CN108359722B - 一种用于监控微生物相的动态变化的整合系统及方法 - Google Patents

一种用于监控微生物相的动态变化的整合系统及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108359722B
CN108359722B CN201810078922.2A CN201810078922A CN108359722B CN 108359722 B CN108359722 B CN 108359722B CN 201810078922 A CN201810078922 A CN 201810078922A CN 108359722 B CN108359722 B CN 108359722B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
sample
analysis
high resolution
dissociation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810078922.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108359722A (zh
Inventor
周兰嗣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adix Gene Technology Co.,Ltd.
Original Assignee
Adix Gene Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adix Gene Technology Co ltd filed Critical Adix Gene Technology Co ltd
Publication of CN108359722A publication Critical patent/CN108359722A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108359722B publication Critical patent/CN108359722B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明涉及一种用于监控微生物相的动态变化的整合性系统和方法。本发明可以追踪复合性基质中微生物群的动态变化。

Description

一种用于监控微生物相的动态变化的整合系统及方法
技术领域
本发明涉及一种用于监控微生物相的动态变化的系统及方法。
背景技术
在医学、环境、或是工业上之的微生物相分析，尤其是工业的发酵过程中，特别是对于使用“固态”基质进行发酵的工业，相关微生物相随时间变化(或成熟期间)的改变通常是复杂的，并且难以监控特殊发酵产物的产出。关于该议题很少有文献发表。
最近的一些文献聚焦于在酵母发酵过程中添加已知混合性菌株的微生物相；有些文献则专注在对不同土壤生态系统的细菌群落组成进行单一测量时间点的研究。这些研究多是利用二代测序方式来得知微生物相的组成，不但一次只能检测单一时间点的结果，每一次的二代测序就必须耗费1至3天不等的时间。因此，需要一个如本发明中明确、快速及全面性的整合系统及方法来监控微生物相随时间改变的变化。
发明内容
本说明书所使用的用词“一”被用来描述本发明的组件和组成。这仅仅是为了方便并给予本发明的一般意义。该描述应该被理解为包括一个或者至少一个，且本说明书所使用的单数也包括复数，除非其是明显具有另外的意思。
本说明书所使用的“或”是用于描述“和/或”。
本说明书所述的”总核酸”或”核酸”与一般生物学用字并无不同，是指脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。
本发明便是提供一种结合二代测序(NGS)技术和高分辨率核酸解离分析(HRM)的系统和方法，可应用在所有可能需监控微生物相变化的产业中，例如应用于那些需要监控发酵过程中的微生物相的变化及其群体数量的产业。
除一样本的二代测序(NGS)分析之外，本发明也主张将自一样本中于不同时间点采集的每一样品，使用具有适当的遗传标记或聚合酶链锁反应(PCR)产物(例如16s rDNA基因，或其它菌株特异性基因)的高分辨率核酸解离分析(HRM)技术作为主要筛选工具，用以定期监控随时间的改变的微生物相的变化及其群体数量。
高分辨率解离分析(HRM)为一通过分析高分辨率的解离曲线而得到检测之核酸片段中微小序列之差异的技术。此技术广泛用于基因表现、基因突变、基因修饰等研究，或应用于医学之疾病诊断等研究上(https://en.wikipedia.org/wiki/High_Resolution_Melt)。
本发明提供一个整合性系统，包括以下组成：
(a)一测序装置，用于测序一样本中的微生物相，以分析该微生物相的组成及特性；
