CN110951838B - 基于rpa-lfd技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用 - Google Patents

基于rpa-lfd技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物病原检测技术领域，具体涉及一种基于RPA‑LFD技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用。所述正向引物Mh‑RPA‑F、反向引物Mh‑RPA‑R和探针Mh‑RPA‑P核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～3所示。所述试剂盒包括引物、探针、RPA冻干酶粉、Rehydration Buffer、MgAc、ddH2O、检测缓冲液和侧流层析试纸条。该试剂盒可应用于线虫样品、植物根组织样品以及土壤样品中北方根结线虫的快速检测和鉴定，具有特异性强、灵敏度高、仪器设备简单、操作简便、快速高效、结果判定可视化等优点，为北方根结线虫病的现场检测和早期诊断提供了新的技术手段。

Description

基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及 应用
技术领域
本发明涉及植物病原检测技术领域，特别涉及一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及其应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类世界性分布的威胁农业生产的植物根系专性内寄生线虫，可侵染114个科3000多种植物，每年因其危害可造成世界农作物减产至少5％。目前，世界上报道根结线虫的种类已超过100个种，其中，北方根结线虫(M.hapla)是分布最广、危害最重、最常见的根结线虫种类之一，具有非常广泛的寄主范围，可侵染蔬菜、瓜类、药材、花卉、果树等植物，给我国农业生产造成了重大经济损失。快速、准确地鉴定和检测根结线虫种类，对根结线虫病害的田间检测和监测及选择有效的防控方法至关重要。
根结线虫种类鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子检测方法。由于根结线虫种类较多，各种类在种间的形态学特征上非常相似，在种内又存在着较大的变异，通过形态学特征难以准确鉴定，并且该方法耗时、费力，需要专业的技能和丰富的线虫形态学鉴定经验，难以达到快速诊断和检测的目的。虽然PCR检测方法在一定程度上克服了形态学鉴定上的缺陷，但需要昂贵的仪器设备，检测过程复杂、时间较长，不利于现场快速检测及基层普及应用。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种新型体外恒温核酸扩增技术，该技术依赖于一对30～35bp长度的引物和三种酶(重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶)，在37～42℃恒温条件下反应5～20min，就可快速完成核酸的大量扩增，RPA扩增产物结合侧流层析试纸条技术(Lateral flow dipstick，LFD)，可在30min内完成对北方根结线虫的可视化检测。由于RPA不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单的恒温器中即可完成，具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、检测方便等优点，已广泛应用于真菌、细菌、病毒、寄生虫等方面的快速检测，但尚未见其在北方根结线虫检测方面的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及其应用。该方法仅需要使用恒温水浴在短时间内即可完成检测，通过肉眼观察即可准确、高效、简便和快速地判定样品中是否含有北方根结线虫。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物探针组合，包括正向引物、反向引物和探针；
所述正向引物具有：
(I)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
(II)、如(I)所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
所述反相引物具有：
(IV)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(V)、如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(VI)、与(IV)或(V)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
所述荧光探针具有：
(VII)、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(VIII)、如(VII)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(VII)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IX)、与(VII)或(VIII)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在上述研究的基础上，本发明提供了所述的引物探针组合在检测北方根结线虫中的应用。
在一些具体实施方案中，待测样品为线虫样品、植物根组织样品和/或土壤样品。
