CN104694646B - 一组特异识别蜡样芽孢杆菌的寡核苷酸适配子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组特异性识别蜡样芽孢杆菌的寡核苷酸适配子Sp15、Sp16，属于食品卫生、临床医学检测领域。针对现有技术中尚无蜡样芽孢杆菌核苷酸适配子的缺陷，本发明通过竞争Cell‑SELEX技术以完整的活性蜡样芽孢杆菌细胞作为靶标对体外合成的随机单链寡核苷酸文库进行筛选、扩增、酶切、测序、亲和力和特异性分析得到的。筛选获得的适配子具有高亲和性和特异性、性质稳定、体外合成方便且成本低等特点，能通过标记功能基团或荧光染料运用于食品和环境中蜡样芽孢杆菌的检测，为现今依赖抗体的检测方法提供了新的选择。

Description

一组特异识别蜡样芽孢杆菌的寡核苷酸适配子

技术领域

本发明涉及食品安全生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选一种与蜡样芽孢杆菌高特异性和高亲和力的寡核苷酸适配子，为该核酸适配子在检测蜡样芽孢杆菌中的应用提供科学依据和理论基础。

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种在自然界分布广泛的食源性致病菌，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和含淀粉较多的各类生熟食品中，已从包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等在内的多种食品中分离出该菌，蜡样芽胞杆菌作为一种食源性致病菌的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，据我国食品污染物和食源性疾病监测网络统计，2003年，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒的4.0％，为细菌性食物中毒的第四位。当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>10⁶个时可导致食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒是该菌产生的肠毒素所致，在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶尔有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。严重者还可导致败血症。因此，建立一种快速、灵敏、准确的蜡样芽孢杆菌检侧方法对保证食品供应链安全和保障人类健康显得尤为重要。

蜡样芽孢杆菌的检测方法包括生物学检测、分子生物检测、免疫学检测等。传统的细菌培养和生化鉴定操作繁琐、耗时；分子生物学检测方法如PCR方法虽然快速、准确，但其影响因素复杂，且易受操作条件的影响，重复性差且无法保证其特异性；免疫学检测具有特异性强、准确、灵敏的特点，但制备特异性抗体的过程复杂，耗时长，制备出的抗体稳定性差，易受温度等环境因素的影响。

适配子是通过SELEX技术从体外合成的随机单链寡核苷酸文库中筛选得到的能够与靶物质特异性结合的一簇小分子单链DNA或RNA序列。SELEX技术(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential Enrichment，指数富集的配体系统进化技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研究核酸结构和功能的有效方法，其基本原理是体外合成一个随机单链寡核苷酸文库与靶物质混合，得到靶物质-寡核苷酸复合物，去除未与靶物质结合的寡核苷酸分子，分离能与靶物质结合的寡核苷酸分子作为模板进行PCR扩增，得到的扩增产物进行下一轮的筛选，通过数轮重复筛选与扩增，富集得到与靶物质高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，即aptamer。如今，适配子已经广泛地应用于如靶标检测、酶抑制，受体调节和药物传递等各种领域。与蛋白类抗体相比，适配子表现出极大的优势，如特异性高，、亲和力强，不依赖动物细胞，不受免疫条件和免疫原性的限制，适配子筛选完全在体外进行，筛选周期短，合成方便且成本低，可以再合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子，适配子变性与复性可逆且速度快，稳定好，受环境条件影响小，可反复使用、长期保存。随着SELEX技术的不断完善进步，适配子已经广泛用于不同的靶标，如小分子物质(有机染料，金属，药物，碳水化合物，氨基酸，核苷酸和肽等)、蛋白质(包括酶、抗体、基因调控因子，以及外源凝集素)、肿瘤细胞、病毒和致病菌等。Cell-SELEX筛选是一种基于完整细菌细胞为靶物质的筛选方法，将细菌悬浮液通过离心沉淀从而分离出结合和未结合的寡核苷酸分子。近几年，已成功采用Cell-SELEX技术筛选出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌等细菌的适配子，基于Cell-SELEX技术筛选病原致病菌、肿瘤细胞等细胞的适配子已经成为当前的研究热点。

