CN107858420A - 用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针及检测方法 - Google Patents

用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针，包括针对TGFβI基因124位点设计的特异性引物、针对野生型位点R124的特异性野生型Taqman荧光探针、以及针对突变型位点C124、S124、H124以及L124的四条特异性突变型Taqman荧光探针中的至少一条，每条探针连接不同的荧光报告基团，以便通过采集不同的荧光信号进行分别监测，并且不需要添加内参。本发明还提供了基于上述引物探针的人TGFβI基因124位点变异的检测方法，具有灵敏度高、特异性强、不易污染、准确性好、方便快捷等优点，适合应用到临床病例分析和检验工作中。

Description

用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物 探针及检测方法
技术领域
本发明属于基因位点突变检测技术领域，特别涉及一种用于诊断 人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针及检测方法。
背景技术
角膜营养不良是一组双眼对称性的、遗传性的疾病，在某种基因 异常的诱导下，角膜不同层次的组织中蛋白质非典型的聚合，逐渐形 成沉淀物使角膜发生浑浊失去透明性，严重影响患者的视力及生活质 量。人转化生长因子β诱导(transforming growthfactor-beta induce， TGFβI)基因又称βIGH3基因，是首个被确定的角膜营养不良致病基因，超过50％的人角膜营养不良是由BIGH3的某些突变导致。目 前临床上用于近视治疗的方法为准分子激光治疗性角膜切削术PTK (Photo Therapeutic Keratectomy),主要是针对角膜瓣切削的一种手术， 如果角膜营养不良会提高手术风险和感染几率，一般不建议做PTK。
TGFβI基因突变热点主要位于外显子4、11、12。124位点和555 位点是两个最常见的突变位点。
目前发现124位点除野生型R124外还有4种变异形式，每种变异 形式会引起不同症状的角膜营养不良：
C124LCD1型，引起格子状角膜营养不良I型；
S124TBCD型，引起Thiel-Behnke角膜营养不良；
H124GCD2型，引起颗粒样角膜角膜营养不良II型；
L124RBCD，引起Reis-Buckler角膜营养不良。
因此，如果能在发病之前同时对上述几种突变情况进行筛查、并 准确判断是否有患病风险，就可以及时采取治疗措施，以便降低发病 率或病情的严重程度，从而控制疾病的发展、减轻患者的痛苦。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于诊断人TGFβI基 因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针及检测方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜 营养不良的引物探针，包括如下序列：
用于扩增TGFβI基因124位点的特异性引物对，所述特异性引物 对的碱基序列如下：
F：5’-CTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAG-3’；
R：5’-CAGACGGAGGTCATCTCACAG-3’；
针对野生型位点R124的特异性野生型Taqman荧光探针，所述荧 光探针的碱基序列如下：
R124：5’-GTACACGGACCGCACGGAG-3’；
以及至少一条针对突变型位点的特异性突变型Taqman荧光探针， 所述野生型Taqman荧光探针与所述突变型Taqman荧光探针的5’端均 连接有荧光报告基团、3’端均连接有荧光淬灭基团，且所述野生型 Taqman荧光探针的荧光报告基团与任意一条所述突变型Taqman荧光 探针的荧光报告基团均不相同。
TGFβI基因是指导转化生长因子β(TGF-β)合成的基因，长度约 为90000bp，其完整序列收录于NCBI GenBank，序列号NC018916.2； 124位点是其中最常见的突变位点之一，长度为790bp，其碱基序列如 下：
F引物和R引物是针对TGFβI基因124位点设计的，具有良好的 特异性，能够扩增出高度特异的片段，并且杂质极少，也为后续的鉴 定操作提供了便利；通过针对124位点的野生型和突变型分别设计具 有高度特异性的Taqman荧光探针，并分别连接不同的荧光报告基团， 通过采集扩增过程中的荧光讯号即可对124位点是否存在突变进行检 测，准确度高、敏感性好。
进一步地，所述突变型Taqman荧光探针包括分别针对突变型位点 C124、S124、H124以及L124的四条特异性突变型Taqman荧光探针 中的至少一条，所述荧光探针的碱基序列如下：
C124：5’-GTACACGGACTGCACGGAG-3’；
S124：5’-GTACACGGACAGCACGGAG-3’；
H124：5’-GTACACGGACCACACGGAG-3’；
L124：5’-GTACACGGACCTCACGGAG-3’。
进一步地，位于同一反应体系内的任意两条所述突变型Taqman荧 光探针的荧光报告基团均不相同。
