CN102399853B - 一种用于检测转基因大豆的锁式探针及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因大豆的锁式探针及检测方法，所述锁式探针对转基因大豆的内源基因和多个外源基因设计，能特异性的检测出各靶标序列；所述检测方法将基于锁式探针的多重滚环扩增与基因芯片相结合，采用一对通用引物对不同的锁式探针进行滚环扩增，以滚环扩增产物为模板进行基因芯片检测，实现了多个靶标的简便、快速、同时检测。本发明公开的转基因大豆锁式探针及检测方法特异性强、操作简便、扩展性能好、灵敏、可靠，特别适用于口岸检验检疫等部门。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因产品的检测，特别是涉及一种基于锁式探针的滚环扩增与基因芯片相结合的转基因大豆检测方法。
背景技术
1983年第一例转基因作物(Genetically Modified Organism，GMO)面世，标志着人类利用基因工程技术改良作物的开始。转基因作物在抗虫、抗病害、抗除草剂及品质改良方面较常规育种周期更短，更具备优势，产生巨大的经济效益，商业种植面积迅速增加。随着转基因作物的在全球内种植比例不断升高，其安全性也受到广泛关注。各国都对转基因作物在环境安全、对人体健康影响、标签贴示及知识产权方面给予重视。转基因大豆在转基因作物中种植面积最广，而Round up ready(RRS)在转基因大豆中所占比例最高。
国内外研究者对转基因大豆Round up ready的检测方法都进行了大量的研究，主要采用多重PCR，多重实时荧光PCR、PCR-基因芯片等检测方法。传统的多重常规PCR检测方法在平台扩展方法具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大。而多重实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。
1994年Nilsson在《Science》杂志报道的Padlock Probe(简称PLP，中文译名锁式探针)，给多重检测方法提供新的选择，带来了革命性的改变(Nilsson et al.，1994)。锁式探针是长约55-130个碱基的单链DNA。PLP主要由5部分组成：特异性5’端检测区T1(5’带有PO4基团)、通用扩增引物P1、通用扩增引物P2、特异性标签(Zip)、特异性3’端检测区T2。在滚环扩增中利用一对通用引物可以实现对多条探针的同时扩增，并且通过固定在基因芯片上的与锁式探针中Zip标签互补的cZip对滚环扩增产物进行杂交及信号分析，该方法对多重目标进行检测只需更换其中的检测臂区和Zip标签，完全避免了多重PCR检测的每条引物浓度比例等优化调节，并且降低了引物之间的互相竞争，使基因芯片检测不再受到常规多重PCR的限制，实现了真正意义的高通量检测。
发明内容
本发明的目的是针对目前转基因大豆多靶标检测中存在的问题，提供一种特异性好的锁式探针。
本发明的另一目的是针对上述问题，提供一种基于上述锁式探针的操作简便、扩展性能好、灵敏、可靠的转基因大豆检测方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种用于转基因大豆检测的锁式探针，所述探针的序列从5’端到3’端依次包括T1、P1、P2、Zip、T2区段，所述T1和T2为与检测目标序列匹配的检测区域，P1和P2为通用引物结合区域，Zip为特异性标签，
所述T1含有Seq ID No.1所示序列，T2含有Seq ID No.2所示序列；
或者T1含有Seq ID No.3所示序列，T2含有Seq ID No.4所示序列；
或者T1含有Seq ID No.5所示序列，T2含有Seq ID No.6所示序列；
或者T1含有Seq ID No.7所示序列，T2含有Seq ID No.8所示序列；
Seq ID No.1：5’-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-3’
Seq ID No.2：5’-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’
Seq ID No.3：5’-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-3’
Seq ID No.4：5’-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’
Seq ID No.5：5’-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-3’
Seq ID No.6：5’-TGGCACAAATTAACAACAT-3’
Seq ID No.7：5’-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-3’
Seq ID No.8：5’-CCACCTTCCTTTTCCA-3’。
所述锁式探针的Zip区段选自Seq ID No.9-12所示序列中的一条序列；
Seq ID No.9：5’-TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-3’
