CN105803058A

CN105803058A - 利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法

Info

Publication number: CN105803058A
Application number: CN201610047905.3A
Authority: CN
Inventors: 徐锋; 杨栋; 魏华; 武晓丽; 蔚晓敏; 吴姚平
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2016-01-25
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2016-07-27

Abstract

本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法，所述方法包括以下步骤：目标菌DNA提取；通过设计引物使目标菌DNA的PCR扩增；对目标菌DNA的PCR产物进行DGGE分析；在PCR产物中加入DNA变性剂，进行HRM分析：DNA变性剂为尿素、甲酰胺和盐酸胍，其中，尿素和甲酰胺均能使Tm值降低，盐酸胍则使Tm值升高，使目标菌的PCR产物Tm值差异变大，峰型得以区分开；将分析结果与变性梯度凝胶电泳分析结果相对比，初步建立高分辨熔解曲线用于菌群种类分析的方法。本发明使用不同的DNA变性剂，使得不同DNA片段的Tm值差异变大，更便于区分，初步建立HRM用于菌群种类分析的新方法。

Description

利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法

技术领域

本发明涉及高分辨熔解曲线的应用，具体地指一种利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法。

背景技术

DNA的熔解，是指在加热状态下DNA双链解成单链的过程。通过对DNA熔解过程的监测，可以绘制出熔解曲线。高分辨熔解曲线(以下简称为HRM)采用DNA荧光染料(SYBRGreenI，LCGreen等)来记录DNA的解链情况，DNA片段单个碱基的差异都会在熔解温度(以下简称为Tm)及熔解曲线形状上表现出来。高分辨熔解曲线的特性取决于DNA的长度、GC含量以及碱基排列等，然而在HRM应用菌种鉴定过程中，由于同一或者不同种属的细菌Tm值往往很接近，导致其熔解曲线重叠，不能很好地区分。

目前，HRM能够对单个碱基的变化进行区分，因其简单、准确、快速、高通量、低成本、对样品无污染等优点，已广泛应用于突变扫描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等诸多领域，已成为生命科学研究中的热点技术。但尚未出现其用于菌群群落分析的报道。

发明内容

本发明的目的就是要克服现有技术所存在的不足，提供一种利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法。

为实现上述目的，本发明所设计的利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法，包括以下步骤：

1)目标菌DNA提取；

2)通过设计引物使目标菌DNA的PCR扩增；

3)对目标菌DNA的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分析；

4)在PCR产物中加入DNA变性剂，进行高分辨溶解曲线分析：所述DNA变性剂为尿素、甲酰胺和盐酸胍，其中，尿素和甲酰胺均能使Tm值降低，盐酸胍则使Tm值升高，使目标菌的PCR产物Tm值差异变大，峰型得以区分开；

5)将步骤4)的分析结果与变性梯度凝胶电泳分析结果相对比，初步建立高分辨熔解曲线用于菌群种类分析的方法。

本发明步骤4)中，尿酸作用浓度为0％～40％m/v，甲酰胺作用浓度0％～40％v/v，盐酸胍作用浓度为0.2～1.0mol/L。

本发明分析方法的具体步骤如下：

第一步：3号双歧杆菌菌落PCR：将3号双歧杆菌用LB平板培养过夜，挑取个单菌落，V3区引物PCR扩增序列如下表所示。

反应体系为：2×Taqmix：50μL，上下游引物10μM各4μL，超纯水42μL；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30个扩增循环，72℃延伸10min。

第二步：取5μL的3号双歧杆菌PCR产物，加入等体积不同浓度的尿素溶液(m/v)，使其终浓度为0，10％，20％，30％，40％；再加入稀释比为1:5000的SYBRGreenI，进行高分辨熔解曲线检测。

取5μL的3号双歧杆菌PCR产物，加入等体积不同浓度的甲酰胺溶液(v/v)，使其终浓度为0，10％，20％，30％，40％；再加入稀释比为1:5000的SYBRGreenI，进行高分辨熔解曲线检测。

取5μL的3号双歧杆菌PCR产物，加入等体积不同浓度的盐酸胍溶液，使其终浓度为0.2M，0.4M，0.6M，0.8M，1.0M；再加入稀释比为1:5000的SYBRGreenI，进行高分辨熔解曲线检测。