上述探针是分别针对124位点的C124、S124、H124以及L124四 种突变形式设计的，通过分别连接不同的荧光报告基团，可以同时检 测两种或多种突变，便于快速、准确地进行TGFβI基因124位点多态 性的检测。
进一步地，所述野生型Taqman荧光探针与所述突变型Taqman荧 光探针的荧光报告基团均选自FAM、CY5、JOE、ROX、HEX、VIC、 TET或NED，荧光淬灭基团均选自MGB、TAMAR、BHQ或Eclipse。
进一步地，所述野生型Taqman荧光探针与所述突变型Taqman荧 光探针的荧光淬灭基团均为MGB。
MGB在荧光采集通道中的信噪比较高，可达到6～10，而普通修饰 的探针信噪比只有1.5左右，因此使用MGB进行修饰可以使探针具有 更低的荧光背景、更高的退火Tm值，从而提高检测的精确性。
本发明另外提供了一种人TGFβI基因124位点变异的检测方法， 包括如下步骤：
S1：提取受检者的基因组DNA；
S2：合成用于扩增TGFβI基因124位点的特异性引物对、针对野 生型位点R124的特异性野生型Taqman荧光探针以及针对突变型位点 C124、S124、H124以及L124的四条特异性突变型Taqman荧光探针， 所述野生型Taqman荧光探针与所述突变型Taqman荧光探针的5’端均 连接有荧光报告基团、3’端均连接有荧光淬灭基团，且所述野生型 Taqman荧光探针的荧光报告基团与任意一条所述突变型Taqman荧光 探针的荧光报告基团均不相同；
S3：利用步骤S2中得到的特异性引物对、特异性野生型Taqman 荧光探针以及至少一条特异性突变型Taqman荧光探针，对步骤S1中 的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，并对扩增结果进行分析。
进一步地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系包括如下成分：
模板DNA 0.1～0.2ng/μl、F引物和R引物各0.2μM、特异性野生 型Taqman荧光探针0.2μM、特异性突变型Taqman荧光探针各0.2μM、 dNTP 0.2～0.4mM、dUTP 0.3～0.6mM、Mg2+2.5～4.0mM、DNA聚合酶 0.1～0.2U/μL以及尿嘧啶-N-糖基化酶0.01～0.05U/μL。
在本方法的反应体系中采用UNG/dUTP防污染技术，在扩增过程 中以脱氧尿苷(d-UTP)代替脱氧胸苷(d-TTP)，从而得到含有d-UTP 的扩增产物；而尿苷酶(UNG)能特异地破坏含有d-UTP的核酸，使 含有d-UTP的扩增产物不能作为扩增模版，但不会影响不含d-UTP的 天然的核酸，因此只要在扩增反应前加入UNG酶，就可以在不影响天 然核酸的前提下破坏反应液中含有d-UTP的核酸，随后将UNG酶灭活， 再进行扩增即可。由此有效地防止实验室内其他扩增产物的污染，避 免假阳性的出现。
进一步地，同一反应体系内的任意两种所述突变型Taqman荧光探 针的荧光报告基团均不相同。
进一步地，所述DNA聚合酶为Hot-Start Taq酶。
Hot-Start Taq酶是通过抗体或其他修饰把耐热Taq酶保护起来，不 让Taq酶在温度较低时即与引物发生反应，从而减少背景和非特异性 扩增的干扰。
进一步地，所述荧光定量PCR扩增的反应条件如下：
(1)预变性：95℃5min；
(2)预扩增：95℃15s，65℃45s，共3个循环；
(3)扩增：95℃15s，65℃45秒，共40个循环，每个循环结束 时采集荧光信号。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种用于诊断人TGFβI基 因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针及检测方法，具有以下 优点：
(1)敏感性高：由于人基因组DNA整体差异较小，引物匹配率 较高，通过PCR反应放大后再用较灵敏的荧光采集系统，能够在极微 量基因组DNA存在情况下检测出TGFβI基因124位点的多态性；
(2)特异性强：使用特异性双探针对SNP变异进行识别，同时 Taqman探针用MGB修饰后大大提高探针的Tm值，增加了其信噪比， MGB信噪比为6～10，普通修饰的探针信噪比只有1.5左右，所以MGB 修饰的探针具有更低的荧光背景，更高的退火Tm值；
(3)PCR反应试剂中加入dUTP和UNG酶，可以防止PCR扩增 模板气溶胶的污染。同时扩增和检测在同一管中进行，只需加开盖加 一次模板DNA，大大降低了污染的可能性；扩增和检测一步完成，不 需后期特殊处理，不必担心放射性污染；
(4)结果分析简单：该方法中只有检测基因124位点的野生和突 变特异性Taqman探针，不需要内参，降低了PCR反应体系中引物和 探针的复杂程度，进一步提高定性判断124位点突变的准确性；
(5)检测快速：PCR反应时间短，同时检测通量较高，可在3小 时内完成检测。
通过本发明提供的引物探针及检测方法对人TGFβI基因124位点 变异进行检测，具有灵敏、特异、稳定、简便、可重复性好等优点， 适合应用到临床病例分析和检验工作中。
附图说明
图1为实验例1中PCR扩增随时间变化的扩增曲线；
图2为实验例1中PCR扩增随温度变化的扩增曲线；
图3为实验例1中PCR扩增的溶解曲线；
