TW201428108A

TW201428108A - 區分犬焦蟲症分型的方法

Info

Publication number: TW201428108A
Application number: TW102100134A
Authority: TW
Inventors: Zhuo-Yuan You; su-lian Chen; jing-hui Guo; si-han Huang
Original assignee: Genomics Bioscience & Technology Co Ltd
Priority date: 2013-01-03
Filing date: 2013-01-03
Publication date: 2014-07-16
Also published as: TWI532844B

Abstract

本發明揭露一種區分犬焦蟲症分型的方法，其步驟包括：(a)提供一核酸樣本；(b)對該核酸樣本進行一定量即時聚合酶鏈鎖反應(Q real-time PCR)；以及(c)進行一熱熔解曲線(melting curve)分析以區分該核酸樣本之犬焦蟲症分型；其中該犬焦蟲症分型包括犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)，且該即時定量聚合酶連鎖反應所使用之引子對係針對該核酸樣本中編碼熱休克蛋白基因之區段。

Description

區分犬焦蟲症分型的方法

本發明係關於一種區分動物病原微生物的方法，特別是關於一種區分犬焦蟲症分型的方法。

隨著少子化、高齡化的趨勢，愈來愈多的寵物進入家庭，成了現代人最重要的「伴侶動物」。據統計，粗估一年台灣寵物相關市場高達250億元，寵物量增多相對於獸醫的需求也越來越多，動物醫學顯得日益重要。

目前寵物狗的比例占了整體寵物的一半以上，隨著養寵物人口的增加，獸醫院的患病率也隨之提升。由於寵物在被某些病原菌感染後，易有危害身體器官組織，甚至嚴重導致死亡的情況產生，因此把握疾病診斷的黃金期極為重要，獸醫市場對於快速檢測的需求也極為迫切。針對病原菌的檢測在人醫系統上已建立良好的快篩或快速檢驗模式，但在獸醫系統的建立並不完善，現階段僅針對少數貓狗的病原菌開發出快篩，如狗的四合一快篩套組(心絲蟲、萊姆病病原、犬型/馬型艾利希體、血小板型艾利希體)、貓的三合快篩(貓免疫不全病毒、貓白血病病毒、心絲蟲)，因此陸續建立其他犬貓傳染性病原菌的快篩試劑套組或快速檢驗模式已是現今獸醫系統的重點。

焦蟲症是一種血液方面的疾病，由血液寄生蟲所引起，這種寄生蟲稱為焦蟲，是一種「原蟲」，它會導致狗的進行性的貧血。傳播媒介主要是壁蝨(Tick)叮咬，也有少部分是因為輸血及經由胎盤感染給胎兒。

感染後出現症狀大概需要10-20天左右，初期常沒有顯著的症狀，僅會缺乏食慾，然紅血球細胞的主要功能是攜帶氧氣，如果被寄生蟲感染則攜氧功能會降低，缺氧的結果導致精神狀況逐漸變差，嚴重造成自體白血球的吞噬細胞將自身的紅血球吞噬。犬隻在感染後出現的反應與症狀不同，主要分為非特異性、慢性與急性感染。非特異性感染的時候症狀較多，會有腹水、腸胃道症狀、神經症狀、周邊水腫以及心肺疾病。慢性感染時狗會有間斷性的發燒、食慾不振與體重減輕；而急性感染會有體溫上升、黏膜蒼白、血斑、黃疸、肝脾腫大、甚至急性死亡。

目前已有超過一百多種的焦蟲，感染狗的主要分為大、小焦蟲兩型，大焦蟲又名犬焦蟲(Babesia canis)，小焦蟲又名吉布松氏焦蟲(Babesia gibsoni)。當發生焦蟲感染的時候，通常只會出現其中一種，不是大焦蟲就是小焦蟲，很少有混合感染的情形，由於在用藥上有差異，因此需要小心且快速的鑑別，以免延誤病情，造成後續難以根治，且有復發可能。焦蟲的檢測目前尚無快篩或快速檢測方法，因此開發快速與精確的檢測技術是勢在必行。

傳統的焦蟲檢測方式是以血液抹片檢查，不論是大焦蟲或是小焦蟲都會在紅血球內的黑點周邊出現特異性半透明指環，通常在紅血球中發現一顆黑點代表Babesia gibsoni感染，而雙梨形黑點則是感染Babesia canis的特徵。然以此法發現病原的機率並不高，一般都是發病一段時間，焦蟲數目累積一定數量時才看得見。