Seq ID No.10：5’-TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-3’
Seq ID No.11：5’-TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-3’
Seq ID No.12：5’-TATCTCGCTCGCACGGTGGC-3’。
所述锁式探针的P1含有Seq ID No.13所示序列，P2含有Seq ID No.14所示序列；
Seq ID No.13：5’-GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-3’
Seq ID No.14：5’-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-3’。
所述锁式探针分别含有Seq ID No.15-18中任一所示的序列；
Seq ID No.15：5’-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-
Seq ID No.1
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’
Seq ID No.9 Seq ID No.2
Seq ID No.16：5’-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-
Seq ID No.3
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’
Seq ID No.10 Seq ID No.4
Seq ID No.17：5’-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-
Seq ID No.5
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-TGGCACAAATTAACAACAT-3’
Seq ID No.11 Seq ID No.6
Seq ID No.18：5’-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-
Seq ID No.7
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TATCTCGCTCGCACGGTGGC-CCACCTTCCTTTTCCA-3’。
Seq ID No.12 Seq ID No.8
本发明还公开了一种转基因大豆检测方法，所述方法包括，采用上述的锁式探针以转基因大豆DNA为模板进行滚环扩增。
所述方法还包括进行滚环扩增时加入内控参照锁式探针进行同时扩增；所述内控参照锁式探针T1含有Seq ID No.19所示序列，T2含有Seq ID No.20所示序列，Zip含有Seq ID No.21所示序列；
Seq ID No.19：5’-GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-3’
Seq ID No.20：5’-CTATCAGATCCATCAAAAC-3’
Seq ID No.21：5’-TACGTGCTGTACCGCTCCGG-3’。
上述内控参照锁式探针具有Seq ID No.22所示序列；
Seq ID No.22：5’-GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-
Seq ID No.19
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TACGTGCTGTACCGCTCCGG-CTATCAGATCCATCAAAAC-3’
Seq ID No.21 Seq ID No.20
所述方法包括采用Seq ID No.15-18所示序列的锁式探针中的至少一条以及Seq ID No.22所示序列的内控参照锁式探针以转基因大豆DNA为模板，在同一个反应中进行滚环扩增。
所述方法还包括以滚环扩增产物为模板进行基因芯片检测，所述基因芯片上设置有能与所述锁式探针Zip区段特异匹配的探针序列。
由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：
本发明利用具有特殊结构的锁式探针，采用一对通用引物对多条锁式探针进行同时滚环扩增，并将多重滚环扩增与基因芯片检测方法相结合，有效的避免了目前转基因大豆多靶标检测中多重引物PCR扩增相互影响的问题，实现了转基因大豆内源基因Lectin、外源基因camv35S启动子、Nos终止子、CP4EPSPS基因及Roundup Ready Soybean品系特异性基因(RRS品系基因)等五个靶标序列的同时检测，为转基因大豆检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。
附图说明
图1为锁式探针构成示意图；
图2为本发明实验例1的滚环扩增检测锁式探针特异性的结果图，图中泳道M为DNA Marker DL2000，1-5为PLP-Lectin、PLP-35S、PLP-Nos、PLP-CP4和PLP-RRSS对转基因大豆的扩增结果，泳道6-10分别为PLP-Lectin、PLP-35S、PLP-Nos、PLP-CP4和PLP-RRSS对非转基因大豆的扩增结果，11为水对照；