第三步：小鼠粪便DNA提取。

第四步：对小鼠粪便中的乳杆菌进行PCR扩增：

反应体系为：2×Taqmix：20μL；乳杆菌引物的PCR扩增序列如下表所示，上下游引物(10μM)各2μL，模板2μL，ddH2O加置40μL。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环，最后72℃延伸10min。

乳杆菌和V3区引物PCR扩增序列

第五步：对小鼠粪便中总乳杆菌PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分析。

第六步：在PCR产物中加入DNA变性剂，进行高分辨溶解曲线分析：取10μL的PCR产物，混入40％浓度的甲酰胺(v/v)，40％浓度的尿素(w/v)，0.4M盐酸胍(v/v)，再加入稀释比为1:5000的SYBRGreenI，进行高分辨熔解曲线检测。另取10μL的PCR产物加入等体积的PBS，作为空白对照。

第七步：本发明对粪便的总乳杆菌进行扩增，利用HRM和DGGE对比分析其菌群结构，初步建立高分辨熔解曲线用于菌群种类分析的方法。

本发明基于HRM能够识别单个碱基差异的原理，通过设计引物扩增肠道微生物16SrRNA序列，在高分辨熔解曲线上对它们进行区分。然而，按照常规方法，直接将PCR产物通过荧光定量PCR仪测定其熔解曲线，由于扩增的DNA片段碱基差别不大，导致峰型重叠，不能将Tm值分开。故，本发明采用加入不同的DNA变性剂，使不同DNA片段Tm值差异变大，其中尿素和甲酰胺均能使Tm值降低，盐酸胍则使Tm值升高；最终，使目标菌的PCR产物Tm值差异变大，峰型得以区分开，从而达到菌群分析的目的。本发明初步建立了HRM用于菌群种类分析的新方法。

附图说明

图1为尿素浓度对Tm值的影响曲线图。

图2为甲酰胺浓度对Tm值的影响曲线图。

图3为盐酸胍浓度对Tm值的影响曲线图。

图4为大肠杆菌的高分辨熔解曲线。

图5为添加DNA变性剂后大肠杆菌的高分辨熔解曲线。

图6为植物乳杆菌的高分辨熔解曲线。

图7为添加DNA变性剂后植物乳杆菌的高分辨熔解曲线。

图8为粪肠球菌的高分辨熔解曲线。

图9为添加DNA变性剂后粪肠球菌的高分辨熔解曲线。

图10为大肠杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌3种菌混合的高分辨熔解曲线。

图11为添加DNA变性剂后大肠杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌3种菌混合的高分辨熔解曲线。

图12A为未加入DNA变性剂的高分辨熔解曲线。

图12B为加入了DNA变性剂的高分辨熔解曲线。

图12C为DGGE结果的图谱。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明构成限定。

本发明在实施例中选取了常见的3号双歧杆菌作为实验模型，使用通用引物扩增其V3区序列，分析了不同DNA变性剂对其Tm值的影响。在此基础上，通过扩增粪便乳杆菌，加入DNA变性剂后，上高分辨熔解曲线进行区分，并与变性梯度凝胶电泳(DGGE)结果相对比，初步建立利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法。

1、尿素、甲酰胺、盐酸胍对高分辨熔解曲线Tm值的影响

3号双歧杆菌菌落PCR：将3号双歧杆菌用LB平板培养过夜，挑取个单菌落，V3区引物PCR扩增序列如表1所示，反应体系为：2×Taqmix：50μL，上下游引物10μM各4μL，超纯水42μL；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30个扩增循环，72℃延伸10min；

表1：V3区引物PCR扩增序列

名称	序列(5'→3')
		V3区引物
	ACTCCTACGGGAGGCAGCAG
			ATTACCGCGGCTGCTGG

取5μL的3号双歧杆菌PCR产物，加入等体积不同浓度的尿素溶液(m/v)，使其终浓度为0，10％，20％，30％，40％；再加入稀释比为1:5000的SYBRGreenI，进行高分辨熔解曲线检测。

所得检测结果如图1、2、3、所示。

如图1所示，曲线从右往左，尿素浓度(w/v)依次为0，10％，20％，30％，40％。随着尿素浓度的升高，高分辨熔解曲线的Tm值降低，说明尿素的添加降低了DNA的解链温度，当尿素浓度达到40％时候，Tm值从88.7℃降低至77.0℃。