(b)一高分辨率核酸解离分析仪器，用于分析自该样本中采集至少二个具有微生物相的样品，其中每一样品是于不同之时间点自该样本中所采集者，并建立一微生物相解离图形，以监控该样本中微生物相的动态变化；及
(c)一数据库，连接至该测序装置及该高分辨率核酸解离分析仪器，用于纪录该微生物相的组成、特性及解离图形的分析数据。
较佳的，该测序装置是指二代测序(NGS)装置。
较佳的本发明更进一步具有一优化方法如下：
(a)优化的样品(DNA)提取方法：使用商业化试剂；
(b)设计专有的16s rDNA引物；
(c)设计专有的聚合酶链锁反应条件和解离程序；及
(d)专有且客制化的数据库和软件用于图形的比较(图谱比较)。
本发明中所使用的引物包括：
引物编号 序列 碱基
Figure BDA0001560418230000021
其中引物对编号1、3、4是16s rDNA的V3区域的引物对，引物对编号2是16s rDNA的V6区域的引物对。
利用上述引物进行聚合酶链锁反应时，本发明包含一聚合酶链锁反应产物不超过300个碱基对的特色，其可提升高分辨率核酸解离分析的分辨率。
较佳的，本发明的高分辨率核酸解离分析仪器包含一聚合酶链锁反应仪，针对每一样品执行非对称性聚合酶链锁反应，用以扩增该每一样品的小片段核酸，以提高该些小核酸片段在高分辨率核酸解离分析时的准确度。
较佳的，本发明的高分辨率核酸解离分析仪器可进一步自该数据库提取数据，用以确认该微生物相的组成、特性及解离图形的分析数据。
较佳的，本发明的高分辨率核酸解离分析仪器可进一步自该数据库反复提取已完成分析的数据，于更后续之监控时，无须重复该微生物相的成分及特性的分类学分析，亦无须重复先前时间点的解离分析。
本发明的系统可用于追踪复合性基质中已知或未知微生物相的动态变化的整合性系统作为一个质量管理标准。该系统不仅可以追踪真细菌的组成物，还可以追踪真核生物的组成物。通过结合额外的化学特性分析和特定的感官品评小组分析，可以生产出稳定的高质量发酵产品。
本发明亦提供一种新颖的方法，藉由本发明的整合性系统，结合二代测序(NGS)技术和高分辨率核酸解离分析(HRM)图形，以定量和定性的方式监控随时间改变的微生物相的变化。另外，本发明观察到，一旦建立初始的二代测序(NGS)图形，本发明可以简单地仅使用高分辨率核酸解离分析(HRM)技术建立整体的解离图形，并且追踪微生物相在一段时间内的变化。
本发明用于监控微生物相的动态变化的方法，其简单流程如图1所示。
本发明用于追踪微生物相动态变化的方法，包括：
(a)自一样本中采集至少二个具有微生物相的样品，其中每一样品是于不同的时间点自该样本中所采集者；
(b)提取该每一样品的总核酸；
(c)扩增该每一样品的总核酸，各自得一扩增后的小片段核酸；
(d)分析每一样品的该扩增后的小片段核酸，其中该分析方法包含一高分辨率核酸解离分析；及
(e)于高分辨率核酸解离分析后，基于每一样品的分析结果，建立一高分辨率核酸解离分析图形以监控该样本中微生物相的动态变化。
较佳的，该扩增该每一样品的总核酸的步骤是通过非对称性聚合酶链锁反应进行扩增，以提升高分辨率核酸解离分析曲线的准确度。
另一方面，该扩增后的小片段核酸可进一步通过测序步骤进行一样本的微生物相的分类学的定性分析，该定性分析可与高分辨率核酸解离分析同时进行，且一旦完成分析之后，该分析结果会存盘于一数据库中，可随时读取分析结果，不用于每次分析前都进行一次定性分析。
较佳的，该测序步骤是指二代测序(NGS)。
较佳的，本发明的方法仅需于分析前，针对一样本做一次该扩增的小片段核酸的分析，取得初始微生物相的组成分类学分析结果即可。
与单纯二代测序(NGS)相比，本发明具有以下优点：
快速(小于4小时)且具成本效益；当没必要时，不需要去辨识每一个微生物菌株个体，相反地，本发明辨识一属于特定的群体(混合的微生物)的独特的高分辨率核酸解离分析(HRM)图形，以快速连接特定的“表现型”并具有人性化的数据分析。
本发明可用于分析来自复合性基质的微生物相，例如食物材料、土壤样品、临床标本或沼气。因此，本发明可以应用于食品产业、农业产业、医疗产业或能源产业。
本发明也可应用于口腔微生物相、皮肤微生物相或与肠道微生物相之分析。
附图说明
图1为本发明用于监控微生物相的动态变化的方法的简单流程。
图2显示使用NanoDrop 2000分光亮度计量测所提取的总DNA的浓度和品质；样品b1＝wl_small volume(0.2克的白色谷物在低温发酵)，样品b2＝wl_large volume(2克的白色谷物在低温发酵)，样品b3＝rl_small volume(0.2克的红色谷物在低温发酵)，样品b4＝rl_large volume(2克的红色谷物在低温发酵)。
图3显示使用V3引物的扩增结果。
图4显示样品间(不同“属”)不同微生物的多样性；在“属”级，样品b1-b4显示不同的多样性。七个相对较大的群体(黑色箭头所指的区域)是：1：未分类的，2：假单胞杆菌属，3：不动杆菌属，4：未分类的，5：肠杆菌属，6：魏斯氏菌属，7：乳酸杆菌属。