本发明还提供了所述的引物探针组合在制备北方根结线虫检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了检测北方根结线虫的试剂盒，其特征在于，包括所述的引物探针组合。
在一些具体实施方案中，还包括RPA冻干酶粉、Rehydration Buffer、MgAc、ddH2O、检测缓冲液和侧流层析试纸条中的一种或两者以上的组合物。
本发明还提供了所述的试剂盒在检测北方根结线虫中的应用。
在上述研究的基础上，本发明还提供了一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的方法，包括以下步骤：
步骤1、提取待测样品的DNA；
步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物探针组合或如权利要求5或6所述的试剂盒，进行RPA扩增；
步骤3、根据步骤2中RPA扩增的结果判定所述待测样品中是否含有北方根结线虫。
所述判定的标准为：采用侧流层析试纸条检测，取RPA扩增产物与检测缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，室温放置5min后观察结果。若试纸条上质控线和检测线均出现条带时，检测结果为阳性，表明待测样品中含有北方根结线虫；若试纸条上仅质控线出现条带时，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有北方根结线虫；若试纸条上仅检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。
在一些具体实施方案中，步骤2中所述RPA扩增的反应体系为50μL：
在一些具体实施方案中，步骤2中所述RPA扩增的反应条件为：37～42℃反应5～30min。
本发明提供了一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用。所述正向引物Mh-RPA-F、反向引物Mh-RPA-R和探针Mh-RPA-P核苷酸序列依次如SEQ IDNo.1～3所示。所述试剂盒包括引物、探针、RPA冻干酶粉、Rehydration Buffer、MgAc、ddH2O、检测缓冲液和侧流层析试纸条。该试剂盒可应用于线虫样品、植物根组织样品以及土壤样品中北方根结线虫的快速检测和鉴定，具有特异性强、灵敏度高、仪器设备简单、操作简便、快速高效、结果判定可视化等优点，为北方根结线虫病的现场检测和早期诊断提供了新的技术手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例2中RPA-LFD检测结果图；
图2示本发明实施例3中北方根结线虫RPA-LFD特异性检测结果图；
图3示本发明实施例4中土壤中北方根结线虫2龄幼虫RPA-LFD灵敏度检测结果图；
图4示本发明实施例4中土壤中北方根结线虫2龄幼虫常规PCR灵敏度电泳检测结果图；
图5示本发明实施例4中爪哇根结线虫雌虫RPA-LFD灵敏度检测结果图；
图6示本发明实施例4中爪哇根结线虫雌虫常规PCR灵敏度电泳检测结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的引物和探针组合，包括正向引物Mh-RPA-F，反向引物Mh-RPA-R，探针Mh-RPA-P；
所述正向引物Mh-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述反向引物Mh-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述探针Mh-RPA-P的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选地，所述反向引物Mh-RPA-R序列的5’端用生物素(Biotin)标记；探针Mh-RPA-P序列的5’端用荧光素(FAM)标记，距5’端31bp处的碱基用四氢呋喃(THF)替代，3’端用C3-spacer阻断。
本发明还提供了所述的引物和探针组合在检测北方根结线虫中的应用。
本发明还提供了所述的引物和探针组合在制备北方根结线虫检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的试剂盒，包括上述的引物和探针组合。
所述的试剂盒还包括RPA冻干酶粉、Rehydration Buffer、MgAc、ddH2O、检测缓冲液和侧流层析试纸条。
本发明还提供了所述的试剂盒在检测北方根结线虫中的应用。
本发明还提供了一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)以所述待测样品的DNA为模板，利用所述试剂盒进行RPA扩增；
(3)应用侧流层析试纸条检测扩增产物，判定样品中是否含有北方根结线虫。
优选地，步骤(1)中所述的待测样品为线虫样品、植物根组织样品或土壤样品。
优选地，步骤(2)中RPA扩增反应体系为50μL：
优选地，步骤(2)中RPA扩增反应条件为：37～42℃反应5～30min。
优选地，步骤(3)中侧流层析试纸条检测方法为：取RPA扩增产物与检测缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，室温放置5min后观察结果。若试纸条上质控线和检测线均出现条带时，检测结果为阳性，表明待测样品中含有北方根结线虫；若试纸条上仅质控线出现条带时，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有北方根结线虫；若试纸条上仅检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。
本发明具有以下有益效果：
(1)特异性强。本发明提供了一种快速检测北方根结线虫的RPA-LFD引物和探针组合，该引物和探针是根据北方根结线虫与其它根结线虫效应蛋白16D10基因序列差异设计，能够从13种供试植物线虫种群中特异性地检测出北方根结线虫。
