CN105861708A - Lrrk2基因2385多态性检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，涉及基因多态性检测。包括引物、荧光探针和试剂；所述引物用于特异性扩增包含LRRK2基因2385位点的DNA片段，其碱基序列如SEQ IDNO：1和SEQ IDNO：2；荧光探针用于识别LRRK2基因2385多态性，荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。采用两条标记两种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内同时指示两种多态性的情况，其碱基序列如SEQ IDNO：3和SEQ IDNO：4；试剂包括MgCl2、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP和PCR反应缓冲液。

Description

LRRK2基因2385多态性检测试剂盒
技术领域
本发明涉及基因多态性检测，尤其是涉及一种LRRK2基因2385多态性检测试剂盒。
背景技术
帕金森病(PD)是除了阿尔茨海默病(AD)以外的第二常见的神经退行性疾病。在我国65岁以上人群中的PD患病率为1.17％，与欧美发达国家相似，这一比例在75岁以上的人群中上升到3％，因此帕金森病已成为我国现代社会严重危害人类健康的重大疾病之一。
帕金森病确诊的平均年龄为70岁，但是其症状却比临床确诊更早出现，因此寻找早期帕金森病生物学标志以及进行基因诊断，对于其风险预测以及后期预防极为重要。帕金森病从确诊到死亡一般会持续15年，有些可以活到20年甚至更久。目前关于它的发病原因和确切的发病机制还不是十分清楚，但普遍认为此病是由遗传、环境和老化相互作用导致的复杂性疾病。帕金森病的发病与遗传基因的突变密切相关，研究通过对家族性帕金森病病例的分析，在染色体上已发现至少有13个位点与家族性帕金森病相关。其中在中国人群中LRRK2基因突变最为常见。
到目前为止已经发现将近50个不同的LRRK2基因突变，其中大多数是错义突变。LRRK2基因变异具有种族的特异性，例如在欧洲人群中研究最为普遍的G2019R突变，在1％～4％的帕金森病病人中发现该基因突变，在葡萄牙人、犹太人和北非阿拉伯帕金森病病人中，G2019R的突变概率分别占6％、15％和40％(Tan E K,Shen H,Tan L C,et al.The G2019S LRRK2mutation is uncommon in an Asian cohort of Parkinson′s disease patients.Neurosci Let,2005,384(3):327-329)。但在中国人群中并未发现该位点的突变，而是发现了两个东亚人群的特异位点R1628P(rs33949390)、G2385R(rs34778348)会增加患病风险，这两个突变在亚洲帕金森病人群中占到5～9％(相对于正常人的3％)，并且这两个突变都增加了两倍的风险(Wang X,Zhang X,Xue L,et al.The association between the LRRK2 R1628P variant and the risk ofParkinson's disease in Asian:a meta-analysis.Neurosci Lett.2016；623:22-27.)。有文献报道(DiFonzo A,Wu-Chou YH,Lu CS,et al.,A common missense variant in the LRRK2 gene,Gly2385Arg,associated with Parkinson's disease risk in Taiwan.Neurogenetics.2006；7(3):133-8.)，中国汉族人群G2385R携带者帕金森病患病风险增加3.9倍。
G2385R多态性与LRRK2的WD40功能域有关，其机制可能是诱导WD40功能域上的N末端豆蔻酰化从而促使神经毒性的产生，触发细胞凋亡；同时，G2385R多态性使该结构域的正电荷大量增加，进而影响细胞的物质运输和信号传导，加速了LRRK2蛋白自身的聚集，促使各种神经纤维聚集体和包涵体的产生，从而干扰LRRK2与其他蛋白质间的相互作用。也有学者认为该位点突变会导致线粒体功能紊乱从而导致帕金森病发病。
因此，临床上对PD风险基因LRRK2的2385多态性进行检测，检测受测者是否携带相关基因型，可以协助医生诊断帕金森病，以便更及时地指导用药，大大减轻病人和家属的负担。对帕金森风险基因进行检测有助于风险基因携带的受测者提早对帕金森病进行预防和治疗，起到早检测早预防的作用。
目前应用于帕金森相关风险基因检测的技术主要是聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)法。该方法是根据LRRK2基因2385多态性位点的不同选择了一种限制性内切酶，该种内切酶只对其中的一种多态性具有切割的作用，而对另一种多态性不会产生切割。这种方法首先通过引物对LRRK2基因2385多态性位点进行PCR反应，然后对PCR产物使用限制性内切酶进行酶切反应，再把酶切产物进行电泳分析，根据所得到的片断大小来对LRRK2基因G2385R多态性位点进行分析。该方法存在诸多的不足。首先，该方法依靠限制性内切酶的活性，在酶切过程中容易产生假阳性和假阴性的结果；其次，电泳的方法容易造成致命的PCR产物污染，导致结果的误判；再次，该方法费时(约5～6h)，耗工，至少包括PCR扩增、酶切、电泳、凝胶成像分析四个步骤，需要大量人工操作，自动化程度低，人为误差大。