图5显示所提取出来的小片段核酸的高分辨率核酸解离分析(HRM)结果，代表复合性基质的微生物相。图A描述了样品b1和b2的高分辨率核酸解离分析图形(normalizedmelting peaks)；图B描述了样品b3和b4的高分辨率核酸解离分析图形(normalizedmelting peaks)。
图6显示微生物相(微生物群系，总体基因体，或微生物相)在白色谷物的低温发酵过程中随时间变化(12/7～12/11，共5天)的监控结果(normalized melting peaks)。
图7显示微生物相(微生物群系，总体基因体，或微生物相)在白色谷物的中等温度发酵过程中随时间变化(12/8～12/15，共8天)的监控结果(normalized melting peaks)。
图8显示微生物相(微生物群系，总体基因体，或微生物相)在红色谷物的低温发酵过程中随时间变化(2/17～2/22，共6天)的监控结果(normalized melting peaks)。
图9显示微生物相(微生物群系，总体基因体，或微生物相)在红色谷物的中等温度发酵过程中随时间变化(2/24～3/2，共7天)的监控结果(normalized melting peaks)。
图10显示取自污水及污泥样本的微生物相在沼气中随时间变化(不同发酵池)的监控结果(normalized melting peaks)。
图11显示以16s rDNA V6引子对进行对称性聚合酶链锁反应与不对称性聚合酶链锁反应分析取自污水及污泥样本的微生物相在沼气中随时间变化(不同发酵池)的监控结果(normalized melting peaks)。
图12显示本发明之追踪精确发酵过程中不同微生物相的动态变化的整合性系统的示意图；
图式说明：
1用于追踪不同微生物相之动态变化的整合性系统
10一测序装置
11一数据库
12一高分辨率核酸解离分析仪器。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
用于实施本发明的样本可来自口腔、肠道、皮肤、土壤、污水、或发酵过程等任一微生物相样本。
本发明所使用之样品是自一样本中，于不同时间点采集而得者。该不同时间点依照实验需求或样本微生物相的不同而有所变动。
实施例1
本实施例是使用该精确发酵(Precision Fermentation；PF)系统监控“纯谷物固态发酵”过程中细菌群落随时间的变化。最理想的是使用该精确发酵系统来预测在高质量酒精饮料生产中最佳微生物相的组成。
组成一：样品准备步骤-决定最佳的样品取样量
材料：1041207BWL(在低温下发酵的白色谷物)和1050222BRL(在低温下发酵的红色谷物)。
从该两种样品中，使用两种不同的取样量(0.2克和2克)，透过均质化及标准化过程，以mericon试剂来提取总核酸，判定最佳的取样量。
图2显示两种不同取样量所提取后的DNA皆可得到相似的DNA浓度和质量。
在初步的分光亮度计分析后，于二代测序(NGS)分析前，先以所设计的引物(SEQID NO.1、SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)来扩增提取出的总核酸中的混合状16S rDNA的V3区域。扩增结果如图3所示。
基于图2和图3的结果，两个取样量(0.2克和2克)皆适用于PF系统。
组成二：以本发明之用于追踪不同微生物相的动态变化的整合性系统1的测序装置10进行初始微生物相分析
本实施例所采用测序装置为二代测序(NGS)装置。
初始二代测序(NGS)分析结果总结于表1。使用Geengene数据库并依据辨识出的操作分类单元(OTU)序列，将所有样品分配到其所属的物种阶层(界、门、纲、目、科、属、种)。
表1.使用97％阈值进行二代测序(NGS)分析的数据结果。
样品编号 界 门 纲 目 科 属 种
b1 数量 80,453 80,452 80,452 80,433 80,053 73,276 47,966
比例(％) 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％ 99.50％ 91.10％ 59.60％
b2 数量 86,373 86,368 86,365 86,339 86,007 75,318 50,375
比例(％) 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％ 99.60％ 87.20％ 58.30％
b3 数量 84,484 84,476 84,472 84,456 83,347 75,324 55,232
比例(％) 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％ 98.70％ 89.20％ 65.40％