(2)灵敏度高。本发明建立的北方根结线虫RPA-LFD检测方法可检测到0.001头北方根结线虫雌虫，以及在0.5g土壤中可检测到0.01条北方根结线虫2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍。
(3)设备简单、检测快速。本发明建立的北方根结线虫RPA-LFD检测方法不需要复杂的仪器设备，在37～42℃恒温条件下反应20min左右即可完成扩增反应；应用侧流层析试纸条检测扩增产物，在5min内便可通过肉眼观察检测线和质控线的有无来判定检测结果；该方法可以直接检测线虫样品、植物根组织或土壤样品中的北方根结线虫，从提取DNA到获得检测结果仅需要1h左右，利于现场快速检测和基层应用。
本发明提供的基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1北方根结线虫RPA-LFD引物及探针的设计与合成
以北方根结线虫效应蛋白16D10基因(DQ841123)为靶标，依据RPA引物和探针设计原则，利用Primer Premier 5.0软件设计了正向引物Mh-RPA-F，反向引物Mh-RPA-R，探针Mh-RPA-P。所有引物和探针均由北京擎科生物科技有限公司合成，引物和探针的碱基序列如下：
Mh-RPA-F(SEQ ID No.1)：
5’-TCCCAAATCTTCATTACTAATATGAATAGT-3’；
Mh-RPA-R(SEQ ID No.2)：
5’-[Biotin]ACTCAATTTAATGGAATGTGCTATTTCCAAG-3’；
Mh-RPA-P(SEQ ID No.3)：5’-GTGGCCTCTGTCCAACCCTTCCTCTTCCAAGCTCATATTCATCAGT-3’；
其中反向引物Mh-RPA-R序列的5’端用生物素(Biotin)标记；探针Mh-RPA-P序列的5’端用荧光素(FAM)标记，距5’端31bp处的碱基用四氢呋喃(THF)替代，3’端用C3-spacer阻断。获得的序列如下所示：
5’-[FAM]GTGGCCTCTGTCCAACCCTTCCTCTTCCAA[THF]CTCATATTCATCAGT[C3-spacer]-3’。
实施例2北方根结线虫RPA-LFD检测方法的建立
2.1 线虫DNA提取
在200μL PCR管的管盖内加入20μL裂解液[10×PCR buffer(Mg2+free):1mg/mL蛋白酶K:ddH2O＝8:1:1]，挑取单条线虫放入裂解液中，用灭菌的细针将线虫切断，盖上管盖，瞬时离心，将裂解液收集至管底；将PCR管置于56℃温育15min，95℃加热10min，获得单条线虫DNA提取液。
土壤中线虫DNA的提取采用MP Biomedicals公司的Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒，具体操作方法参见试剂盒说明书。
2.2 RPA-LFD扩增反应体系
2.3 RPA-LFD扩增反应条件
将以上各组分加入反应管中混合并瞬时离心后，置于39℃金属浴中反应20min，得到扩增产物。
2.4 RPA-LFD扩增反应结果判定
RPA反应结束后，取5μL扩增产物与45μL检测缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，室温放置5min后观察结果。若试纸条上质控线和检测线均出现条带时，检测结果为阳性，表明待测样品中含有北方根结线虫；若试纸条上仅质控线出现条带时，则检测结果为阴性，表明待测样品中不含有北方根结线虫；若试纸条上仅检测线出现条带或不出现任何条带，表明检测结果为无效。
检测结果如图1所示，编号1含有北方根结线虫DNA，可以观察到试纸条上质控线和检测线均出现条带；编号2为阴性对照，则试纸条上仅质控线出现条带。
实施例3北方根结线虫RPA-LFD特异性检测
收集北方根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫、拟禾本科根结线虫、旱稻孢囊线虫、水稻潜根线虫、柑橘半穿刺线虫、咖啡短体线虫、肾形肾状线虫、中华隐皮孢囊线虫和加德拟鞘线虫，分别提取其DNA作为模板，按照实施例2中的方法进行RPA-LFD检测，以验证北方根结线虫RPA-LFD检测方法的特异性。表1为各供试样本的植物线虫群体种类及来源。
表1供试的植物线虫群体种类及来源
检测结果如图2所示，其中编号1～18采用表1中的供试样本，编号19为阴性对照。结果显示：编号1～3(含有北方根结线虫DNA)试纸条上质控线和检测线均出现条带，其它15个样本和阴性对照的试纸条上仅质控线出现条带。
结果表明本发明所述的RPA-LFD引物和探针在检测北方根结线虫时具有高度的特异性。
实施例4北方根结线虫RPA-LFD灵敏度检测
4.1 土壤中北方根结线虫2龄幼虫RPA-LFD灵敏度检测
取0.5g含有100条北方根结线虫2龄幼虫的土壤，利用试剂盒提取土壤总DNA，按10倍梯度稀释成6个浓度，则每0.5g土壤中分别含有100～1.0×10-3条2龄幼虫，将各个浓度梯度各取2μL作为模板，按照实施例2中的方法进行RPA-LFD检测。
同时以上述各个浓度梯度的DNA为模板，以北方根结线虫特异性引物JMV1(5’-GGATGGCGTGCTTTCAAC-3’)和JMV hapla(5’-AAAAATCCCCTCGAAAAATCCACC-3’)为引物，进行常规PCR检测。PCR扩增反应采用25μL体系：10×EasyTaq buffer(含Mg2+)3μL，2.5mmol/LdNTPs 2μL，10μmol/L引物JMV1和JMV hapla各1μL，5U/μL EasyTaq DNA Polymerase 0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
