CN112877423A

CN112877423A - 一种检测lrrk2基因2385多态性的引物和探针及试剂盒

Info

Publication number: CN112877423A
Application number: CN202110280938.3A
Authority: CN
Inventors: 李振韬; 郭力榕; 马雨薇; 黄俊清
Original assignee: Jiangsu Begel Biomedical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Begel Biomedical Co ltd
Priority date: 2021-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2021-06-01

Abstract

本发明公开了一种检测LRRK2基因2385位点多态性的引物和探针及试剂盒。利用1对LRRK2基因2385位点特异性引物，扩增人类LRRK2基因2385位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。本发明在保证检出特异性和灵敏度的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。

Description

一种检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针及试剂盒，属于基因多态性检测技术领域。

背景技术

人LRRK2基因位于染色体12p11.2–q13.1，长约144kb(含有7581个碱基对)，含有51个外显子，编码一个由2527个氨基酸组成的蛋白质(分子量为275KDa)，LRRK2蛋白(又称为dardarin蛋白或富亮氨酸重复序列激酶2)，属于ROCO蛋白家族。

帕金森病(PD)是目前世界上第二大进行性神经退行性疾病。富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因的某些突变和风险变异在PD患者中非常常见，约占家族性和散发性PD的5-15％。到目前为止，已经发现了近100个LRRK2变种。其中，G2019S、R1628P和G2385R在传统上受到了很大的关注。这些变种各有不同的地理分布。G2019S是欧洲/西亚人群最常见的变异，在欧洲人群中占家族性PD病例的3％，在德系犹太人(AJ)中占近14％，而在亚洲人群中极少见。G2385R、R1628P和A2385V在东亚人群中更为常见，其中G2385R、R1628P两个突变在亚洲帕金森病人群中占5-9％，并且这两个突变都增加了帕金森病2倍的风险。而A2385V可提示亚洲人群早发型帕金森病的风险。

携带LRRK2 G2385R突变的帕金森病患者较非携带者更常有帕金森病家族史，病程更长，MMSE评分更高。不仅在10％的PD病例中发现了G2385R变异，而且在3-4％的未发病人群中也发现该变异。LRRK2基因Gly2385Arg突变位点仅在亚洲人群中被发现。该位点位于LRRK2基因第48外显子的WD40结构域，使第7153号核苷酸G变成A，相应密码子GGG变成了GGA。当出现Gly2385Arg变异时，具有亲水性并带有正电荷的精氨酸取代了疏水性的甘氨酸，从而改变了WD40结构域表面电荷及其构象，进而与其他蛋白质发生新的相互作用，同时阻止与原来结合甘氨酸的蛋白质的相互作用，最终影响LRRK2蛋白的功能表现。目前已有多项研究发现LRRK2基因Gly2385Arg位点与散发性帕金森病相关。

PD前驱期是指PD神经退行性变的症状或体征，不伴有典型的运动帕金森症。遗传学发现，结合年龄、环境危险因素和其他诊断标记物检测，在前驱性PD的诊断中发挥重要作用。LRRK2 G2385R在亚洲人群中是一个危险因素，包括中国人和非中国人。这可能有助于进一步探索帕金森病的病因学和生物标志物，特别是在亚洲人群中。

现有技术存在如下缺陷和不足：

现有市面上无上市试剂盒对其进行检测；我们的试剂盒特异性筛选ARMS引物与MGB探针，特异性非常强，结果判读无需计算，清晰明确。

现有技术只能通过测序法进行检测，测序所需机器和耗材昂贵，并且对操作人员素质要求较高，普通医院几乎无测序服务，不利于基因位点的筛查，而我们的基因检测试剂所用的是荧光定量PCR法，能够兼容目前几乎所有的荧光定量PCR仪器，并且在新冠疫情中荧光定量PCR技术发挥了不可替代的作用，成为检测行业的主流，应用前景十分广阔。

在临床操作层面，目前相关基因测序没有专门的收费标准，由于高通量测序适用于多个位点同时检测，单独检测一个基因位点成本很高，因此一般来说是按照多个位点进行收费，病人经济承受压力较大。而我们的荧光定量PCR检测试剂则没有这种情况，一个位点就是按一位点的价格进行收费。

现有医院测序一般是委托第三方医学检验公司，检验周期较长，而PCR荧光检测试剂盒最快两小时即可得出结果，不仅省去了病人来回的交通成本，而且还有助于医生及时对患者进行辅助诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种LRRK2基因2385位点多态性的检测试剂盒，以克服现有检测技术中的不足，以实现快速、高通量、低成本的检测LRRK2基因2385位点多态性，其灵敏度高、特异性强。