b4 数量 85,173 85,169 85,167 85,146 84,279 79,119 56,301
比例(％) 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％ 99.00％ 92.90％ 66.10％
图4为二代测序(NGS)结果，该结果说明了样品间不同的微生物多样性(不同“属”)。基本上，样品b1和b2应拥有相似的一般多样性分布以证实样品来源，虽取样量不同(分别为0.2克和2克)，但b1和b2皆来自样品(1041207BWL)。
基于该二代测序(NGS)的结果，当使用提取出的总核酸作为模板来扩增部分16srDNA序列(参见组成三)来进行高分辨率核酸解离分析(HRM)时，我们也预测一种类似或相同的解离图形。虽取样数量不同(OTU序列的数量)，但样品b3和b4亦显示出相似的一般多样性分布。
尽管该结果证实了b3和b4在组成一的分析中显示其来自相同的样品(1050222BRL)，但是当使用扩增的小片段核酸来进行高分辨率核酸解离分析(HRM)时，应该存在不同的解离图形(参见组成三)。
组成三：以高分辨率核酸解离分析仪器12确认二代测序(NGS)的结果并建立一微生物相解离图谱
图4的二代测序(NGS)数据显示，样品b1和b2在微生物相中具有相似的多样性分布，在每个“属”中亦具有些微不同的OTU序列数量。样品b3和b4在微生物相中虽也显示出相似的多样性分布，但在某些“属”中则具有不同量的OTUs。例如：乳酸菌群(如粉红色条所示)在样品b3和b4之间的群体数量上是不同的。
在设计专有的PCR的条件之下，使用V3引物进行高解析解离后，其结果如图5所示。图5A是样品b1和b2(在低温下发酵的白色谷物)的高分辨率核酸解离分析(HRM)图形，该图形显示出在b1和b2间，有非常相似的解离图形，该图形结果也再次证实先前的二代测序(NGS)的结果。
此外，图5B显示，在70℃至87℃的高分辨率核酸解离分析(HRM)温度谱图之下，样品b3和b4(在低温下发酵的红色谷物)存在于一相似的高分辨率核酸解离分析(HRM)解离图形，但在87℃至90℃的高分辨率核酸解离分析(HRM)温度图谱之下则有变化(图5A和B)。该结果也再次证实先前的二代测序(NGS)的结果(样品b3和b4之间存在不同的OTU序列)。
比较高分辨率核酸解离分析(HRM)的图形与二代测序(NGS)的结果，我们可发现哪种发酵条件与二代测序(NGS)的结果相符合，从而获得更好的发酵条件。由于该“分布”结果与二代测序(NGS)的数据及高分辨率核酸解离分析(HRM)的图形相符合，因此，在定性和定量两种方式的考虑上，我们主张使用高分辨率核酸解离分析(HRM)作为常规筛选工具，取代使用上费时又费力的二代测序(NGS)技术，用以监控微生物相的变化。
本发明之整合性系统另包含一数据库11，可搜集该二代测序的结果，以利后续高分辨率核酸解离分析的重复再分析或比对，不用再额外增加执行二代测序的时间及金钱成本。
总之，通过本发明的整合性系统1，结合优化的样品制备步骤、初始的二代测序(NGS)分析及设计专属的高解析解离等方法，本发明不仅可以从复合性基质中辨识“特定的”微生物相，而且还可以监控其随时间改变的组成物变化(培养期间)。
实施例2
本实施例揭示如何在酿造产业中应用本发明所主张的精确发酵系统来追踪及监控“固态发酵”期间的微生物相变化的方法。本发明所主张的精确发酵系统除了可应用于酿造产业之外，亦可以应用于其他发酵产业，特别适用于“固态发酵”。
以下的数据是以使用不同温度处理的不同类型固态发酵基质所完成的。
本实施例的步骤包括自一样本中采集至少二个具有微生物相之样品，其中每一样品是于不同的时间点自该样本中所采集者；其次，提取该每一样品的总核酸当作模板，扩增该每一样品的总核酸，各自得一扩增后的小片段核酸；再以一高分辨率核酸解离分析来分析每一样品的该扩增后的小片段核酸；于高分辨率核酸解离分析后，基于每一样品的分析结果，建立一高分辨率核酸解离分析图形以监控微生物相的动态变化。
本实施例的材料及温度条件包括：白色谷物，红色谷物，低温和中等温度(图6至图9)。
参考图6，样品“wl”代表低温下的白色谷物。该白色谷物系生产(成熟)于2015年12月7日至2015年12月11日之间的不同批次(即不同日期)。从来自不同日期(2015年12月7日至2015年12月11日)的“wl”样品之间，我们可以观察到不同的高分辨率核酸解离分析(HRM)图形。所有样品均做双重复分析。
参考图7，样品“wm”代表中等温度的白色谷物。该白色谷物系生产(成熟)于2015年12月8日至2015年12月15日之间的不同批次(即不同日期)。从来自不同日期(2015年12月8日至2015年12月15日)的“wm”样品之间，我们可以观察到不同的高分辨率核酸解离分析(HRM)图形。所有样品均做双重复分析。
参考图8，样品“rl”代表低温的红色谷物。该红色谷物系生产(成熟)于2016年2月17日至2016年2月22日之间的不同批次(即不同日期)。从来自不同日期(2016年2月17日至2016年2月22日)的“rl”样品之间，我们可以观察到不同的高分辨率核酸解离分析(HRM)图形。所有样品均做双重复分析。