RPA-LFD检测结果如图3所示，其中编号1～7分别为：0.5g土壤中分别含有100、10、1、10-1、10-2、10-3条2龄幼虫和阴性对照。结果显示：编号1～5试纸条上质控线和检测线均出现条带，其它样本和阴性对照的试纸条上仅质控线出现条带。采用RPA-LFD方法检测土壤中的北方根结线虫，其检测灵敏度可达到0.01条2龄幼虫。
常规PCR电泳检测结果如图4所示，其中1～7泳道分别为：0.5g土壤中分别含有100、10、1、10-1、10-2、10-3条2龄幼虫和阴性对照。结果显示：当DNA浓度稀释至0.1条2龄幼虫时，可观察到扩增条带，继续稀释时则不能观察到扩增条带，表明常规PCR检测灵敏度为0.1条2龄幼虫。
上述结果说明，本发明所述的RPA-LFD引物、探针及检测方法可在0.5g土壤中检测到0.01条北方根结线虫2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍，具有极高的检测灵敏度。
4.2 北方根结线虫雌虫RPA-LFD灵敏度检测
提取单头北方根结线虫雌虫DNA，并按10倍梯度稀释成6个浓度，则分别含有1～1.0×10-5头雌虫，将各个浓度梯度作为模板，按照实施例2和实施例4.1中的方法分别进行RPA-LFD和常规PCR检测。
RPA-LFD检测结果如图5所示，其中编号1～7分别为：1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5头雌虫和阴性对照。结果显示：编号1～4试纸条上质控线和检测线均出现条带，其它样本和阴性对照的试纸条上仅质控线出现条带。采用RPA-LFD方法检测北方根结线虫的雌虫，其检测灵敏度可达到0.001头雌虫。
常规PCR电泳检测结果如图6所示，其中1～7泳道分别为：1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5头雌虫和阴性对照。结果显示：当DNA浓度稀释至0.01头雌虫时，可观察到扩增条带，继续稀释时则不能观察到扩增条带，表明常规PCR检测灵敏度为0.01头雌虫。
上述结果说明，本发明所述的RPA-LFD引物、探针及检测方法可检测到0.001头北方根结线虫雌虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍，具有极高的检测灵敏度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院麻类研究所
<120> 基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的引物、探针、试剂盒及应用
<130> MP1935736
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcccaaatct tcattactaa tatgaatagt 30
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actcaattta atggaatgtg ctatttccaa g 31
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggcctctg tccaaccctt cctcttccaa gctcatattc atcagt 46

Claims (10)

1.引物探针组合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探针；
所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组合在检测北方根结线虫中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，待测样品为线虫样品、植物根组织样品和/或土壤样品。
4.如权利要求1所述的引物探针组合在制备北方根结线虫检测试剂或试剂盒中的应用。
5.检测北方根结线虫的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物探针组合。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括RPA冻干酶粉、RehydrationBuffer、MgAc、ddH2O、检测缓冲液和侧流层析试纸条中的一种或两者以上的组合物。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒在检测北方根结线虫中的应用。
8.一种基于RPA-LFD技术检测北方根结线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、提取待测样品的DNA；
步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物探针组合或如权利要求5或6所述的试剂盒，进行RPA扩增；
步骤3、根据步骤2中RPA扩增的结果判定所述待测样品中是否含有北方根结线虫。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2中所述RPA扩增的反应体系为50 μL：
DNA模板 2.0 μL Mh-RPA-F 2.1 μL Mh-RPA-R 2.1 μL Mh-RPA-P 0.6 μL Rehydration Buffer 29.5 μL RPA冻干酶粉 5.0 mg MgAc 2.5 μL ddH2O 补足至50 μL
。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤2中所述RPA扩增的反应条件为：37～42℃反应5～30 min。
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