如图2所示，曲线从右到左，甲酰胺浓度(v/v)依次为0，10％，20％，30％，40％。随着甲酰胺浓度的升高，高分辨熔解曲线的Tm值降低，说明甲酰胺的添加降低了DNA的解链温度。当甲酰胺浓度达到40％时候，Tm值从88.7℃降低至59.6℃。与尿素相比，甲酰胺使解链温度降低的幅度更大，可能原因是甲酰胺更能耐受高温，随着温度升高，尿素容易分解，而甲酰胺性质不会改变。

如图3所示，随着盐酸胍浓度的升高，高分辨熔解曲线的Tm值反而升高，表明盐酸胍不能降低DNA解链温度。

2、大肠杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌高分辨溶解曲线应用与分析

2.1分别对大肠杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌和对混合的大肠杆菌、粪肠球菌、乳杆菌进行PCR扩增。

反应体系为：2×Taqmix：20μL；各自引物(10μM)上下游各2μL，模板2μL，ddH₂O加置40μL。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环，最后72℃延伸10min。

2.2、分别取10μL大肠杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌和混合的大肠杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌的PCR产物，混入40％浓度的甲酰胺(v/v)，40％浓度的尿素(w/v)，0.4M盐酸胍(v/v)，再加入稀释比为1:5000的SYBRGreenI，进行高分辨熔解曲线检测。另取10μL上述目标菌的PCR产物加入等体积的PBS，作为空白对照。检测结果如图4～11所示。

由图4和图5、图6和图7、图8和图9对比可知，加入DNA变性剂后使得不同菌的出峰位置有了不同的改变，由图10和图11对比可得DNA变性剂的加入，可使得菌群熔解曲线峰型分散，Tm值更容易区分，达到分辨菌的目的。

实施例：高分辨溶解曲线应用于分析粪便菌群

1)小鼠粪便DNA提取：

取小鼠粪便于离心管中，加入600μL的裂解缓冲液，0.3～0.4g玻璃珠，400μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，在振荡器上振5min，13000r/min离心5min，收集上清至新的离心管中；

加入250μL10M乙酸铵，充分混匀后冰浴10min，13000r/min在4℃离心5min，收集上清至新的离心管中；

加入500μL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液抽提，13000r/min在4℃离心5min，收集上清至新的离心管中；

加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合液抽提，13000r/min在4℃离心5min，收集上清至新的离心管中；

加入0.6倍体积的冰异丙醇，混匀后置于-20℃静置10min，4℃下，13000r/min离心5min，弃上清；

加入500μL75％冰乙醇洗涤沉淀，13000r/min在℃离心5min，弃上清，自然干燥；

加入50μLddH₂O充分溶解DNA，同时添加1～5μLRNAase(10mg/mL)除去RNA。

2)对小鼠粪便中的乳杆菌进行PCR扩增：

反应体系为：2×Taqmix：20μL；乳杆菌引物的PCR扩增序列如表2所示，上下游引物(10μM)各2μL，模板2μL，ddH2O加置40μL。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环，最后72℃延伸10min。

表2：乳杆菌引物的PCR扩增序列

名称	序列(5'→3')
		乳杆菌引物
	AGCAGTAGGGAATCTTCCA
			ATTYCACCGCTACACATG

3)对粪便中总乳杆菌PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析。

4)在PCR产物中加入DNA变性剂，进行高分辨溶解曲线分析：

取10μL的PCR产物，混入40％浓度的甲酰胺(v/v)，40％浓度的尿素(w/v)，0.4M盐酸胍(v/v)，再加入稀释比为1:5000的SYBRGreenI，进行高分辨熔解曲线检测。另取10μL的PCR产物加入等体积的PBS，作为空白对照。

5)将高分辨溶解曲线分析结果与变性梯度凝胶电泳分析结果相对比，初步建立高分辨熔解曲线用于菌群种类分析的方法。

结果分析：如图12A所示，没有加入DNA变性剂的熔解曲线峰重叠，导致菌群无法区分。如图12B所示，加入了DNA变性剂之后，出现了六个峰，基本能和图12C的DGGE结果的图谱吻合。说明DNA变性剂的加入，可使得菌群熔解曲线峰型分散，Tm值更容易区分。

Claims

1.一种利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)目标菌DNA提取；

2)通过设计引物使目标菌DNA的PCR扩增；

3)对目标菌DNA的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳分析；

2.根据权利要求1所述的利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法，其特征在于：步骤4)中，尿酸作用浓度为0％～40％m/v，甲酰胺作用浓度0％～40％v/v，盐酸胍作用浓度为0.2～1.0mol/L。