参考图9，样品“rm”代表中等温度的红色谷物。该红色谷物系生产(成熟)于2016年2月24日至2016年3月02日的不同批次(即不同日期)。从来自不同日期(2016年2月24日至2016年3月02日)的“rm”样品之间，我们可以观察到不同的高分辨率核酸解离分析(HRM)图形。所有样品均做双重复分析。
根据该监控随时间而改变的微生物相的精确发酵系统，操作人员可以比较不同时间点的高分辨率核酸解离分析(HRM)图形(图6至图9)的发酵产品，并决定哪种微生物相是最适合操作人员操作的产品。
实施例3
于本实施例中，沼气的监控指示了产生电力的最佳图形。通过监控混合的(复杂的)微生物群体“随着时间的”变化，可以用于预测适合发电的最佳甲烷产量的最佳组成(或所谓的高分辨率核酸解离分析(HRM)图形)。
本实施例使用三个样品来进行所主张保护的发明：未处理的污水(原污水)，调理池中的未处理污水和浓缩的污泥。图10显示微生物相(高分辨率核酸解离分析(HRM)图形)。
借着比较这三个图形，本发明可以指出产生较好效率的最佳微生物相。
本实施例亦以16s rDNA之V6区域之引物对(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)进行对称性及非对称性聚合酶链锁反应之比较，通过比较对称性及非对称性聚合酶链锁反应扩增结果是否对于高分辨率核酸解离分析的图形有所影响，其结果参见图11。其说明影响高分辨率核酸解离分析结果的因子包括了扩增的小片段核酸长度及引物浓度。本实施例采用非对称性引物浓度并扩增16s rDNA V6小片段核酸产物。通过非对称性聚合酶链锁反应及较短的扩增片段来降低偏差值及增加解离分析的分辨率。
于一更佳实施方式，以16s rDNA V6引物对(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)进行非对称性聚合酶链锁反应后所产生的波峰多于对称性聚合酶链锁反应，其更易于监测微生物相随时间动态变化之数据分析及判读。
实施例4
本实施例说明操作者操作本发明之用于追踪不同微生物相的动态变化的整合性系统1的操作方式。
操作者将自一样本中，于不同时间点采集至少二个具有微生物相的样品进行均质化与标准化处理之后，进行样品的总核酸的提取，再以该提取的总核酸当作模板，以专属的引物对(如16s rDNA V3或16s rDNA V6引物对)进行小片段核酸之扩增，为使后续分析结果优化，该扩增的小片段核酸大小不超过300个碱基对。于不同时间采集自同一样本的每一个样品皆经过前述步骤之处理。
其次，操作者可利用本发明的测序装置10进行最初始的样品小片段核酸的测序，并分析测序结果，得到该样品的微生物相组成并加以分类，其分析结果将存盘于一数据库11中；同时，每一个不同时间点采集的样品的小片段核酸也利用本发明的高分辨率核酸解离分析仪器12进行解离分析，基于每一样品的解离分析结果建立一个解离分析图形，用以监控微生物相的动态变化。
操作者可将测序结果及解离分析图形进行比较，得到一具定性及定量的微生物相动态变化的分析结果，该结果都可存盘于数据库11中，若后续仍继续采样，则可自数据库11中获得先前的分析结果进行比较，不需再重复一次已经完成的分析。
序列表
<110> 周兰嗣
<120> 一种用于监控微生物相的动态变化的整合系统及方法
<150> 62/450,591
<151> 2018-01-26
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagactcct acgggaggca g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcagccgc ggtaatacg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actcctacgg gaggcagca 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtattaccgc ggctgctggc a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccanactcct acgggaggca g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagcagccgc ggtaatacg 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaractcct acgggaggca g 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagcagccgc ggtaatacg 19