早期的焦蟲感染較難從血液抹片中發現，而以傳統的PCR技術檢測，其引子(primer)可能與非焦蟲的DNA(亦即病患自己的DNA)結合，造成偽陽性的問題產生，該領域之習知技藝者已有人將Nested PCR(巢式PCR)技術應用於焦蟲檢測上。Nested PCR主要是利用兩對primer進行兩輪PCR擴增反應。第一輪的擴增與傳統PCR無異，第一輪PCR後的產物再以第二對primer進行專一性的擴增，藉由兩次PCR擴增，降低了複製到焦蟲以外DNA的機率，偵測靈敏度提升了10²~10³倍，但因為2次PCR易有交叉感染，仍無法做到精準分型與避免偽陽性的產生。

Nested PCR的缺點是實驗操作步驟繁瑣，PCR後無法直接看到結果，需以電泳進一步確認有無焦蟲的cDNA存在，且因為大、小焦蟲的18S rDNA基因序列太過相近，僅有某幾個鹼基不同，因此雖然設計2組不同的primer進行區分，在電泳圖上不一定可以從條帶看出分型，還需以核酸定序儀或是限制酶RFLP確認，因此至少需要一天以上才能得到檢驗報告。在耗時與精確度尚可的情況之下，有必要發展更快速與更精確的檢測方式來提升焦蟲檢驗的品質。

承前所述，考量到市場的需求以及現今檢測技術的問題，亟需建立一種快速且精確的犬焦蟲症分型檢測技術，以滿足獸醫診斷上時效性的需求，此技術概念的建立也方便日後在獸醫系統上其他病原菌快速檢測模式的仿效。

緣此，本發明提供一種區分犬焦蟲症分型的方法，其步驟包括：(a)提供一核酸樣本；(b)對該核酸樣本進行一定量即時聚合酶鏈鎖反應(Q real-time PCR)：以及(c)進行一熱熔解曲線(melting curve)分析以區分該核酸樣本之犬焦蟲症分型；其中該犬焦蟲症分型包括犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)，且該即時定量聚合酶連鎖反應所使用之引子對係針對該核酸樣本中編碼熱休克蛋白基因之區段。

較佳地，其中步驟(c)更包括進行一高解析熱熔解(High-Resolution Melting,HRM)分析。

較佳地，其中該核酸樣本係萃取自一個體之血液樣本；較佳地，該血液樣本係為經過血球血漿分離後之血球樣本。

較佳地，其中該即時定量聚合酶連鎖反應所使用之引子對係為SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4。

較佳地，其中步驟(C)更包括使用LC green染劑、SYBR green染劑或SYTO 9染劑。

經由本發明所採用的技術手段，以犬焦蟲與吉布松焦蟲之熱休克蛋白(heat shock protein)基因進行高解析熱熔解分析(high resolution melting)方式可成功地將兩種蟲體進行區分，並利用已知濃度陽性對照組之Ct值求得待測蟲體濃度(可達絕對定量)，提供一種快速的檢測方式(包含核酸萃取及 HRM上機時間，共約四小時)，大大提供了臨床獸醫師所需之治療黃金時間。在未來可利用本發明所揭露之技術內容及其優點，包括提升檢測精確度、降低偽陽性發生之優點，據以建立大小焦蟲的快速檢測系統，提供更有效率的檢測服務。

首先簡述本發明之具體實施步驟，本發明係提供一種區分犬焦蟲症分型的方法，其步驟包括：(a)提供一核酸樣本；(b)對該核酸樣本進行一定量即時聚合酶鏈鎖反應(Q real-time PCR)；以及(c)進行一熱熔解曲線(melting curve)分析以區分該核酸樣本之犬焦蟲症分型；其中該犬焦蟲症分型包括犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)，且該即時定量聚合酶連鎖反應所使用之引子對係針對該核酸樣本中編碼熱休克蛋白基因之區段。較佳地，步驟(c)更包括進行一高解析熱熔解(High-Resolution Melting,HRM)分析；該核酸樣本係萃取自一個體之血液樣本；該血液樣本係為經過血球血漿分離後之血球樣本；其中該即時定量聚合酶連鎖反應所使用之引子對係為SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4；其中步驟(C)更包括使用LC green染劑或SYBR green染劑。以上僅為簡述之實施步驟，其具體實施細節及實驗結果詳述如下。