实时荧光PCR具有快速、准确、无污染的特点，已成为分子诊断实验室的常规仪器平台。目前，尚未见利用实时荧光PCR的方法来对LRRK2基因2385多态性进行研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供能快速、准确、高通量地对LRRK2基因2385多态性进行检测的一种LRRK2基因2385多态性检测试剂盒。
本发明包括引物、荧光探针和试剂；
所述引物用于特异性扩增包含LRRK2基因2385位点的DNA片段，其碱基序列如SEQIDNO：1和SEQ IDNO：2所述，引物序列可由其碱基互补序列替换；
所述荧光探针用于识别LRRK2基因2385多态性，所述荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。采用两条标记两种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内同时指示两种多态性的情况，其碱基序列如SEQ IDNO：3和SEQ IDNO：4所述，探针序列可由其碱基互补序列替换。
两种不同荧光基团包括任意发射波长不同的两种荧光基团(荧光基团和淬灭基团)的组合。常用的荧光基团包括但不局限于目前各种荧光标记物，如ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5.5等。常用的淬灭基团包括但不局限于目前各种淬灭剂、如DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPE等。
所述荧光探针包括但不局限于TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针、双环探针等中的至少一种。
所述试剂包括：MgCl2、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP和PCR反应缓冲液。
所述MgCl2的摩尔浓度可为1～5mmol/L，所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的摩尔浓度均可为50～400μmol/L，dUTP的摩尔浓度可为10～1000μmol/L。
所述热启动Taq酶的单位可为1～3U/反应，所述UNG酶的用量可为0.1～1U/反应。
与现有检测方法及相关技术相比，本发明具有以下突出优点：
(1)应用实时荧光PCR技术结合荧光探针，可以实时观察实验结果。同时检测更加快速(90min)，操作更加简便，易于自动化，且没有PCR产物污染的顾虑，提高了检测的准确性。
(2)在一个反应管中就可以对LRRK2基因2385多态性进行分析，节省成本的同时又提高了通量。
附图说明
图1为LRRK2基因2385多态性位点(rs34778348)c.7153碱基为G/G的DNA样本。
图2为LRRK2基因2385多态性位点(rs34778348)c.7153碱基为G/A的DNA样本。
图3为LRRK2基因2385多态性位点(rs34778348)c.7153碱基为A/A的DNA样本。
图4为反应检测纯水样本作为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，下列实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或者参数，任何在相关领域具备经验的技术人员，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的LRRK2基因G2385R多态性检测试剂盒。
实施例1实时荧光PCR检测3种类型的LRRK22385多态性位点(rs34778348)。
一.材料
1.仪器：实时荧光PCR仪、移液器、离心机。
2.引物、探针设计：本发明设计了可以特异扩增包含LRRK2基因2385多态性位点的DNA片段的引物，以及特异识别LRRK2基因2385多态性位点的探针。LRRK2基因2385多态性位点(rs34778348)c.7153碱基为G的探针标记为FAM，LRRK2基因2385多态性位点(rs34778348)c.7153碱基为A的探针标记为HEX。所以c.7153碱基为G/G的样本作为模板的反应管内，FAM频道应有扩增信号产生，HEX频道应没有扩增信号产生；以c.7153碱基为A/A的样本作为模板的反应管内，HEX频道应有扩增信号产生，FAM频道应没有扩增信号产生；以c.7153碱基为G/A的样本作为模板的反应管内，FAM和HEX频道应均有扩增信号产生。
用到的引物和探针信息如表1所示。
表1引物与探针信息列表
3.试剂：1×PCR buffer；MgCl2；热启动酶；UNG酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP。
二.方法
1.样本的选择