图3为本发明实验例2的基因芯片五重靶标检测结果图，图中A为转基因大豆基因芯片检测结果图，B为非转基因大豆检测结果图。
具体实施方式
本发明涉及一种用于检测转基因大豆的锁式探针，及其与基因芯片相结合的转基因大豆检测方法。
本发明的锁式探针是长100-120个碱基长度的单链DNA，锁式探针主要由5部分组成：特异性5’端检测区T1(5’带有磷酸基团)、通用扩增引物结合区P1和P2、特异性标签Zip、特异性3’端检测区T2。特异性检测区的T1、T2通过碱基互补对目标DNA序列进行识别，当T1和T2与目标DNA完全匹配时，在连接酶作用下将锁式探针连接成环形，未被连接成环的线性锁式探针被核酸外切酶降解，然后利用一对与P1和P2结合的通用扩增引物对环化的锁式探针进行扩增。根据上述检测原理，本发明分别针对转基因大豆通常含有的camv35S启动子和Nos终止子，以及目前转基因大豆应用较广泛的抗除草剂基因CP4EPSPS基因和RRS品系基因，设计四条检测转基因大豆外源基因的特异性锁式探针：PLP-35S、PLP-Nos、PLP-CP4EPS和PLP-RRS。
本发明用于检测camv35S启动子的锁式探针PLP-35S含有Seq ID No.15所示序列；
Seq ID No.15：
5’-PO4-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-
Seq ID No.1
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’
Seq ID No.9 Seq ID No.2
本发明用于检测Nos终止子的锁式探针PLP-Nos含有Seq ID No.16所示序列；
Seq ID No.16：
5’-PO4-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-
Seq ID No.3
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’
Seq ID No.10 Seq ID No.4
本发明用于检测CP4EPSPS基因的锁式探针PLP-CP4EPS含有Seq ID No.17所示序列；
Seq ID No.17：
5’-PO4-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-
Seq ID No.5
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-TGGCACAAATTAACAACAT-3’
Seq ID No.11 Seq ID No.6
本发明用于检测RRS品系的锁式探针PLP-RRS含有Seq ID No.18所示序列；
Seq ID No.18：
5’-PO4-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-
Seq ID No.7
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TATCTCGCTCGCACGGTGGC-CCACCTTCCTTTTCCA-3’。
Seq ID No.12 Seq ID No.8
为保证检测结果的准确性，本发明还根据大豆内源基因Lectin设计了一条内控参照锁式探针PLP-Lectin，含有Seq ID No.22所示序列：
Seq ID No.22
5’-PO4-GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-
Seq ID No.19
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TACGTGCTGTACCGCTCCGG-CTATCAGATCCATCAAAAC-3’
Seq ID No.21 Seq ID No.20
利用上述锁式探针本发明首先建立了能同时检测大豆内源基因和多个外源转基因的多重滚环扩增。具体方法可以将上述内控参照锁式探针PLP-Lectin和外源基因锁式探针PLP-35S、PLP-Nos、PLP-CP4EPS、PLP-RRS中的至少一条混合，以转基因大豆DNA为模板，在连接酶的作用下连接成环状锁式探针，经过外切酶消化处理后，采用通用引物对环状锁式探针进行滚环扩增，其中上游通用引物具有Seq ID No.23所示序列，下游通用引物具有Seq ID No.14所示序列；
Seq ID No.23：5’-GGACGAGTCTCTATGCCTAAGC-3’。
为了进一步的实现多靶标序列的同时检测，本发明优选的采用基因芯片对滚环扩增产物进行分析。在锁式探针设计中，每条锁式探针对应一个特异性的不重复的Zip序列，因此可以针对不同的Zip序列设计用于基因芯片的特异性基因芯片检测探针，实现基于锁式探针的滚环扩增与基因芯片多靶标检测。其中基因芯片阳性定位探针含有Seq ID No.24所示序列，阴性定位探针含有Seq IDNo.25所示序列，阳性定位探针互补链含有Seq ID No.26所示序列；
Seq ID No.24：5’-GGGTGGGATCAATTTGG-3’
Seq ID No.25：5’-CTGGAACAGCCAGAAGGAC-3’
Seq ID No.26：5’-CCAAATTGATCCCACCC-3’。