Claims (4)

1.一种快速追踪微生物相的动态变化的方法，包括：
(a)自一样本中采集至少二个具有微生物相的样品，其中每一样品是于不同的时间点自该样本中所采集者；
(b)提取该每一样品的总核酸；
(c)通过一非对称性聚合酶链式反应进行扩增该每一样品的总核酸，以各自得一扩增后的小片段核酸；
(d)分析每一样品的该扩增后的小片段核酸，其中该分析方法包含一高分辨率核酸解离分析，及；
(e)于各不同时间点的高分辨率核酸解离分析后，基于每一不同时间点的样品的分析结果，建立一高分辨率核酸解离分析图形以监控该样本中微生物相的动态变化，
其中，所述扩增后的小片段核酸通过二代测序步骤进行一样本的微生物相的分类学的定性分析，且一旦建立初始的二代测序定性分析图形，可以简单地仅使用高分辨率核酸解离分析技术建立整体的解离图形，并且追踪微生物相在一段时间内的变化，不用于每次分析前都进行一次定性分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该扩增后的小片段核酸是指长度不大于300个碱基对的混合状16S rDNA的V3或V6区域的片段。
3.一种执行权利要求1所述的方法用于追踪微生物相的动态变化的整合性系统，包括：
一二代测序NGS装置，用于测序一样本中的微生物相，以分析该样本中的微生物相的组成及特性；
一聚合酶链锁反应仪，其针对自该样本中采集至少二个具有微生物相的样品执行非对称性聚合酶链锁反应，用以扩增该每一样品的小片段核酸，其中每一样品是于不同的时间点自该样本中所采集者；
一高分辨率核酸解离分析仪器，用于分析扩增后的每一样品的小片段核酸，并建立一微生物相解离图形，用以监控该样本中微生物相的动态变化；及
一数据库，连接至该定序测序装置及该高分辨率核酸解离分析仪器，用于纪录该微生物相的组成、特性及解离图形的分析数据。
4.根据权利要求3所述的系统，其中该高分辨率核酸解离分析仪器进一步自该数据库提取数据，用以确认该微生物相的组成、特性及解离图形的分析数据。
CN201810078922.2A 2017-01-26 2018-01-26 一种用于监控微生物相的动态变化的整合系统及方法 Active CN108359722B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762450591P 2017-01-26 2017-01-26
US62/450,591 2017-01-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108359722A CN108359722A (zh) 2018-08-03
CN108359722B true CN108359722B (zh) 2022-04-08

