CN104278036B - 一组特异识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组特异性识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子Sp1、Sp20，是通过Cell‑SELEX技术以完整的宋内氏志贺氏菌细胞作为靶标对体外合成的随机单链寡核苷酸文库进行筛选、扩增、酶切、测序、亲和力和特异性分析得到的，属于食品安全分子生物领域。筛选获得的适配子具有高亲和性和特异性、性质稳定、体外合成方便且成本低等特点，能通过标记功能基团或荧光染料运用于食品中宋内氏志贺氏菌的检测，为现今依赖抗体的检测方法提供了新的选择。

Description

一组特异识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子

技术领域

本发明涉及食品安全生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选一组与宋内氏志贺氏菌高特异亲和的寡核苷酸适配子，为该核酸适配子在检测食品中宋内氏志贺氏菌的应用提供科学依据和理论基础。

背景技术

志贺氏菌是一种具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌。在发展中国家，由志贺氏菌引起细菌性痢疾的重大卫生事件时常发生，尤其夏秋两季最为常见，每年约有1.6亿个感染病例，约100万死于细菌性痢疾。志贺氏菌主要是经口感染，色拉、生的蔬菜、奶和奶制品、禽、水果、饮水、面包制品等易被污染。志贺氏菌能分泌强烈的内毒素和外毒素，引起发冷、发热、腹泻、里急后重、排粘液脓血样大便、神志障碍、甚至中毒性休克等症状。而宋内氏志贺氏菌是志贺氏菌中对外界环境抵抗力最强，分布较广的一类菌型，因此建立快速、灵敏、准确地检测宋内氏志贺氏菌的检测方法至关重要。

现今，用于宋内氏志贺氏菌的检测包括传统的生物学检测、分子生物检测、免疫学检测方法。传统的细菌培养和生化鉴定耗时，操作繁琐；分子生物学检测比如PCR方法虽然快速、准确，但是易受操作条件影响其特异性；免疫学检测具有特异性强、准确、灵敏的特点，但制备特异性抗体的过程耗时复杂，制备出的抗体也易受温度等环境因素的影响。

适配子是通过SELEX技术从体外合成的随机寡核苷酸单链文库中筛选而得，能够以特定的结构与靶标高特异亲和的一段较短的单链DNA序列或RNA序列。如今，适配子已经广泛地应用于如靶标检测、酶抑制，受体调节和药物传递等各种领域。适配子相比抗体表现出极大的优势，除了具有较高的特异亲和性；适配子筛选完全在体外进行，筛选周期短，合成方便且成本低，同时易标记一些功能基团和报告分子；适配子变性与复性可逆且速度快，稳定好，受环境条件影响小，可长期保存。随着SELEX技术的不断完善进步，适配子已经广泛用于不同的靶标，如小分子物质(有机染料，金属，药物，氨基酸，核苷酸和肽等)、蛋白质(包括酶、抗体、基因调控因子，以及外源凝集素)、肿瘤细胞、病毒和致病菌等。Cell-SELEX筛选是一种基于完整细菌细胞为靶物质的筛选方法，将细菌悬浮液通过离心沉淀从而分离出结合和未结合的寡核苷酸分子。近几年，已成功采用Cell-SELEX技术筛选出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等细菌的适配子，基于Cell-SELEX技术筛选病原致病菌、肿瘤细胞等细胞的适配子已经成为当前的研究热点。

本发明以引起肠道传染病的宋内氏志贺氏菌为靶标，采用Cell-SELEX技术筛选出宋内氏志贺氏菌的高特异亲和的适配子，稳定性高、合成方便、易标记功能基团和报告分子，将广泛应用于食品中宋内氏志贺氏菌的快速检测。

发明内容

本发明目的在于提供一种微生物的分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配子技术快速、准确检测宋内氏志贺氏菌的方法。

本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以宋内氏志贺氏菌完整的菌细胞为靶标，筛选获得2条与靶细胞高亲和性特异结合的适配子Sp1、Sp20，可以通过荧光基团标记方法将获得的适配子转为报告适配子，用于食品中宋内氏志贺氏菌的检测，达到快速、准确诊断的目的。

本发明的优点：

(1)与抗体相比，适配子可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。

(2)该组序列是从结构显著、与宋内氏志贺氏菌结合具有不同亲和力的9条适配子序列中选取出的亲和力和特异性均较强的一组适配子序列，能够特异识别宋内氏志贺氏菌。

附图说明

图1是宋内氏志贺氏菌9个适配子家族代表性序列的二级结构图谱。

图2是宋内氏志贺氏菌适配子Sp1、Sp20、Sp22、Sp23亲和力饱和结合曲线。

图3是宋内氏志贺氏菌适配子Sp1、Sp20、Sp22、Sp23的特异性图。

表1是宋内氏志贺氏菌适配子解离常数。

具体实施方式：

下面是通过Cell-SELEX技术筛选高特异亲和的宋内氏志贺氏菌核酸适配子及其快速检出宋内氏志贺氏菌方面的应用。

1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)

随机单链DNA文库：5′-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-N40-GGCAGGTCTACTTTGGGATC-3′，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量达到1014以上；上游引物：5′-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-3′；5′端磷酸化下游引物：5′-(phosphate)-GATCCCAAAGTAGACCTGCC-3′，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃贮存备用。

2、筛选所用宋内氏志贺氏菌的获取与处理

LB液体培养基培养宋内氏志贺氏菌，37℃摇床过夜培养。1.0×10⁸cfu/mL浓度的菌液1mL，在4℃，3500rpm下离心3min，弃上清，用结合缓冲液BB(50nM Tric-HCl，5nMKCl，100nM NaCl，1nM MgCl₂，PH＝7.4)冲洗两次，洗去培养基成分，置4℃环境储存备用。