本发明建立的转基因大豆检测方法，将滚环扩增与基因芯片相结合，利用滚环扩增能够实现一对通用引物对多条环状锁式探针进行同时扩增的特点，有效的避免了传统基因芯片中靶标序列扩增和检测信号标记困难的问题。特别的，锁式探针的特殊结构，即提供了通用引物结合区，又提供了每条探针所特异的Zip区，特别适用于对不同靶标序列的基因芯片多重检测。本发明中，针对转基因大豆四个不同靶标序列设计特异性锁式探针，能够对目前应用较广泛的不同转基因大豆品种进行同时检测鉴定，并且设计转基因大豆检测中常用的内源基因Lectin作为参照，保证了检测结果的准确性。
下面通过具体实验例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实验例1：锁式探针特异性检测
一、材料和仪器
Round up ready转基因大豆及非转基因大豆由深圳出入境检验检疫局动植中心提供，dNTPs Mixture、DNA Marker DL2000购自大连TaKaRa公司。Taq DNALigase、Exonuclease III、Exonuclease I、Bst DNA polymerase large fragment购自New England Biolabs。
Biometra Grident PCR仪和Syngene凝胶成像系统均由深圳出入境检验检疫局动植中心提供。
二、实验方法
1、引物和锁式探针探针设计
根据国家标准中转基因大豆检测所使用的引物扩增区域的序列，分别设计针对大豆内源基因Lectin、外源基因35S启动子、Nos终止子、CP4EPSPS基因及RRS品系的相应锁式探针。所设计的锁式探针包含五个组成部分，依次为：T1、P1、P2、Zip、T2(图1)，锁式探针设计原则主要采用“不对称设计原则”，即位于锁式探针5’端检测臂T1长度为25-35个碱基长度，Tm值60-70℃；3’端的检测臂T2长度为14-20个碱基长度，Tm值40-50℃。采用该设计方法，通过65℃连接过程中T2区的不稳定性增加连接反应的特异性，同时也使整个锁式探针的长度缩短，增加了合成的质量。本方法中所使用的基础Zip标签和通用引物由章桂明提供，其中Zip标签由DNAMAN v6.0软件随机生成的20碱基长度的序列，Tm值控制在65℃±3℃，并通过NCBI的Blastn软件进行比对，选择与转基因大豆DNA同源性极低的序列。锁式探针由IDT公司或TaKaRa公司合成(表1)。
表1锁式探针序列
2、转基因大豆锁式探针特异性检测
为了测试所设计的转基因大豆锁式探针特异性，利用单重锁式探针对供试转基因大豆和非转基因大豆DNA进行滚环扩增检测，具体步骤如下。
(1)连接反应
连接反应总体积为10μl：含有1μl 10×ligase buffer，25pM锁式探针，8U连接酶Ligase，1μl DNA模板，补水至10μl。冰浴操作，混匀后瞬离，置于BiometraGrident PCR仪中，程序设置为94℃预变性5min；94℃变性15s，65℃连接5min，15个循环；94℃变性15min，15℃结束。
(2)消化反应
消化混合液总体积为10μl：含有10×Exonuclease I buffer 2μl，10UExonuclease I 0.5μl，20U Exonuclease III 0.1μl，补水至10μl，将消化混合液加入至连接产物中，混匀后瞬离，37℃反应2h，80℃变性20min，15℃结束。
(3)扩增反应
HRCA反应混合液总体积为20μl：含有10×Bst DNA polymerase buffer 2μl，8U/μl Bst DNA polymerase 0.3μl，2.5mM dNTP 2μl，10μM通用扩增引物Primer-P1和Primer-P2(表1)各2μl，连接消化产物2μl，补水至20μl，混匀后瞬离，62℃反应1h。
滚环扩增结束后取扩增产物5μl通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
三、实验结果
根据滚环扩增结果所示，设计的转基因大豆锁式探针对供试的转基因大豆有特异性扩增，扩增出典型的Ladder状带型的扩增产物，而对非转基因大豆仅用于参照的内源Lectin基因扩增出典型的Ladder状带型扩增产物，水对照没有扩增出Ladder状产物(图2)。
实验例2：基于多重滚环扩增的转基因大豆基因芯片检测
一、材料和仪器
滚环扩增反应试剂同实验例1，20×SSC、20×SSPE、10％SDS购自Sigma公司，醛基化固相芯片、4孔围栏、盖片、杂交盒和玻片支架购自北京博奥生物公司，其余试剂为国产分析纯。
Biometra Grident PCR仪、Nano-plotter 2.0芯片点样仪、GenePix 4200A芯片扫描仪、Thermolyne
3磁力搅拌器、Binder 115烘箱、Syngene凝胶成像系统均由深圳出入境检验检疫局动植中心提供。
二、实验方法
1、基因芯片检测探针设计
基因芯片检测探针为Zip标签标签互补的核酸序列。阴性质控探针和阳性定位探针均是一段与待检基因无关的寡核苷酸，即与本研究所涉及的供试探针同源性很远的探针。本研究利用的阴性质控探针和阳性定位探针均为上海博星基因芯片有限公司提供的人类基因组的一段核苷酸序列。空白质控点由不含核酸的50％DMSO点样液点制而成，用于基因芯片杂交背景的监控。由TaKaRa公司合成(表2)。
表2基因芯片检测探针
2、基因芯片基片制备