實驗材料方法 檢體收集與核酸萃取

收集台灣各地動物醫院之臨床血液檢體共80個，以EDTA抗凝管低溫(4℃)保存運送至本公司進行檢體前處理(血漿血球分離)以利實驗進行，由於臨床檢體之變異性較大，可能見到貧血、溶血、脫水等狀況，故於核酸萃取前進行血漿血球分離，降低核酸萃取濃度上的差異，並提高檢體中所含之蟲體核酸濃度，避免偽陽性的發生。

血漿血球分離方法(前處理)及全自動核酸萃取：將血漿血球進行3000 rpm，15分鐘離心後取其下層血球200 μL於96孔盤之第一及第七排，並依序加入核酸萃取相關試劑於各反應排中(第一及七排加500 μL lysis buffer，第二及第八排加50 μL磁珠及750 μL washing buffer A，第三及第九排加750 μL washing buffer A，第四、五及第十、十一排加750 μL washing buffer B，第六及十二排加50 μL eluting buffer)，套入磁棒套，按下start鍵後開始進行血球核酸萃取。

以熱熔解曲線(melting curve)分析方法區分犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)

利用BC及Bg之熱休克蛋白(heat shock protein,hsp)之高度差異性序列特性設計引子對BCBghsp231F/R(如附件圖13)，編碼熱休克蛋白之DNA片段分別是SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2，以DNAstar軟體分析該序列於BC及Bg上之GC content分別為55.41%及48.48%，預期其BC之熱溶解曲線溫度值大於Bg。其PCR反應試劑量分別為2X Taq premix 10 μL、25 mM MgCl₂ 1.2 μL、DMSO 1 μL、2 uM BCBghsp231F/R 2μL、10 uM template 5μL、DDW 0.8 μL，以95℃,5分鐘之變性，95℃、58℃、72℃各30秒共35次循環，72℃，5分鐘之延長反應進行目標基因產物增幅反應，取PCR反應後之產物5 μL加入SYBR green 5 μL於384孔反應盤中，設定實驗模式為”standard curve”並包含PCR反應後之melt curve stage之反應條件為：95℃、15秒，60℃、1分鐘、95℃、15秒，以增溫速率每秒0.05℃偵測一次螢光值。

利用高解析熱熔解(High-Resolution Melting,HRM)分析儀(HR-1,Idaho Technology)進行犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)之區分

由於HR-1所需之螢光為LC green，可於PCR反應前或反應後外加，於成本考量上則以反應後經電泳確認有產物增幅後再外加LC green。另又因使用之2x Taq premix之PCR reagent為內含loading dye，為避免loading dye影響LC green嵌附於雙股DNA之效能，故另先行以其他不含loading dye 之Taq進行初篩，確認可行之Taq後再進行HRM。

1. Taq測試：共進行三種Taq測試：(1)Power Taq(2)Hot Start(3)pfu plus，分別配製成每管反應體積為20 μL之PCR premix：含有2.5mM MgCl₂、0.2mM dNTP、0.2u/μL Taq之PCR premix備用。測試之檢體(DNA模板)共6支，分別為1. pBC(BC陽性對照)、2. pBg(Bg陽性對照)、3.檢體編號79之BC、4. Bg臨床檢體(120419002)、5.陰性臨床檢體、6. DDW，以2 μL之引子對(2uM BCBghsp231F/R)及1 μL之DNA模板。PCR條件：以95℃,5分鐘之變性，95℃、58℃、72℃各30秒共35次循環，72℃，5分鐘之延長反應進行目標基因產物增幅反應。電泳條件：以內含0.4 mg/mL EtBr之2% agarose以250V之電流，15分鐘後於UV light下拍照並存檔。

2.以LC green進行HR-1分析：測試之BC、Bg檢體(DNA模板)各5支，分別為BC：1. pBC(BC陽性對照)、2.檢體編號79、3.檢體編號40、4.未編檢體AM111008006及5.檢體編號57；Bg：6. pBg(Bg陽性對照)、7.未編檢體AM120419002、8.檢體編號10、9.檢體編號23、10.檢體編號29，11.陰性檢體、12. DDW。引子對：2uM BCBghsp231F/R。PCR premix同上述以最終體積為20μL分別加入1 μL之DNA模板及2 μL引子對。PCR條件及跑膠條件同上述。HRM：將經電泳確認有產物增幅之檢體取9 μL加1 μL LC green以pipette充分混合後置於玻璃毛細管(Light Cycler,USA)並短暫離心，將待測產物置入分析儀中，所設條件為：升溫速度0.3℃/秒、始測螢光溫度60℃、終止溫度98℃。

