CN102776172B

CN102776172B - 一种通用多重pcr方法

Info

Publication number: CN102776172B
Application number: CN2012101933524A
Authority: CN
Inventors: 张春庆; 温大兴
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2032-06-13
Also published as: CN102776172A

Abstract

本发明涉及一种通用多重PCR方法，是通过增加通用接头序列，使引物间退火温度的差异变小，且增加接头后的引物的退火温度(70℃左右)与延伸温度相近，可以合并退火和延伸阶段，缩短PCR时间；并根据引物退火温度从高到低的逐一退火循环，利用两段循环模式提高PCR产物的特异性和产量。本发明能显著提高多重PCR的通用性，可应用于多个领域，如：种子纯度鉴定、品种真实性鉴定、多态性分析、突变分析、定量分析和物种鉴定等。

Description

一种通用多重PCR方法

一、技术领域

本发明涉及一种通用多重PCR方法，具体涉及一种多重PCR技术的引物设计方法和相应的PCR扩增程序的建立，尤其是能提高多重PCR的通用性。

二、背景技术

多重PCR(Multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进的，在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一个模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术，这一概念由Chambercian J.S.等(1988)率先提出。多重PCR具有节省时间、降低成本、提高效率等优点，被提出以后便迅速发展，现已应用于生命科学的多个领域(如：多态性分析、突变分析、定量分析和物种鉴定等。)，成为一项重要的应用技术。传统的多重PCR也具有诸多不足，如：复杂的扩增体系、扩增效率低、不同的模板扩增效率不一致、通用性差等。

由于在多重PCR反应体系中加入了多对引物，因此增加了引物设计的难度，而且使不同引物的最佳退火温度、延伸时间和循环次数等诸多因素的协调变得困难。传统的多重PCR极易导致非特异性扩增反应的发生，从而导致多重PCR的通用性受到影响。多重PCR的引物设计是一个关键环节，如果能在引物设计这一关键环节降低非特异性扩增反应的发生，那么就有可能显著提高多重PCR的通用性。

为了突破多重PCR的通用性差这个瓶颈，国内外很多研究者加入了提高多重PCR的通用性研究的行列，并取得了一些成绩。近年来有一些提高多重PCR的通用性的研究报道，部分方法有所改善，但有待进一步提高。

三、发明内容

为了提高多重PCR的通用性,本发明提供了一种通用多重PCR方法，该方法不仅能一次扩增多个目的片段，而且能显著降低非特异性扩增。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先，在筛选或设计好的每对特异性上游引物和下游引物的5’端都分别加上通用PCR接头Universal adapter-F(5’-CTCGTAGACTGCGTACCA-3’)，（其序列如SEQ ID NO：1所示）和universal adapter-R(5’-TACTCAGGACTCATCGTC-3’)（SEQ ID NO：2所示），引物加上接头后命名为通用PCR接头引物；然后采用两段循环模式PCR扩增程序进行PCR扩增，该PCR扩增程序为：①预变性（94℃，5min）。②第一段循环（循环数：3）命名为“逐一退火循环”：变性（94℃，40s）；按照未加通用接头前的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一分别退火（未加通用接头前的多对引物的退火温度应根据Tm值进行优化；在设定退火温度时，退火温度相近的可以合并为一个温度），每个退火温度的退火时间为20s；延伸（72℃，30s）。③第二段循环（循环数：28-32，通常为30个循环）：变性（94℃，40s）；将退火和延伸过程合并（70℃，50s）。④终延伸（72℃，10min）。详细的通用多重PCR扩增程序见表1。

表1通用多重PCR程序(两段循环模式)

退火温度从高到低的引物依次为：引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、……。第二段循环的循环数为28～32，通常为30个循环。

本发明通过逐一退火循环，解决了多个引物在同一PCR反应体系中对底物竞争结合问题，使第二段扩增的模板尽量一致；其次，通过增加通用接头序列，使引物间退火温度的差异变小，且增加接头后的引物的退火温度(70℃左右)与延伸温度相近，可以合并退火和延伸阶段，缩短PCR时间。通过以上改进，多重PCR产物的特异性和产量都能大幅度地提高。