用TE将固相芯片探针(表2)溶解至20μM终浓度，与50％DMSO混匀后置于384孔板中，按照预先设计好的点样顺序(表3)，在Nano-plotter 2.0芯片点样仪中编程，参数设置为：每条探针重复点样5次，点间距为500μm，湿度设置为75％，点样完毕后至于保湿盒内37℃水合12h。
按照如下操作进行水合后续处理：
(1)将芯片置于玻片架上，浸没于0.2％SDS芯片洗涤液，磁力搅拌洗涤5min，去离子水洗涤3次，每次5min。
(2)用2％NaBH4溶液(现配现用)磁力搅拌处理15min，其间静置5min，去离子水中洗涤3次，每次5min。
(3)3000rpm离心2min干燥，4℃避光保存备用。
表3转基因大豆检测基因芯片点样排布
| A | A | A | A | A | A | A | A | A | A | A |
| A | Lectin | Lectin | Lectin | Lectin | Lectin | P35S | P35S | P35S | P35S | P35S |
| A | NOS | NOS | NOS | NOS | NOS | CP4 | CP4 | CP4 | CP4 | CP4 |
| A | RRS | RRS | RRS | RRS | RRS | N | N | N | N | N |
| A | B | B | B | B | B |
3、多重滚环扩增
连接反应总体积为20μl：含有10×ligase buffer 2μl，5种待检目标特异性锁式探针各10pM(PLP-Lectin、PLP-35S、PLP-Nos、PLP-CP4EPS、PLP-RRS)，8U连接酶Ligase，DNA模板1μl，补水至20μl。设置非转基因大豆为对照。冰浴操作，混匀后瞬离，置于Biometra Grident PCR仪中，程序设置为94℃预变性5min；94℃变性15s，65℃连接5min，15个循环；94℃变性15min，15℃结束。消化反应和扩增反应体系及条件同实施例1，引物Primer-P2更换为Cy5标记的Cy5-Primer-P2。扩增完毕后进行芯片检测。
4、转基因大豆基因芯片检测
取荧光HRCA反应产物5μl，1μl 100pM Cy5标记的阳性定位探针互补链(表2)，5μl杂交液(5×SSC，0.1％SDS)，4μl水混匀后置于94℃变性5min，立即至于冰水混合物中冰浴5min，然后将变性产物按照预先排布顺序加入到固相芯片点样孔中，封闭芯片杂交盒后置于烘箱中50℃杂交2h。
将芯片依次放入42℃预热清洗液I(0.3×SSC，0.1％SDS)和清洗液II(0.06×SSC)，各磁力搅拌清洗5min，3000rpm离心1min干燥。上机扫描，通道设置为635nm，扫描仪设置为功率60％，PMT设置为600。
三、实验结果
根据基因芯片检测结果，内源基因Lectin特异性锁式探针PLP-Lectin对转基因大豆和非转基因大豆均有杂交信号，而外源基因35S启动子、Nos终止子、CP4EPSPS基因、RRS品系的特异性锁式探针仅对转基因大豆有杂交信号，而对非转基因大豆没有杂交信号(图3)，可见设计的锁式探针能够特异性的从非转基因大豆中检测出转基因大豆。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于转基因大豆检测的锁式探针，所述探针的序列从5’端到3’端依次包括T1、P1、P2、Zip、T2区段，所述T1和T2为与检测目标序列匹配的检测区域，P1和P2为通用引物结合区域，Zip为特异性标签，其特征在于：
所述T1为Seq ID No.1所示序列，T2为Seq ID No.2所示序列；
或者T1为Seq ID No.3所示序列，T2为Seq ID No.4所示序列；
或者T1为Seq ID No.5所示序列，T2为Seq ID No.6所示序列；
或者T1为Seq ID No.7所示序列，T2为Seq ID No.8所示序列；
Seq ID No.1：5’-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-3’
Seq ID No.2：5’-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’
Seq ID No.3：5’-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-3’
Seq ID No.4：5’-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’
Seq ID No.5：5’-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-3’
Seq ID No.6：5’-TGGCACAAATTAACAACAT-3’
Seq ID No.7：5’-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-3’
Seq ID No.8：5’-CCACCTTCCTTTTCCA-3’；
所述锁式探针的Zip区段选自Seq ID No.9-12所示序列中的一条序列；
Seq ID No.9：5’-TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-3’
Seq ID No.10：5’-TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-3’