本发明以易引起“炒饭综合症”的完整的活性蜡样芽孢杆菌为靶标，采用活Cell-SELEX技术筛选出蜡样芽孢杆菌的高特异性和高亲和性的适配子，稳定性高、合成方便、易标记功能基团和报告分子，将广泛应用于食品安全检测、环境样品中蜡样芽孢杆菌的快速检测。

发明内容

本发明目的在于提供一种微生物的分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配子技术快速、准确检测蜡样芽孢杆菌的方法。

本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以完整的活性蜡样芽孢杆菌细胞为靶标，筛选获得2条与靶细胞高亲和性、高特异结合的适配子Sp15、Sp16，可以通过荧光基团标记方法将获得的适配子转为检测探针，用于环境样品、食品中蜡样芽孢杆菌的检测，达到快速、准确诊断的目的。

本发明的优点：

(1)与抗体相比，适配子可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。

(2)该组序列是从结构显著、与蜡样芽孢杆菌结合具有不同亲和力的8条适配子序列中选取出的亲和力和特异性均较强的一组适配子序列，能够特异识别痢疾志贺氏菌。

附图说明

图1是蜡样芽孢杆菌8个适配子家族代表性序列的二级结构图谱。

图2是蜡样芽孢杆菌适配子Sp7、Sp14、Sp15、Sp16亲和力饱和结合曲线。

图3是蜡样芽孢杆菌适配子Sp7、Sp14、Sp15、Sp16的特异性图。

表1是蜡样芽孢杆菌适配子解离常数。

具体实施方式：

下面是通过cell-selex技术筛选高特异性、高亲和力的蜡样芽孢杆菌核酸适配子及其快速检出蜡样芽孢杆菌方面的应用。

1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)

随机单链DNA文库：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGT GAA-3′，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量达到10¹⁴以上；上游引物：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′；5′端磷酸化下游引物：5′-(phosphate)-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃贮存备用。

2、筛选所用蜡样芽孢杆菌的获取与处理

LB液体培养基培养蜡样芽孢杆菌，30℃摇床过夜培养。1.0×10⁸cfu/mL浓度的蜡样芽孢杆菌菌液1mL，在4℃，4000rpm下离心5min，弃上清，用结合缓冲液BB(50nM Tric-HCl，5nM KCl，100nM NaCl，1nM MgCl₂，PH＝7.4)冲洗两次，洗去培养基成分，置4℃环境储存备用。

3、Cell-SELEX技术筛选适配子

第一轮筛选时，反应体系为600μL，取2nmol扩增后的随机ssDNA文库加入BB缓冲液于95℃变性10min，立即0℃冷却10min，再加入处理好的菌细胞(1×10⁸个)的离心管内。为降低结合背景，体系中再加入10倍于随机ssDNA文库摩尔数的0.5％BSA溶液和tRNA，于37℃缓慢振荡孵育1h。孵育后更换离心管，以除去与离心管壁结合的ssDNA，然后在4℃，5000rpm离心5min，弃上清，去除未结合或结合不紧密的ssDNA。随后用BB结合缓冲液清洗2次，悬于100μL 1×PCR缓冲液中，在95℃变性10min，0℃立即冷却10min，再经4℃，5000rpm离心5min解离下结合的ssDNA，吸取上清即为第一轮筛选所得的ssDNA适配子，并以此为模板进行PCR扩增。

50μL PCR体系包括1μL ssDNA模版，1μL上游引物(20μmol/L)，1μL下游引物(10μmol/L)，0.5μL dNTP(5mmol/L)，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，5μL 1×PCR Buffer，41μL超纯水。热循环参数为94℃变性5min，接着94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，进行20轮循环，然后72℃延伸1min，最后12℃冷却2min。PCR产物采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用Gelred染色后置于紫外光下验证PCR产物dsDNA大小为80bp。最后PCR产物采用酚—氯仿方法提纯。