图4为实验例2中样本1的C124和H124突变扩增曲线；
图5为实验例2中样本1的L124突变扩增曲线；
图6为实验例2中样本1的S124突变扩增曲线；
图7为实验例2中样本2的C124和H124突变扩增曲线；
图8为实验例2中样本2的L124突变扩增曲线；
图9为实验例2中样本2的S124突变扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引 物探针，包括如下序列：
用于扩增TGFβI基因124位点的特异性引物对，所述特异性引物 对的碱基序列如下：
F：5’-CTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAG-3’；
R：5’-CAGACGGAGGTCATCTCACAG-3’；
针对野生型位点R124的特异性野生型Taqman荧光探针，所述荧 光探针的碱基序列如下：
R124：5’-FAM-GTACACGGACCGCACGGAG-MGB-3’；
分别针对突变型位点C124和H124的两条特异性突变型Taqman 荧光探针，所述荧光探针的碱基序列如下：
C124：5’-JOE-GTACACGGACTGCACGGAG-MGB-3’；
H124：5’-ROX-GTACACGGACCACACGGAG-MGB-3’。
实施例2
一种用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引 物探针，包括如下序列：
用于扩增TGFβI基因124位点的特异性引物对，所述特异性引物 对的碱基序列如下：
F：5’-CTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAG-3’；
R：5’-CAGACGGAGGTCATCTCACAG-3’；
针对野生型位点R124的特异性野生型Taqman荧光探针，所述荧 光探针的碱基序列如下：
R124：5’-FAM-GTACACGGACCGCACGGAG-MGB-3’；
针对突变型位点L124的特异性突变型Taqman荧光探针，所述荧 光探针的碱基序列如下：
L124：5’-CY5-GTACACGGACCTCACGGAG-MGB-3’。
实施例3
一种用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引 物探针，包括如下序列：
用于扩增TGFβI基因124位点的特异性引物对，所述特异性引物 对的碱基序列如下：
F：5’-CTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAG-3’；
R：5’-CAGACGGAGGTCATCTCACAG-3’；
针对野生型位点R124的特异性野生型Taqman荧光探针，所述荧 光探针的碱基序列如下：
R124：5’-FAM-GTACACGGACCGCACGGAG-MGB-3’；
针对突变型位点S124的特异性突变型Taqman荧光探针，所述荧 光探针的碱基序列如下：
S124：5’-CY5-GTACACGGACAGCACGGAG-MGB-3’。
实施例4
一种人TGFβI基因124位点变异的检测方法，其特征在于，包括 如下步骤：
S1：提取受检者的基因组DNA：留取受试者EDTA抗凝全血0.5ml， 采用QiagenGenemic Blood Kit提取全血DNA，提取的DNA样本于 -20℃下保存，使用时室温溶解并充分混匀、离心；
S2：合成实施例1所述的特异性引物对、特异性野生型Taqman荧 光探针以及特异性突变型Taqman荧光探针；
S3：利用步骤S2中得到的特异性引物对、特异性野生型Taqman 荧光探针以及至少一条特异性突变型Taqman荧光探针，对步骤S1中 的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，反应体系如下：
模板DNA 2μl、F引物0.2μM、R引物0.2μM、R124荧光探针0.2μM、 C124荧光探针0.2μM、H124荧光探针0.2μM、dNTP 0.4mM、dUTP 0.6mM、Mg2+4.0mM、DNA聚合酶0.4U以及尿嘧啶-N-糖基化酶0.1U/μL，用ddH20补足至50μl；
反应条件如下：
(1)预变性：95℃5min；
(2)预扩增：95℃15s，65℃45s，共3个循环；
(3)扩增：95℃15s，65℃45秒，共40个循环，每个循环结束 时采集荧光信号。
实施例5
一种人TGFβI基因124位点变异的检测方法，其特征在于，包括 如下步骤：
S1：提取受检者的基因组DNA：留取受试者EDTA抗凝全血0.5ml， 采用QiagenGenemic Blood Kit提取全血DNA，提取的DNA样本于 -20℃下保存，使用时室温溶解并充分混匀、离心；
S2：合成实施例2所述的特异性引物对、特异性野生型Taqman荧 光探针以及特异性突变型Taqman荧光探针；
S3：利用步骤S2中得到的特异性引物对、特异性野生型Taqman 荧光探针以及至少一条特异性突变型Taqman荧光探针，对步骤S1中 的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，反应体系如下：