本发明的通用多重PCR方法与以往多重PCR方法相比，具有以下优势：

1）以往的多重PCR通用性较差，本发明的通用多重PCR方法可以显著提高多重PCR的通用性；

2）本发明设计出了适用于多重PCR扩增方法的通用接头universal adapter-F(5’-CTCGTAGACTGCGTACCA-3’)和universal adapter-R(5’-TACTCAGGACTCATCGTC-3’)，这两段接头的序列是稀有的，在利用本发明用于种子纯度鉴定、品种真实性鉴定、物种鉴定、多态性分析、突变分析和定量分析等用途时，只需要在筛选或设计好的引物的5’端接上这两段通用接头，即可通过该多重PCR扩增方法进行检测；

3）本发明采用了根据引物退火温度从高到低的逐一退火循环，利用两段循环模式可以显著提高PCR产物的特异性和产量。

本发明的有益效果是，提高了多重PCR的通用性，降低非特异性扩增。根据本发明的通用多重PCR的原理和技术方案，该通用多重PCR方法可以应用于多种通用接头引物组合，其扩增产物的大小或测序结果可以应用于多个领域，如：种子纯度鉴定、品种真实性鉴定、物种鉴定、多态性分析、突变分析和定量分析等。

四、附图说明

图1通用多重PCR扩增程序(两段循环模式)的原理图

图中黑色箭头为引物，灰色短线为通用接头。在进行通用多重PCR扩增程序的第一段循环的第一个循环的退火阶段时，因为通用接头没有模板，所以只有引物与DNA模板结合。从第二个循环开始，通用接头的模板开始合成。从第三个循环开始，引物和通用接头都可以与相应的模板结合。因为通用接头开始起作用(相当于引物长度增加)，所以可以提高退火温度，从而增强PCR产物的特异性。综合考虑PCR产物的产量和试验结果，最终确定第三个循环也按照逐一退火循环进行(可以增加PCR产物的产量，如果第一段循环只进行两次循环，有些引物的扩增产物的产量会严重降低。)。在第二段循环采用较高的退火温度，可以增强PCR产物的特异性。

图2通用五重PCR扩增产物经9%PAGE检测的电泳结果图。

M：20bp DNA Marker(Takara，日本)。1-20为单重PCR，21-24：为相应的五重PCR。各个泳道所用的通用接头引物分别为：1-4：U-phi085；5-8：U-phi041；9-12：U-phi123；13-16：U-umc1268；17-20：U-phi120；21-24：U-phi085，U-phi041，U-phi123，U-umc1268和U-phi120。不同的DNA样品所对应的泳道分别为：郑单958：1，2，5，6，9，10，13，14，17，18，21，22;先玉335:3，4，7，8，11，12，15，16，19，20，23，24。

图3通用五重PCR检测一批玉米种子（郑单958，200粒）纯度的电泳结果图。

M：20bp DNA Marker(Takara，日本)，片段大小从上到下依次为：300bp，200bp，180bp，160bp，140bp，120bp，100bp。本实施例所用的通用接头引物组合为：U-phi085，U-phi041，U-phi123，U-umc1478和U-umc1268。图中直线方框内为郑单958的母本自交粒的带型，虚线方框内为检出的杂粒的带型，其余的为郑单958的带型。

五、具体实施方式

实施例1五重PCR扩增与单重PCR扩增方法比较

1材料

玉米商品种子郑单958和先玉335。

2方法

（1）DNA提取

将玉米干种子磨碎后，用SDS法提取DNA，提取后的DNA稀释至100ng/μL。

（2）通用多重PCR引物筛选

本实施例选取了5对高多态性的SSR引物（引物参数见表2），这5对引物的Tm值跨度为57.3～63.95(在进行多重PCR时，这个跨度属于比较大的，跨度越小多重PCR越容易成功)，且这5对引物对郑单958和先玉335的DNA进行扩增后，PCR产物的大小不同，从而可以根据目标带的大小区分郑单958和先玉335。

表2接头和引物的参数

universal adapter-F：上游引物的通用接头；universal adapter-R：下游引物的通用接头；phi085-F：上游引物；phi085-R：下游引物；U-phi085-F：通用接头引物的上游引物；U-phi085-R：通用接头引物的下游引物；Tm：来自引物合成报告单；退火温度：根据Tm值优化的退火温度。

