CN103031305B - 一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用 - Google Patents

一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103031305B
CN103031305B CN201110291363.1A CN201110291363A CN103031305B CN 103031305 B CN103031305 B CN 103031305B CN 201110291363 A CN201110291363 A CN 201110291363A CN 103031305 B CN103031305 B CN 103031305B
Authority
CN
China
Prior art keywords
salmonella typhimurium
aptamer
screening
oligonucleotide
oligonucleotide aptamer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201110291363.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103031305A (zh
Inventor
王周平
段诺
吴世嘉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201110291363.1A priority Critical patent/CN103031305B/zh
Publication of CN103031305A publication Critical patent/CN103031305A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103031305B publication Critical patent/CN103031305B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子是筛选和应用。通过SELEX技术获得了能够特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子，接着利用流式细胞仪对适配子的亲和力和特异性做了分析，得出亲和力最强，特异性最好的识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子。该适配子在准确、快速、灵敏检测食品中鼠伤寒沙门氏菌方面具有广泛的应用前景。

Description

一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用
技术领域
本发明涉及利用SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)筛选获得一种与鼠伤寒沙门氏菌高亲和力、高特异性识别的寡核苷酸适配子，以及该寡核苷酸适配子在鉴别沙门氏菌中的应用，属生物技术领域。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)，属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一。在我国内陆地区，由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，70％--80％是由沙门氏菌引起，世界各地的食物中毒中，英国、中国沙门氏菌食物中毒居首位。目前，在全球范围内，特别是发展中国家感染沙门氏菌的人数逐年增多，食源性致病菌的耐药性对食品安全及人类健康的影响已经引起很多国家的警惕。因此建立准确、灵敏、快速的沙门氏菌检测技术对于食品安全具有重要意义。
传统的微生物检验，往往既耗时又不灵敏；新发展起来的PCR技术，虽然能缩短检验时间，但灵敏度仍然不高；免疫学方法具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的时间比较长，成本高，且不稳定。近些年来，由于寡核苷酸适配子(aptamer)较之抗体有诸多优点：成本低，稳定性好，易于修饰等等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注。SELEX是一种随机生物文库技术，它利用大容量的随机寡核苷酸库(由两端的固定序列和中间20～40个碱基的随机序列组成)与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，如此循环数轮，最终进化成为高亲和力、高特异性的寡核苷酸配体。适配子与靶物质结合的特异性和亲和力可与抗体媲美，甚至优于抗体，加上其技术上和稳定性方面的优势，近10多年来，采用SELEX技术筛选核酸适配子不断被应用于生命科学各个领域的研究工作中，包括对疾病的诊断与治疗。
本发明以常见的鼠伤寒沙门氏菌为目的靶细菌，利用SELEX技术获得了一条能与鼠伤寒沙门氏菌高亲和力，高特异性结合的寡核苷酸适配子，能够快速、灵敏、特异的检测到鼠伤寒沙门氏菌。
发明内容
本发明目的在于提出特异识别鼠伤寒沙门氏菌的一条寡核苷酸适配子的序列以及应用。
本发明优点：
1)与蛋白类抗体相比，aptamer合成周期短，成本低；aptamer更稳定；aptamer可直接体外合成、易于标记，使得操作更为简单迅速。
2)该序列是从9条均能识别鼠伤寒沙门氏菌的aptamer中，选出的亲和力最强，特异性最好的一条aptamer，能高亲和力高特异性识别鼠伤寒沙门氏菌。
附图说明
图1S1-S9二级结构
图2S1-S9解离常数
图3S2的特异性分析图
具体实施方式：
下面是通过SELEX技术筛选特异性结合鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的方法以及快速检出鼠伤寒沙门氏菌的应用。
1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)
随机ssDNA文库：
5’-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’
构建了长度为87nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量在1014以上；引物I：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’；引物II：5’-ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，将随机ssDNA文库和引物用TE缓冲液配制成100μmol/L贮存液-20℃保存备用。
2、BBL液体培养基培养鼠伤寒沙门氏菌，37℃摇床培养至对数生长期(OD600＝0.3)，收集菌液1800g 4℃离心5min，弃上清，用1×结合缓冲液(1×BB)(50mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM KCl，100mM NaCl，1mM MgCl2)清洗，去除多余的培养基成分。
3、SELEX筛选获得鼠伤寒沙门氏菌特异的寡核苷酸适配子
1)将ssDNA文库进行PCR扩增，扩增体系为：step 1：ssDNA 5μL，引物I、II各5μL，含Mg2+的dNTP 5μL，Taq酶0.5μL，10×PCR buffer 5μL，用无菌超纯水补足50μL。①94℃5min，②94℃45s，③50℃45s，④72℃1min，⑤go to②，2times，⑥72℃5min⑦end。所得PCR产物作为step 2模板，step 2：模板1μL，引物I、II各1μL，含Mg2+的dNTP1μL，Taq酶0.5μL，10×PCR buffer 5μL，用无菌超纯水补足50μL。①94℃5min，②94℃45s，③50℃45s，④72℃1min，⑤go to②，30times，⑥72℃5min⑦end。所得产物即作为第一轮筛选的文库。在与菌种孵育之前，需将文库于94℃热变性8min，立即冰浴10min。第一轮筛选的投入量为2nM，第二轮至最后为100pmol。
2)将ssDNA文库，1×108细菌，tRNA和BSA，共600μL室温孵育45min，使ssDNA文库与细菌充分结合。
3)5000g 4℃离心5min弃上清，用1×BB清洗3次，分离并去除未与细菌结合的ssDNA。
4)将沉淀(即结合了ssDNA的细菌)溶于100μL 1×PCR缓冲液中，94℃热变性8min，立即冰浴10min，将结合上的ssDNA从细菌上解离下来。
5)5000g 4℃离心5min取上清，此为第一轮与细菌结合的ssDNA，将其作为模板进行PCR扩增，扩增产物用作第二轮的筛选。