3.確定可行後，再以上述之方法進行BC及Bg檢體(各16支，表4)之HR-1分析。

4.測試SYBR green於HR-1分析：所測試之檢體同2.，但其為2x之premix,故取10μL之2x SYBR green premix，加入1 μL之DNA模板、2 μL引子對及DDW 7μL，PCR、跑膠條件及HRM方法同上述。

利用ViiA ^TM 7之高解析熱熔解(High-Resolution Melting,HRM)實驗模式進行犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)之區分

以具有多個鹼基差異的BCBghsp231F/R引子對進行測試。BC之測試檢體為10μg/μL pBC+(BC陽性對照)、檢體編號47、59、63、64、66、67；Bg之測試檢體為10μg/μL pBg+(Bg陽性對照)、檢體編號56、54、53、51、50、49，其中pBC及pBg則另以1：1混合後加入測試。所使用之試劑為2x Melt Doctor^TM HRM reagent，配製成每管反應體積為10 μL之PCR premix：5 μL之2x Melt Doctor^TM HRM reagent(含SYTO 9染劑)、2 μL之2uM引子對、1μL之測試檢體、2 μL之DDW。於384孔反應盤中分別標記檢體位置並以光學反應膜服貼於其上後短暫離心(3000 rpm，1分鐘)，放入ViiA^TM7分析儀中進行檢體分析，設定實驗模式為”High Resolution Melting”並包含PCR反應，其反應條件為：Hold stage：95℃，10分鐘；PCR stage(40 cycles)：95℃、15秒，60℃、1分鐘；HRM stage：95℃、10秒，60℃、1分鐘，95℃、15秒(每秒0.025℃偵測一次螢光值)。

另外為進行蟲體濃度之定量，使用已知之pBC及pBg濃度(10 ug/uL)以1：1混合進行對半序列稀釋(seim-dilute)(附件圖31-1，將所得之ct值套入回歸公式進而得到未知檢體之濃度。

實驗結果 檢體收集與核酸萃取

收集台灣各地動物醫院臨床血液檢體，以EDTA抗凝管低溫(4℃)保存運送至本公司進行檢體前處理。由於臨床檢體呈現多樣性(貧血、溶血、脫水等)常造成檢體核酸萃取後之差異性提高以致影響檢測之準確度，於是利用焦蟲寄生於宿主紅血球內的特性，採用血漿血球分離方式提高蟲體核酸濃度以利實驗進行，如附件圖2。

目前已收集80個臨床檢體，所得之平均濃度為57.14 ng/μL，比值為1.78，此80個臨床檢體中可見其濃度值亦有所差異，推測為檢體本身原因，濃度頗高者可能為受感染檢體(白血球、噬中性球、單核球、淋巴球增加)、再生性貧血檢體(網織球增加)，濃度低者可能由於非再生性貧血、溶血檢體等。

在此所述的檢體收集係採用血球與血漿分離之方式，血液主要由紅血球和血漿組成，分別占血液的40%和55%。由於焦蟲會寄生在紅血球中，因此將檢體中的血球與血漿分離可以減去血漿中核酸的干擾，提升焦蟲核酸的濃度，降低因為焦蟲核酸的濃度太稀造成檢驗上的誤差。另外，核酸萃取係利用磁珠好吸附與安定的特性，在磁珠上修飾官能基團，利用官能基團與核酸的吸附作用達到從檢體中快速取得核酸與分離的效果。全程自動化的設計不僅節省時間成本、對於取得核酸的量與純度上也大有改善。

以熱熔解曲線(melting curve)方式快速區分犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)

本實驗利用大小焦蟲heat shock protein序列之高差異度特性設計該序列核試之引子對(BCBghsp231F/R)進行PCR，確認增幅出大小焦蟲之heat shock protein產物(如附件圖14)，再將其產物進行熱溶解曲線測試結果(如附件圖15)，其熱溶解曲線溫度值為BC>Bg(表2)。