LRRK2基因2385多态性位点(rs34778348)c.7153碱基为G/G碱基的样本，LRRK2基因2385多态性位点(rs34778348)c.7153碱基为G/A的样本，LRRK2基因2385多态性位点(rs34778348)c.7153碱基为A/A的样本。所有的样本均已通过DNA测序的方法进行验证。
2.基因组DNA的提取
用常规分子生物学方法或市售试剂盒从抗凝全血中提取人基因组DNA。
3.实时荧光PCR扩增与检测
实时荧光PCR反应体系包括1×PCR buffer，3mmol/L Mg2+，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP，400μmol/LdUTP，400nmol/L的上、下游引物，400nmol/L各荧光探针，1U热启动酶，0.3U UNG酶，25ng人基因组DNA。
实时荧光PCR反应在Roche LightCycler 480Ⅱ仪器上进行，按以下条件进行扩增检测：
第一阶段：50℃2min；
第二阶段：95℃5min；
第三阶段：95℃20sec，62℃20sec(荧光采集)，72℃30sec，40个循环；
两个荧光检测频道分别为FAM和HEX。
4.结果分析
LRRK2基因2385多态性判定：只在FAM频道中有扩增信号产生的样本c.7153碱基为G/G；只在HEX频道中有扩增信号产生的样本c.7153碱基为A/A；在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本c.7153碱基为G/A。
从图1可以看出，只有在FAM频道中有扩增信号产生，所以该样本c.7153碱基为G/G。
从图2可以看出，在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生，所以该样本c.7153碱基为G/A。
从图3可以看出，只有在HEX频道中有扩增信号产生，所以该样本c.7153碱基为A/A。
从图4可以看出，FAM和HEX频道均没有扩增信号信号产生，为采用纯水作为阴性对照的结果。

Claims (8)

1.LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，其特征在于包括引物、荧光探针和试剂；
所述引物用于特异性扩增包含LRRK2基因2385位点的DNA片段，其碱基序列如SEQIDNO：1和SEQ IDNO：2所述，引物序列可由其碱基互补序列替换；
所述荧光探针用于识别LRRK2基因2385多态性，所述荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；采用两条标记两种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内同时指示两种多态性的情况，其碱基序列如SEQ IDNO：3和SEQ IDNO：4所述，探针序列可由其碱基互补序列替换；
所述试剂包括MgCl2、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP和PCR反应缓冲液。
2.如权利要求1所述LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，其特征在于所述两种不同荧光基团包括任意发射波长不同的两种荧光基团的组合；常用的荧光基团包括但不局限于目前各种荧光标记物，常用的淬灭基团包括但不局限于目前各种淬灭剂。
3.如权利要求2所述LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，其特征在于所述各种荧光标记物选自ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5.5中的一种。
4.如权利要求2所述LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，其特征在于所述各种淬灭剂选自DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPE中的一种。
5.如权利要求1所述LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针包括但不局限于TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针、双环探针中的至少一种。
6.如权利要求1所述LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，其特征在于所述MgCl2的摩尔浓度为1～5mmol/L，所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的摩尔浓度均为50～400μmol/L，dUTP的摩尔浓度为10～1000μmol/L。
7.如权利要求1所述LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，其特征在于所述热启动Taq酶的单位为1～3U/反应。
8.如权利要求1所述LRRK2基因2385多态性检测试剂盒，其特征在于所述UNG酶的用量为0.1～1U/反应。
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