为获得下一轮筛选ssDNA文库，PCR产物dsDNA采用Lambda核酸外切酶酶切5′端磷酸基团修饰的DNA链。酶切在37℃反应30min，75℃下灭酶10min，再采用8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳验证酶切完全。酚—氯仿方法提纯后的ssDNA用于第二轮筛选的次库。第二轮至第十二轮反应体系为350μL，其中随机ssDNA文库为100pmol。筛选每增加一轮，加入BSA和tRNA溶液的摩尔数增大一倍，直至增大至8倍。为提高筛选适配子的特异性，每隔三轮采用灭活蜡样芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、致泄大肠杆菌进行反筛。

4、克隆和测序

将第十二轮筛选得到ssDNA适配子的PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测定，获得30条适配子序列。

5、适配子序列结构分析

采用DNAMAN和RNA Structure 4.6软件分别分析30条序列的同源性信息和二级结构(说明书附图1所示)。结合两种软件分析结果将序列分为8个家族，从每个家族中选出1条结构稳定，能级较低的序列共8条，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5′端标记FAM的适配子，用于亲和力和特异性分析。

6、适配子与蜡样芽孢杆菌亲和力和特异性测定

6.1适配子亲和力分析

将合成的8条适配子用TE缓冲液配稀释配制成10μmol/L溶液，贮存在-20℃下备用。采用BD FACSCalibur流式细胞分析仪分析8条适配子的亲和性。取不同体积的10μmol/L适配子加入500μL BB结合缓冲液中稀释为不同的浓度梯度(10,20,50,75,100,150,200,250,300nmol/L)，于95℃变性10min，立即0℃冷却10min。将适配子溶液加入处理好的1×10⁸个蜡样芽孢杆菌细胞中，在37℃下缓慢振荡孵育1h。然后4℃，3000rpm，离心5min，弃上清，用BB缓冲液清洗一次，重悬于500μL BB缓冲液后进行流式细胞分析。流式细胞分析中先调节空白样品(未加适配子)的荧光强度，然后在相同参数下测定样品的前向散射、侧向散射和荧光强度。样品的荧光强度百分比表征亲和性大小，利用Sigma Plot 11.0软件计算各适配子的解离常数Kd值如下表1所示，并绘制其饱和结合曲线(说明书附图2所示)。

表1

6.2适配子特异性分析

选取与蜡样芽孢杆菌细胞亲和力较强即Kd值较小的4条适配子进行特异性分析，序列分别为Sp7、Sp14、Sp15、Sp16序列，Kd值分别14.09±4.83，7.27±2.60，5.73±9.03，15.81±1.96nmol/L。将50pmol Sp7、Sp14、Sp15、Sp16适配子溶液分别与灭活蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、致泄大肠杆菌在500μL 1×BB缓冲液中于37℃缓慢振荡孵育1h，然后4℃，3000rpm下离心5min，弃上清，用BB结合缓冲液清洗一次，重悬于500μL BB缓冲液中，避光混匀后进行流式细胞分析。结果显示Sp14、Sp15、Sp16分别与蜡样芽孢杆菌的结合率都超过80％，Sp7与蜡样芽孢杆菌的结合率也超过了70％，但是Sp14与灭活的蜡样芽孢杆菌的结合率高达60％，与金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和地衣芽孢杆菌的结合率分别也达到了30％以上，而且重复性也不是特别好，seq7分别与灭活的蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌的结合率也在30％以上，相对来说，适配子Sp15、Sp16分别在与灭活蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌孵育后的结合率大大降低，均在30％以下，能够高特异结合蜡样芽孢杆菌。因此通过SELEX技术筛选出的蜡样芽孢杆菌的适配子具有高亲和性和高特异性，为蜡样芽孢杆菌快速、准确、灵敏检测提供重要基础，具有广泛的应用前景。

Claims (3)

1.一组特异性识别蜡样芽孢杆菌的寡核苷酸适配子，其特征在于寡核苷酸适配子序列是序列表中序列1，2所示的序列。

2.如权利要求1中所述的寡核苷酸适配子，其特征在于其5′端或3′端可以标记FAM、巯基基团、HEX、FITC、生物素。

3.如权利要求1中所述的寡核苷酸适配子在检测蜡样芽胞杆菌方面的应用。