本发明的试剂盒利用1对亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因2385特异性引物，扩增人类LRRK2基因2385位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针(5’末端标记FAM荧光素和5’末端标记VIC荧光素)，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

本发明的试剂盒设置了UNG酶+dUTP防污染措施，即PCR扩增利用UNG酶将可能存在的PCR产物污染充分降解。以排除由此可能引起的假阳性结果。

本发明的试剂盒以人类GAPDH基因作为内参基因设计特异性引物和探针(5’末端标记ROX荧光素)，实时检测系统的工作情况，以此排除假阴性结果。

本发明提供的一种检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针，包括检测LRRK2基因2385位点ARMS引物和探针；

所述检测LRRK2 2385位点ARMS引物对及MGB探针包括：

2385A位点：5’-AAAGGGCACGCAGTCTATTAGTCT-3’(SEQ ID NO.1)

2385G位点：5’-AAGGGCACGCAGTCTATTAGTCC-3’(SEQ ID NO.2)

2385下游通用引物：5’-GCAGCTTTCAGTGATTCC-3’(SEQ ID NO.3)

2385A探针5’VIC-AAAAACTCTGTAGCCTA-3’MGB(SEQ ID NO.4)

2385G探针5’FAM-AAAAACTCTGTGTGCTA-3’MGB(SEQ ID NO.5)

检测LRRK2基因2385多态性的试剂盒，包括上述的检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针。

优选地，试剂盒还包括检测内部质控的内参引物对及探针：

内参上游引物5’-ACTGTGGCGTGATGGCCG-3’(SEQ ID NO.6)

内参下游引物5’-CTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3’(SEQ ID NO.7)

内参探针5’ROX-TGAACGGGAAGCTCACTGGCAT-3’BHQ2(SEQ ID NO.8)

上述探针两种不同荧光基团包括任意发射波长不同的两种荧光基团的组合。常用的荧光基团包括但不限于现有的各种荧光标记物，如FAM、HEX、VIC、JOE、TET、ALEX-30、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5.5等。常用的淬灭基团包括但不限于目前各种淬灭剂，如Dabcyl、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipe、NFQ-MGB等。

所述荧光探针包括但不限于TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、Light Cycler探针、双环探针等中的至少一种。

优选地，上述试剂盒还包括具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液，所述预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、MUSTANG PURPLE荧光校准染料、dNTP、MgCl₂、PCRbuffer。

优选地，上述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为混合LRRK2基因2385A、2385G基因质粒DNA和内参质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。

本发明的基因多态性包括LRRK2基因2385AA型、2385GG型、2385GA型三种基因多态性。

本发明所达到的有益效果：

1.特异性高：试剂盒采用ARMS引物与MGB探针，特异性检测基因多态性。

2.灵敏度高：可以准确检测1ng基因组DNA的基因型。

3.安全无创：样本不但可以采用血液样本，还可以采集人口腔上皮细胞方便快捷。

4.多重反应：每个反应体系进行多重反应，检测同一位点的2种多态性，减少检测操作步骤，降低成本、提高检测效率，有利于临床检测分析应用。

5.UNG酶防污染体系，室温条件即可有效降解PCR产物，不需要额外增加程序时间，缩短检测时间。

6.结果判读无需计算，便捷直观，对操作人员要求不高。

本发明在保证检出特异性和灵敏度的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。

附图说明

图1是LRRK2 2385G/G野生型样本的检测结果图；

图2是LRRK2 2385A/A纯合突变型样本的检测结果图；

图3是LRRK2 2385G/A杂合突变型样本的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例：

1、试剂盒主要组成成分

2、试剂准备

2.1取出PCR反应液(2385位点)，在室温(25℃)下融化，振荡混匀30s，并2000rpm离心10s。

2.2核算当次实验所需的反应数(n)，按照16μL/孔分装量将每种PCR反应液分别分装到n个反应管内。不同体系间需要做好标记，勿混淆。PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回低于-15℃冰箱冷冻避光保存。

n＝样本数+阴性对照(1人份)+阳性对照(1人份)

3、加样

3.1将待检测样本的基因组DNA、阴性对照和阳性对照，分别加入已装有PCR反应液的反应管中，加入DNA量为4μL/孔。

3.2盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况。将上述PCR扩增管4000rpm离心5min，避免管壁挂珠；将PCR反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。若PCR反应管内加入模板后遇临时状况不能立即上机，建议将加样好模板的PCR反应管放于2～8℃条件下暂时保存，并在2小时内尽快上机检测。