利用高解析熱熔解(High-Resolution Melting,HRM)分析儀(HR-1,Idaho Technology)進行犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)區分之結果

1. Taq測試結果以Power Taq效果最佳(如附件圖16)。

2.測試之BC、Bg檢體以LC green進行HR-1分析前進行PCR之結果如附件圖17，將有增幅出產物之檢體進行HR-1之結果如附件圖18，可初步得知其BC之Tm值大於Bg。

3.經上述1.及2.之測試結果可行後，進一步以BC及Bg臨床檢體以LC green進行HR-1測試(如附件圖19、20)。

4.測試SYBR green於HR-1分析之結果(如附件圖21、22)。

利用ViiA ^TM 7之高解析熱熔解(High-Resolution Melting,HRM)實驗模式進行犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)進行分型及定量之結果

本實驗測試之BC及Bg檢體heat shock protein基因之Ct值與Tm值如表5，於heat shock protein測試之結果：擴增曲線圖(amplification plot)如附件圖25、26，Raw melt curve如附件圖27，導函數熔解曲線(derivative melt curve)結果如附件圖28，信號歸一化(aligned melt curves)結果如附件圖29及差異曲線圖(difference plot)如附件圖30。

定量結果如附件圖31-2及表5，各大小焦蟲陽性檢體ct值各為6.24、10.66、14.52、19.23、22.97、26.55、29.62，測試之大焦蟲陽性檢體(BC+)ct值為17.85，藉由對半稀釋之已知濃度(0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125 ug/uL)取得回歸曲線公式(y=5.6861n(x)+2.7759)，套入公式後得測試之大焦蟲陽性檢體濃度為0.0003191 ug/uL；分型結果如附件圖32，對照陽性檢體Tm值可確認測試檢體為大焦蟲。

討論

經由上述所揭露之具體實施方法及所得結果，可得到以下討論。上述實施例所採用之檢體核酸萃取方式，係採血漿血球分離方式，其可增加蟲體濃度、避免貧血、溶血或蟲體含量較低所造成的假陰性結果。

關於以heat shock protein進行BC及Bg區分之結果，由於習知鑑定方式所花費時間較長，另以BC及Bg之heat shock protein進行區分，利用兩種蟲體之heat shock protein具高度差異性之特性設計適合之引子對，進行產物增幅後加入SYBR green以ViiA7^TM中"melt curve"實驗模式進行分析，其結果可成功地將BC及Bg以Tm值區分開來，但其所呈現之熔解曲線圖較為粗糙(與實際以HRM測試結果有一定程度之落差)。相較於以heat shock protein直接以ViiA7^TM(Applied Biosystems,USA)中"standard curve"實驗模式進行BC及Bg檢體Tm值分析方式可行性高，所測試之LC green及SYBR green兩種螢光之結果應用於ViiA7^TM及需先將產物進行增幅之HR-1(Idaho Technology)兩儀器中顯示：LC green於HR-1測試結果較SYBR green佳(所得之熱熔解曲線較細緻)，亦可於PCR反應前或反應後外加螢光，可先行以電泳確認產物增幅後再行外加螢光，因而可省去耗材費用，而LC green則是已加入酵素之2x PCR premix，故較浪費酵素用量；以操作上而言，HR-1僅一次上一個檢體(玻璃毛細管)，且須操作人員在側，於檢體分析後再以人為操作方式進行下一檢體之分析，所花費之人力較大，而於ViiA7^TM操作上，其為384 well反應盤，雖不及玻璃毛細管來的佳，但高通量之優勢足以為勝，且該儀器亦有擴增曲線結果可得Ct值，進一步換算蟲體量(濃度)，亦於HRM分析軟體中涵括熔解曲線之Raw data、導函數圖、螢光信號歸一化及差異圖(difference plot)等強大之功能，且所使用之螢光(SYTO 9)為原廠附之含之HRM專用試劑(Melt Dr,HRM reagent)，為2x premix，過程中不需像HR-1要以電泳方式進行產物確認，直接上機即可得擴增曲線圖。