模板DNA 1μl、F引物0.2μM、R引物0.2μM、R124荧光探针0.2μM、 L124荧光探针0.2μM、dNTP 0.2mM、dUTP 0.3mM、Mg2+2.5mM、 Hot-Start Taq酶0.2U以及尿嘧啶-N-糖基化酶0.02U/μL，用ddH20补 足至50μl；
反应条件如下：
(1)预变性：95℃5min；
(2)预扩增：95℃15s，65℃45s，共3个循环；
(3)扩增：95℃15s，65℃45秒，共40个循环，每个循环结束 时采集荧光信号。
实施例6
一种人TGFβI基因124位点变异的检测方法，其特征在于，包括 如下步骤：
S1：提取受检者的基因组DNA：留取受试者EDTA抗凝全血0.5ml， 采用QiagenGenemic Blood Kit提取全血DNA，提取的DNA样本于 -20℃下保存，使用时室温溶解并充分混匀、离心；
S2：合成实施例3所述的特异性引物对、特异性野生型Taqman荧 光探针以及特异性突变型Taqman荧光探针；
S3：利用步骤S2中得到的特异性引物对、特异性野生型Taqman 荧光探针以及至少一条特异性突变型Taqman荧光探针，对步骤S1中 的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，反应体系如下：
模板DNA 1.5μl、F引物0.2μM、R引物0.2μM、R124荧光探针 0.2μM、S124荧光探针0.2μM、dNTP 0.3mM、dUTP 0.45mM、Mg2+ 3.0mM、Hot-Start Taq酶0.2U以及尿嘧啶-N-糖基化酶0.02U，用ddH20 补足至50μl；
反应条件如下：
(1)预变性：95℃5min；
(2)预扩增：95℃15s，65℃45s，共3个循环；
(3)扩增：95℃15s，65℃45秒，共40个循环，每个循环结束 时采集荧光信号。
实验例1
特异性实验
取两位受试者的基因组DNA，应用实施例中提供的F引物和R引 物，对受试者基因组DNA中TGFβI基因的124位点进行扩增，反应体 系如下：
2×Takara SYBR PreMix 10μl，F引物0.2μM、R引物μM、Taq DNA 聚合酶0.2U、模板DNA 2ul，用ddH20水补足至50ul；
反应条件如下：
(1)95℃5min；
(2)95℃20s，60℃40s，共5个循环；
(3)95℃15s，60℃35s(采光)，共35个循环；
(4)70℃～95℃熔解曲线。
实验结果如图1～3所示，扩增曲线良好，溶解曲线单一平滑。说 明本发明提供的引物具有良好的特异性，得到的扩增产物单一、不易 产生假阳性结果，使得检测结果更加准确可靠。
实验例2
符合率试验
取10位受试者的外周全血样本基因组DNA，分别应用实施例4～6 提供的方法对受试者基因组DNA中TGFβI基因的124位点进行荧光定 量PCR检测，在荧光定量PCR仪上采集FAM、JOE、ROX以及CY5 的荧光信号，并对结果进行分析。仅有FAM标记的Taqman探针扩增 是野生型R124，JOE标记的Taqman探针扩增是C124突变型，ROX 标记的Taqman探针扩增是H124突变型，CY5标记的Taqman探针扩 增是S124和L124突变型，所以样本总会有阳性探针扩增，不需要另 外添加内参。
实验结果如表1所示，使用本发明提供的引物探针和检测方法， 得到的检测结果准确率良好，可达到100％。
表1 10份全血样本TGFβI基因124位点多态性检测结果
以样本1和样本2作为典型样本，其扩增曲线如图4～9所示，使 用本发明提供的引物探针和检测方法，可以得到良好、平滑的扩增曲 线，该方法和引物探针敏感性高、特异性强，可快速得到精确的检测 结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具 体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指 出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前 提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。 因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 奥斯汀生命科学技术公司
<120> 用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针及检测方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
cttctgtctt ctgctcctgc ag 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
cagacggagg tcatctcaca g 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
gtacacggac cgcacggag 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
gtacacggac tgcacggag 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
gtacacggac agcacggag 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