（3）通用多重PCR扩增

通用五重PCR扩增采用20μL体系，其中10μL 2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke,北京，中国)，每对通用接头引物（Sangon，上海，中国)的上、下游引物(10μM)各加0.5μL(共5对引物，如果某对通用接头引物扩增效率较低可以通过调节引物的用量来进行调节，或结合其他参数进行调节。)，2μL DNA,用DEPC H₂O补足20μL。图2中，1-20的单重PCR扩增也采用20μL体系，其中10μL 2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke,北京，中国)，上、下游引物(10μM)各加0.5μL，2μL DNA,用DEPC H₂O补足20μL。具体的PCR程序见表3。

表3五重PCR扩增程序

由于不同的未加接头序列的原引物退火温度不同，第一段循环的逐一退火温度由高到低依次为62℃、61℃、60℃、56℃。

（4）电泳检测

用9%的聚丙烯酰胺凝胶检测步骤（3）的PCR扩增产物，电泳结果见图2。

如图2所示，引物加入通用接头序列后，使用单一通用接头引物扩增和5对通用接头引物组成的多重PCR扩增均能得到较好的扩增产物。由于SSR引物具有共显性，郑单958和先玉335为玉米杂交种，因此有些引物扩增的目标带为两条。从泳道21-24可以看出，利用本发明对5对引物进行多重扩增质量较高，说明该通用多重PCR方法有潜力扩增更多对引物。

实施例2利用本发明对玉米种子进行纯度检测

1材料

选取郑单958玉米商品种子200粒进行纯度检测。

2方法

（1）DNA提取

单粒玉米种子磨碎后，用SDS法分别提取DNA，提取后的DNA稀释至100ng/μL。

（2）通用多重PCR引物筛选

为了说明本发明的多重PCR的通用性，本次所用的接头和引物参数见表4，这5对引物的Tm值跨度为57.3～65.52(在进行多重PCR时，这个跨度属于比较大的，跨度越小多重PCR越容易成功)，且这5对引物对郑单958的DNA进行扩增后，PCR产物的大小不同，从而可以根据目标带大小区分郑单958的带型、郑单958母本自交粒的带型和杂粒的带型。

表4接头和引物的参数

universal adapter-F：上游引物的通用接头；universal adapter-R：下游引物的通用接头；phi085-F：

上游引物；phi085-R：下游引物；U-phi085-F：通用接头引物的上游引物；U-phi085-R：通用接头引物的下游引物；Tm：来自引物合成报告单；退火温度：根据Tm值优化的退火温度。

（3）通用多重PCR扩增

通用五重PCR扩增采用20μL体系，其中10μL 2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke,北京，中国)，每对通用接头引物（Sangon，上海，中国)的上、下游引物(10μM)各加0.5μL(共5对通用接头引物)，2μL DNA,用DEPC H₂O补足20μL。具体的PCR程序见表5。

表5实施例2的五重PCR扩增程序

由于不同的未加接头序列的原引物退火温度不同，第一段循环的逐一退火温度由高到低依次为63℃、62℃、61℃、60℃、56℃。

（4）电泳检测

用9%的聚丙烯酰胺凝胶检测步骤（3）的PCR扩增产物，电泳结果见图3。

图3显示，五重PCR表现良好，根据PCR产物的目标带大小，能区分郑单958的带型、郑单958母本自交粒的带型和杂粒的带型。在本次检测的200粒种子中，192粒为郑单958,4粒为郑单958母本自交粒，4粒为杂粒，纯度为96%。因此，本发明的通用多重PCR方法可以用于种子纯度检测，如果检测更多对引物，就可以用于品种真实性鉴定。

Claims

1.一种通用多重PCR方法，其特征在于：先在每对特异性上游引物和下游引物的5’端都分别加上通用PCR接头universal adapter-F：5’-CTCGTAGACTGCGTACCA-3’和universal adapter-R：5’-TACTCAGGACTCATCGTC-3’；再采用两段循环模式PCR扩增程序进行PCR扩增，PCR扩增程序为：①预变性94℃，5min；②第一段循环为“逐一退火循环”，循环数：3；变性：94℃，40s；按照未加通用接头前的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一分别退火，每个退火温度的退火时间为20s；延伸：72℃，30s；③第二段循环：循环数：28-32；变性：94℃，40s；退火和延伸过程合并：70℃，50s；④终延伸：72℃，10min。