Seq ID No.11：5’-TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-3’
Seq ID No.12：5’-TATCTCGCTCGCACGGTGGC-3’；
所述锁式探针的P1为Seq ID No.13所示序列，P2为Seq ID No.14所示序列；
Seq ID No.13：5’-GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-3’
Seq ID No.14：5’-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-3’。
2.如权利要求1所述锁式探针，其特征在于：所述锁式探针分别为Seq ID No.15-18中任一所示的序列；
Seq ID No.15：
5’-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-
Seq ID No.1
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TCGTTGCGCTGCAGTACGCC-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’
Seq ID No.9 Seq ID No.2
Seq ID No.16：
5’-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-
Seq ID No.3
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TGCGTGTAGCACGGCCTCCT-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’
Seq ID No.10 Seq ID No.4
Seq ID No.17：
5’-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-
Seq ID No.5
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TCCGTTAGCGGTCCAGCTCG-TGGCACAAATTAACAACAT-3’
Seq ID No.11 Seq ID No.6
Seq ID No.18：
5’-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-
Seq ID No.7
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TATCTCGCTCGCACGGTGGC-CCACCTTCCTTTTCCA-3’
Seq ID No.12 Seq ID No.8。
3.一种转基因大豆检测方法，所述方法包括，采用权利要求1或2所述的锁式探针以转基因大豆DNA为模板进行滚环扩增。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于：所述方法还包括进行滚环扩增时加入内控参照锁式探针进行同时扩增；所述内控参照锁式探针T1为Seq ID No.19所示序列，T2为Seq ID No.20所示序列，Zip为Seq ID No.21所示序列；
Seq ID No.19：5’-GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-3’
Seq ID No.20：5’-CTATCAGATCCATCAAAAC-3’
Seq ID No.21：5’-TACGTGCTGTACCGCTCCGG-3’；
所述内控参照锁式探针为Seq ID No.22所示序列；
Seq ID No.22：
5’-GACGTCTTGGGATTTGGCCAACAATA-
Seq ID No.19
GCTTAGGCATAGAGACTCGTCC-GTCGACCAGACTGTGTATCGT-
Seq ID No.13 Seq ID No.14
TACGTGCTGTACCGCTCCGG-CTATCAGATCCATCAAAAC-3’
Seq ID No.21 Seq ID No.20。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于：所述方法包括采用Seq ID No.15-18所示序列的锁式探针中的至少一条以及Seq ID No.22所示序列的内控参照锁式探针以转基因大豆DNA为模板，在同一个反应中进行滚环扩增。
6.如权利要求3-5任一项所述方法，其特征在于：所述方法还包括以滚环扩增产物为模板进行基因芯片检测，所述基因芯片上设置有能与所述锁式探针Zip区段特异匹配的探针序列。
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| 张 莹等.转基因植物的检测策略和检测技术.《植物保护》.2007,第33卷(第1期),第11－14页. |
| 转基因植物的检测策略和检测技术;张 莹等;《植物保护》;20071231;第33卷(第1期);第11－14页 * |
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