Family

ID=63007081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810078922.2A Active CN108359722B (zh) 2017-01-26 2018-01-26 一种用于监控微生物相的动态变化的整合系统及方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN108359722B (zh)
TW (1) TWI743300B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242206A (zh) * 2011-06-29 2011-11-16 中国食品发酵工业研究院 一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法
CN102876803A (zh) * 2012-10-22 2013-01-16 广东省工程技术研究所 污水生物处理系统诊断和修复的方法
TW201428108A (zh) * 2013-01-03 2014-07-16 Genomics Bioscience & Technology Co Ltd 區分犬焦蟲症分型的方法
CN103937874A (zh) * 2013-12-19 2014-07-23 广西大学 六堡茶加工过程中真菌菌群的检测方法
CN104561245A (zh) * 2013-10-16 2015-04-29 复旦大学 结核分枝杆菌复合群快速鉴定方法及试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10253377B2 (en) * 2013-04-05 2019-04-09 Wayne State University Systems and methods to assess microbiomes and treatments thereof
CN105803058A (zh) * 2016-01-25 2016-07-27 南昌大学 利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242206A (zh) * 2011-06-29 2011-11-16 中国食品发酵工业研究院 一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法
CN102876803A (zh) * 2012-10-22 2013-01-16 广东省工程技术研究所 污水生物处理系统诊断和修复的方法
TW201428108A (zh) * 2013-01-03 2014-07-16 Genomics Bioscience & Technology Co Ltd 區分犬焦蟲症分型的方法
CN104561245A (zh) * 2013-10-16 2015-04-29 复旦大学 结核分枝杆菌复合群快速鉴定方法及试剂盒
CN103937874A (zh) * 2013-12-19 2014-07-23 广西大学 六堡茶加工过程中真菌菌群的检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"5′-MGB Probes Allow Rapid Identification of Methanogens and Sulfate Reducers in Cold Marine Sediments by Real-Time PCR and Melting Curve Analysis";Irina Afonina等;《OLIGONUCLEOTIDES》;20091231;第19卷(第3期);第293-297页 *
"Identifying common genetic variants by high-resolution melting";Joshua G. Vandersteen等;《Clinical Chemistry》;20071231;第53卷(第7期);第1191-1198页 *
"高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用";朱岩芳等;《种子》;20131031;第32卷(第10期);第57-60页 *

Also Published As

Publication number Publication date
TWI743300B (zh) 2021-10-21
TW201827605A (zh) 2018-08-01
CN108359722A (zh) 2018-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Blackwood et al. Terminal restriction fragment length polymorphism data analysis for quantitative comparison of microbial communities
Fromin et al. Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis (DGE) fingerprinting patterns
Kirk et al. Methods of studying soil microbial diversity
Prosser Molecular and functional diversity in soil micro-organisms
González-Jaén et al. Genetic markers for the analysis of variability and for production of specific diagnostic sequences in fumonisin-producing strains of Fusarium verticillioides
Bougoure et al. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root‐associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots
Vasileuskaya-Schulz et al. Delineation of Stenotrophomonas spp. by multi-locus sequence analysis and MALDI-TOF mass spectrometry
Suzuki et al. Bacterial flora analysis of coliforms in sewage, river water, and ground water using MALDI-TOF mass spectrometry
Chauhan et al. Rapid identification of dairy mesophilic and thermophilic sporeforming bacteria using DNA high resolution melt analysis of variable 16S rDNA regions
Mayali et al. Dynamics of marine bacterial and phytoplankton populations using multiplex liquid bead array technology
CN104560982B (zh) 不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子
CN115960902B (zh) 基于CRISPR-Cas系统的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用
CN108359722B (zh) 一种用于监控微生物相的动态变化的整合系统及方法
CN112899382B (zh) 一种鉴定拟无枝酸菌的检测方法
CN102080127B (zh) 一种检测15种临床常见病原微生物的基因芯片
CN113930543A (zh) 检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光pcr试剂盒
CN102827930B (zh) 建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品
Call et al. Using DNA suspension arrays to identify library-independent markers for bacterial source tracking
Naknim et al. Identifying the origin of forensic soil evidence using amplified ribosomal DNA restriction analysis of its bacterial community
Navarro-Barranco et al. Phenotypic and molecular analysis of Mexican Metarhizium anisopliae strains
CN114107526B (zh) 一种检测西瓜嗜酸菌的RPA引物对和crRNA及其试剂盒和使用方法
CN109355412A (zh) 一种用于测定细菌与真菌种类和丰度比较的人工合成外源性参照分子
Burtscher et al. Development of a novel amplified fragment length polymorphism (AFLP) typing method for enterococci isolates from cattle faeces and evaluation of the single versus pooled faecal sampling approach
KR20130125586A (ko) Ｖｎｔｒ에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 ｖｎｔｒ에 의한 검체의 형질 분류 방법
CN104032000A (zh) 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220321

Address after: 10 / F, 221, section 4, Zhongxiao East Road, Da'an District, Taipei, Taiwan, China

Applicant after: Adix Gene Technology Co.,Ltd.

Address before: Six, building 206, Siwei Road, 106 Da An District, Taipei, Taiwan, China

Applicant before: Zhou Lansi

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant