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