4、PCR扩增(在扩增与分析区进行，请参照各仪器使用说明书进行设置)

4.1开机，并进行仪器性能自检。

4.2取上述已加入待检测DNA的PCR反应管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。

4.3循环参数设定(Protocol)：

4.4运行反应程序。

5、结果分析

反应结束后对扩增曲线和相应内参的曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline threshold的Begin值，以及End值(用户可根据实际情况自行调整，Begin值可设在2～15、End值可设在5～25，调整阴性对照品的扩增曲线平直或低于阈值线)，使其刚好超过正常阴性对照品的最高点，然后记录定量结果。

检测结果有效性判定：

(1)阴性对照品：FAM、VIC通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或者轻微斜线，无明显指数增长期，无Ct(Cq)值或检测Ct(Cq)值＞35；

(2)阳性对照品：FAM、VIC通道Ct(Cq)值≤35，扩增曲线有明显指数增长期。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。

样本有效性的判定：

(1)内参基因：所有样本检测中ROX通道Ct值＜35，扩增曲线有明显指数增长期。

(2)如图1-3所示，检测结果的判定：

本发明与现有技术相比：

现有技术特异性不强，野生型和突变型区别不够明显，需采用△Ct并结合扩增曲线判读，结果判读繁琐，对判读人员要求高；本案的试剂盒特异性筛选ARMS引物与MGB探针，特异性非常强，结果判读无需计算，清晰明确。

现有技术中检测LRRK2基因2385位点多态性时对样本处理要求高，多需要血液样本；本案的试剂盒样本不但可以采用血液样本还可以采集人口腔上皮细胞，无需采血，安全无创，方便快捷。

现有技术每次检测，每个检测体系只能进行单重PCR反应，每个反应体系只能检测一个基因位点多态性的不足；本案的基因检测试剂将多对引物和多条经不同荧光染料基团修饰的特异性荧光探针与PCR预混液配制预混成一个反应体系，使不同靶基因在多对特异性引物结合下高效多重PCR扩增，并利用标记不同荧光染料基团的MGB-NFQ和TaqMan-BHQ荧光探针对目标产物进行实时检测分析。

现有技术PCR反应防污染体系需要额外增加程序时间，本发明的基因检测试剂UNG酶防污染体系，室温条件即可有效降解PCR产物，不需要额外增加程序时间，缩短了检测时间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏贝格尔生物医药有限公司

<120> 一种检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针及试剂盒

<141> 2021-03-16

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagggcacg cagtctatta gtct 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagggcacgc agtctattag tcc 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcagctttca gtgattcc 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaaactctg tagccta 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaactctg tgtgcta 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actgtggcgt gatggccg 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccgacgcc tgcttcacca c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgaacgggaa gctcactggc at 22

Claims

1.一种检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针，其特征在于包括检测LRRK2基因2385位点ARMS引物和探针；

所述检测LRRK2 2385位点ARMS引物对及MGB探针包括：

2385A位点：5’-AAAGGGCACGCAGTCTATTAGTCT-3’

2385G位点：5’-AAGGGCACGCAGTCTATTAGTCC-3’

2385下游通用引物：5’-GCAGCTTTCAGTGATTCC-3’

2385A探针5’-AAAAACTCTGTAGCCTA-3’

2385G探针5’-AAAAACTCTGTGTGCTA-3’

所述2385A探针为Taqman探针，5’端修饰荧光基团，3’端修饰淬灭基团；

所述2385G探针为Taqman探针，5’端修饰荧光基团；3’端修饰淬灭基团。

2.检测LRRK2基因2385多态性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的检测LRRK2基因2385多态性的试剂盒，其特征在于,还包括检测内部质控的内参引物对及探针：

内参上游引物5’-ACTGTGGCGTGATGGCCG-3’

内参下游引物5’-CTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3’

内参探针5’-TGAACGGGAAGCTCACTGGCAT-3’

所述内参探针为Taqman探针，5’端修饰荧光基团,3’端修饰淬灭基团。

4.根据权利要求2所述的检测LRRK2基因2385多态性的试剂盒，其特征在于,还包括具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液，所述预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、MUSTANG PURPLE荧光校准染料、dNTP、MgCl₂、PCR buffer。

5.根据权利要求2所述的检测LRRK2基因2385多态性的试剂盒，其特征在于,还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为混合LRRK2基因2385A、2385G基因质粒DNA和内参质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。