3、Cell-SELEX技术筛选适配子

第一轮筛选时，反应体系为600μL，取2nmol扩增后的随机ssDNA文库加入BB缓冲液于95℃变性10min，立即0℃冷却10min，再加入处理好的菌细胞离心管内。为降低结合背景，体系中再加入10倍于随机ssDNA文库摩尔数的0.5％BSA溶液和tRNA，于37℃孵育1h。孵育后更换离心管，以除去与离心管壁结合的ssDNA，然后在4℃，5000rpm离心5min，弃上清，去除未结合或结合不紧密的ssDNA。随后用BB结合缓冲液清洗2次，悬于100μL 1×PCR缓冲液中，在95℃变性10min，0℃立即冷却10min，再经4℃，5000rpm离心5min解离下结合的ssDNA，吸取上清即为第一轮筛选所得的ssDNA适配子，并以此为模板进行PCR扩增。

50μL PCR体系包括2μL ssDNA模版，1μL上游引物(20μmol/L)，1μL下游引物(10μmol/L)，1μL dNTP(5mmol/L)，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，5μL 1×PCR Buffer，39.5μL超纯水。热循环参数为94℃变性5min，接着94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，进行19轮循环，然后72℃延伸1min，最后12℃冷却2min。PCR产物采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用Gelred染色后置于紫外光下验证PCR产物dsDNA大小为80bp。最后PCR产物采用酚—氯仿方法提纯。

为获得下一轮筛选ssDNA文库，PCR产物dsDNA采用Lambda核酸外切酶酶切5′端磷酸基团修饰的DNA链。酶切在37℃反应30min，75℃下灭酶10min，再采用8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳验证酶切完全。酚—氯仿方法提纯后的ssDNA用于第二轮筛选的文库。第二轮至第十二轮反应体系为350μL，其中随机ssDNA文库为100pmol。筛选每增加一轮，加入BSA和tRNA溶液的摩尔数增大一倍，直至增大至8倍。为提高筛选适配子的特异性，每三轮采用痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌进行反筛。

4、克隆和测序

将第十二轮筛选得到ssDNA适配子的PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测定，获得30条适配子序列。

5、适配子序列结构分析

采用DNAMAN和RNA Structure 4.6软件分别分析30条序列的同源性信息和二级结构(说明书附图1所示)。结合两种软件分析结果将序列分为9个家族，从每个家族中选出1条结构稳定，能级较低的序列共9条，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5′端标记FAM的适配子，用于亲和力和特异性分析。

6、适配子与宋内氏志贺氏菌亲和力和特异性测定

6.1适配子亲和力分析

将合成的9条适配子用TE缓冲液配稀释配制成10μmol/L溶液，贮存在-20℃下备用。采用BD FACS Calibur流式细胞分析仪分析9条适配子的亲和性。取不同体积的10μmol/L适配子加入500μL BB结合缓冲液中稀释为不同的浓度梯度(10,20,50,75,100,150,200nmol/L)，于95℃变性10min，立即0℃冷却10min。将适配子溶液加入处理好的1×108个宋内氏志贺氏菌细胞中，在37℃下缓慢振荡孵育1h。然后用BB缓冲液清洗，重悬于500μL BB缓冲液后进行流式细胞分析。流式细胞分析中先调节空白样品(未加适配子)的荧光强度，然后在相同参数下测定样品的前向散射、侧向散射和荧光强度。样品的荧光强度百分比表征亲和性大小，利用Sigma Plot 11.0软件计算各适配子的解离常数Kd值如下表1所示，并绘制其饱和结合曲线(说明书附图2所示)。

表1

6.2适配子特异性分析

选取与宋内氏志贺氏菌细胞亲和力较强即Kd值较小的4条适配子进行特异性分析，序列分别为Sp1、Sp20、Sp22、Sp23序列，Kd值分别5.980±0.835，14.32±2.19，4.980±0.357，5.735±0.478nmol/L。将25pmol Sp1、Sp20、Sp22、Sp23适配子溶液分别与宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌在500μLBB缓冲液中于37℃缓慢振荡孵育1h，然后用BB结合缓冲液清洗，重悬于500μL BB缓冲液中，避光混匀后进行流式细胞分析。结果显示(如图3所示)Sp1、Sp20、Sp22、Sp23分别与宋内氏志贺氏菌的结合率都超过80％，但是Sp22、Sp23两条适配子分别在与痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌孵育结合时，结合率也较高，结合率超过40％。相对来说，适配子Sp1、Sp20分别在与痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌孵育后的结合率大大降低，为20％左右，能够高特异结合宋内氏志贺氏菌。因此通过SELEX技术筛选出的宋内氏志贺氏菌的适配子Sp1、Sp20具有高亲和性和高特异性，为宋内氏志贺氏菌快速、准确、灵敏检测提供重要基础，具有广泛的应用前景。

序列表

〈110〉 江南大学

〈120〉 一组特异识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子

〈130〉

〈160〉 1

〈170〉 PatentIn version 3.5

〈210〉 1

〈211〉 80

〈212〉 DNA

〈213〉 人工序列

〈400〉 1

tgagcccaag ccctggtatg ttcttccctt ttattagtcc tgtattcctc

tactgttgcc 60

ggcaggtcta ctttgggatc 80

〈210〉 2

〈211〉 80

〈212〉 DNA

〈213〉 人工序列

〈400〉 2

tgagcccaag ccctggtatg tcgtcgatta ttgtttcagt tcagttcccc

cgcgttccga 60

ggcaggtcta ctttgggatc 80

Claims (2)

1.一组特异性识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子，其特征在于寡核苷酸适配子序列如序列表中序列1，2所示的序列。

2.如权利要求1中所述的寡核苷酸适配子在检测食品中宋内氏志贺氏菌方面的应用。