gtacacggac cacacggag 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
gtacacggac ctcacggag 19

Claims (10)

1.一种用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针，其特征在于，包括如下序列：
用于扩增TGFβI基因124位点的特异性引物对，所述特异性引物对的碱基序列如下：
F：5’-CTTCTGTCTTCTGCTCCTGCAG-3’；
R：5’-CAGACGGAGGTCATCTCACAG-3’；
针对野生型位点R124的特异性野生型Taqman荧光探针，所述荧光探针的碱基序列如下：
R124：5’-GTACACGGACCGCACGGAG-3’；
以及至少一条针对突变型位点的特异性突变型Taqman荧光探针，所述野生型Taqman荧光探针与所述突变型Taqman荧光探针的5’端均连接有荧光报告基团、3’端均连接有荧光淬灭基团，且所述野生型Taqman荧光探针的荧光报告基团与任意一条所述突变型Taqman荧光探针的荧光报告基团均不相同。
2.如权利要求1所述的用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针，其特征在于，所述突变型Taqman荧光探针包括分别针对突变型位点C124、S124、H124以及L124的四条特异性突变型Taqman荧光探针中的至少一条，所述荧光探针的碱基序列如下：
C124：5’-GTACACGGACTGCACGGAG-3’；
S124：5’-GTACACGGACAGCACGGAG-3’；
H124：5’-GTACACGGACCACACGGAG-3’；
L124：5’-GTACACGGACCTCACGGAG-3’。
3.如权利要求1所述的用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针，其特征在于，位于同一反应体系内的任意两条所述突变型Taqman荧光探针的荧光报告基团均不相同。
4.如权利要求1所述的用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针，其特征在于，所述野生型Taqman荧光探针与所述突变型Taqman荧光探针的荧光报告基团均选自FAM、CY5、JOE、ROX、HEX、VIC、TET或NED，荧光淬灭基团均选自MGB、TAMAR、BHQ或Eclipse。
5.如权利要求4所述的用于诊断人TGFβI基因124位点变异引起角膜营养不良的引物探针，其特征在于，所述野生型Taqman荧光探针与所述突变型Taqman荧光探针的荧光淬灭基团均为MGB。
6.一种人TGFβI基因124位点变异的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：提取受检者的基因组DNA；
S2：合成用于扩增TGFβI基因124位点的特异性引物对、针对野生型位点R124的特异性野生型Taqman荧光探针以及针对突变型位点C124、S124、H124以及L124的四条特异性突变型Taqman荧光探针，所述野生型Taqman荧光探针与所述突变型Taqman荧光探针的5’端均连接有荧光报告基团、3’端均连接有荧光淬灭基团，且所述野生型Taqman荧光探针的荧光报告基团与任意一条所述突变型Taqman荧光探针的荧光报告基团均不相同；
S3：利用步骤S2中得到的特异性引物对、特异性野生型Taqman荧光探针以及至少一条特异性突变型Taqman荧光探针，对步骤S1中的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，并对扩增结果进行分析。
7.如权利要求6所述的人TGFβI基因124位点变异的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系包括如下成分：
模板DNA 0.1～0.2ng/μl、F引物和R引物各0.2μM、特异性野生型Taqman荧光探针0.2μM、特异性突变型Taqman荧光探针各0.2μM、dNTP 0.2～0.4mM、dUTP 0.3～0.6mM、Mg2+2.5～4.0mM、DNA聚合酶0.1～0.2U/μL以及尿嘧啶-N-糖基化酶0.01～0.05U/μL。
8.如权利要求7所述的人TGFβI基因124位点变异的检测方法，其特征在于，同一反应体系内的任意两种所述突变型Taqman荧光探针的荧光报告基团均不相同。
9.如权利要求7所述的人TGFβI基因124位点变异的检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Hot-Start Taq酶。
10.如权利要求6所述的人TGFβI基因124位点变异的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应条件如下：
(1)预变性：95℃5min；
(2)预扩增：95℃15s，65℃45s，共3个循环；
(3)扩增：95℃15s，65℃45秒，共40个循环，每个循环结束时采集荧光信号。
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