另外，關於以兩種螢光/核酸染劑(LC green及SYBR green)應用於HR-1儀器之結果而言：1.兩種螢光應用於BCBghsp引子對皆可成功增幅出目標產物，並需使用HR-1專用之玻璃毛細管進行檢體分析。2.兩者皆需經由電泳確認後才可進行HR-1分析：於LC green，其可於PCR反應後外加，較省試劑量，但LC green為單純螢光，需另外製備PCR premix；於SYBR green，其為2x premix，不需額外製備PCR premix，但其缺點則由於內已含SYBR green螢光，無法由電泳確認後再行添加，較為浪費。3.於HR-1分析之結果：1.其Tm值(熔解曲線溫度)於BC及Bg之差相似(LC green為2.3℃，SYBR green為2.34℃)。2.其Tm值於LC green之值大於SYBR green之值(LC green之BC為89.73℃，Bg為87.43℃；LC green之BC為87.56℃，Bg為85.22℃)，由其結果可推測SYBR green較無法偵測到異源雙股結構(heteroduplex)，而LC green不僅可偵測異源雙股結構，其所能觀察到的熔解曲線溫度變化比SYBR green更寬廣(更細緻)，Liew等人更指出LC green可用於快速偵測同源合子(homogeneous)中之異源雙股結構且不會抑制PCR產物之增幅，亦不需特殊探針或試劑，只需特定引子對、一次PCR與分析儀。以LC green於HRM之應用上強調其可偵測出單一鹼基之差異，此方式常應用於單一點突變、抗藥性基因偵測。

本實驗為分析BC及Bg本身之heat shock protein，利用其多點之鹼基差異，加入螢光並使其鑲嵌於雙股核酸上，再利用HRM原理進行螢光降解率的分析以求得目標基因之熔解曲線溫度，藉由BC及Bg之熔解曲線之溫度差異來求得區分之目的，且本實驗之最終目的並非偵測單一鹼基之差異，故於螢光物質之使用上並無太多限制。另外，為求達到定量目的，以HRM分析儀(HR-1,Idaho technology)僅能偵測螢光強度及Tm值，無法達到定量效果，而以ViiA7儀中之HRM實驗模式不但可得其Tm值，亦可以其PCR系統中求得Ct值並進一步換算未知蟲體之核酸濃度。

BC及Bg之定量：本實驗針對BC及Bg之18S rDNA所設計之探針並未能達區分目的，因而使用heat shock protein進行HRM測試，其結果可行，可於ViiA7儀中之HRM實驗模式成功地將BC及Bg區分開來，可見Raw melt curve、導函數熔解曲線(derivative melt curve)結果、信號歸一化(aligned melt curves)之結果，另外更可於擴增曲線圖(amplification plot)中得到待測檢體之Ct值，利用已知濃度之陽性對照組及其Ct值進行待測檢體之絕對定量換算。

綜上所述，以犬焦蟲與吉布松焦蟲之heat shock protein進行高解析熱熔解分析(high resolution melting)方式可成功地將兩種蟲體進行區分，並利用已知濃度陽性對照組之Ct值求得待測蟲體濃度(可達絕對定量)，此檢測方式約四小時(包含核酸萃取及HRM上機時間)，已屬相當快速之實驗方式，大大提供了臨床獸醫師所需之治療黃金時間。在未來可利用本發明所揭露之技術內容，其具有提升檢測精確度、降低偽陽性發生之優點，根據該些技術內容可建立區分犬大小焦蟲的快速檢測系統，提供更有效率的檢測服務。

由以上實施例可知，本發明所提供之利用基因檢測分析性格的方法確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。

參考文獻

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<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> none

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> primer BCBghsp231R；r=g or a；y=t/u or c；k=g or t/u

<400> 4

Claims

一種區分犬焦蟲症分型的方法，其步驟包括：(a)提供一核酸樣本；(b)對該核酸樣本進行一定量即時聚合酶鏈鎖反應(Q real-time PCR)；以及(c)進行一熱熔解曲線(melting curve)分析以區分該核酸樣本之犬焦蟲症分型；其中該犬焦蟲症分型包括犬焦蟲(Babesia canis,BC)及吉布松焦蟲(Babesia gibsoni,Bg)，且該即時定量聚合酶連鎖反應所使用之引子對係針對該核酸樣本中編碼熱休克蛋白基因之區段。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(c)更包括進行一高解析熱熔解(High-Resolution Melting,HRM)分析。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該核酸樣本係萃取自一個體之血液樣本。
如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該血液樣本係為經過血球血漿分離後之血球樣本。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該即時定量聚合酶連鎖反應所使用之引子對係為SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(C)更包括使用LC green染劑、SYBR green染劑或SYTO 9染劑。