扩增体系为：step 1：ssDNA2μL，引物II5μL，含Mg2+的dNTP 1μL，Taq酶0.5μL，10×PCR buffer 5μL，用无菌超纯水补足50μL。①94℃5min，②94℃45s，③55℃45s，④72℃45s，⑤go to②，2times，⑥72℃1min⑦12℃2min⑧end。所得PCR产物作为Round2模板，step 2：模板1μL，引物I、II各1μL，含Mg2+的dNTP 1μL，Taq酶0.5μL，10×PCR buffer 5μL，用无菌超纯水补足50μL。①94℃5min，②94℃45s，③55℃45s，④72℃45s，⑤go to②，30times，⑥72℃1min⑦12℃2min⑧end。
6)重复筛选：重复上述筛选过程，共进行9轮筛选。
7)富集寡核苷酸适配子文库的测序结果与分析
a.将最后的富集文库扩增为双链，连接pUC19-T载体，转化E.coli DH5α，从90个克隆中随机挑取30个阳性克隆进行DNA序列测定(分别命名为ST1-ST30)。
b.采用DNAMAN软件对30条序列进行同源性分析，RNAstructure软件对30条序列进行高级结构分析。
c.结合软件分析结果，平均在每个家族选出1-2条结构稳定，能级较低的序列为代表，共9条序列，进行亲和力和特异性鉴定。
4、利用流式细胞仪对11条序列进行亲和力鉴定
1)将上述9条序列及原库对照送至上海生物工程有限公司合成并在5’标记FAM。
FAM-ST1：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa TAGAGATATGACAGCGGGGAAGGTTAAGAGGCGCTAG
GAG tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-ST2：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAA
AGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-ST3：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa TTTCGGCTAAGGACGGGTGAAATACATTTAATAGGGT
GGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-ST4：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa GAAGCTTAAGGGGAGGCAACGATGGACATGCGAGGCT
GAA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-ST5：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa AAAGCCTGCTGGCGTGGGACAGAAAAGGTGCCGCGGC
ATT tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-ST6：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa TCTAAATGATGGCAAAGGATTAGTTGAGATCACTGGC
CCT tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-ST7：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa TAAGTACAGGACTGGAGTATTAGCGGGGTCCATGCAA
GGC tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-ST8：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa AAGTCACCGCGCATACTTGCAGCATGACTCTTCTAGT
GGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
FAM-ST9：
5’-ataggagtcacgacgaccagaa AATCAATAGAAGACAAAGTCCGAAACAGGTGTGACGG
TAA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’
2)利用流式细胞仪进一步筛选出鼠伤寒沙门氏菌高亲和力的aptamer。
a.上述9条FAM标记的aptamer及文库分别与1×108细菌室温孵育45min，离心弃上清后，将细胞重溶于300μL 1×BB，上机检测；
b.用GraphPad Prism 5绘制非线性曲线，得出Kd，见图2。
5、利用流式细胞仪进行特异性鉴定
a.根据Kd值的结果，得出与鼠伤寒沙门氏菌亲和力最强的为S2(Kd＝6.33±0.58)，S9(Kd＝11.14±0.12)。下面分别对这两条序列做特异性分析。
b.S2、S9(50nM)分别与鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、阪崎杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌室、副溶血性弧菌和化脓链球菌温孵育45min，离心弃上清后，将细胞重悬于300μL 1×BB，上机检测；
由图2可以得出结论：S2，S9的解离常数相对其他7条较小，说明它们与目标菌种的亲和力强于其他7条序列。
由图3可得出结论：S2与4种菌种结合，流式细胞仪检测的荧光强度曲线可以明显将鼠伤寒沙门氏菌与大肠杆菌、阪崎杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和化脓链球菌分开，且鼠伤寒沙门氏菌的荧光强度峰值右移更加明显，表明S2可特异性识别鼠伤寒沙门氏菌。
Figure ISA00000584660500011
Figure ISA00000584660500021
Figure ISA00000584660500031

Claims (2)

1.一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子，其特征在于：所述寡核苷酸适配子的序列如序列表中序列2所示。
2.权利要求1所述的寡核苷酸适配子在检测食品中鼠伤寒沙门氏菌方面的应用。 
CN201110291363.1A 2011-09-30 2011-09-30 一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用 Active CN103031305B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110291363.1A CN103031305B (zh) 2011-09-30 2011-09-30 一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110291363.1A CN103031305B (zh) 2011-09-30 2011-09-30 一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103031305A CN103031305A (zh) 2013-04-10
CN103031305B true CN103031305B (zh) 2014-02-26

Family

ID=48018706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110291363.1A Active CN103031305B (zh) 2011-09-30 2011-09-30 一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103031305B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103913446A (zh) * 2014-02-28 2014-07-09 江南大学 一种基于染料AccuBlue免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法
CN106834295B (zh) * 2017-03-21 2020-04-24 江南大学 一种特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体及其定向筛选方法
CN112813071B (zh) * 2021-02-06 2022-09-27 江南大学 一种特异性识别利巴韦林的适配体序列及其应用
CN113355330B (zh) * 2021-07-21 2022-04-01 江南大学 特异性识别绿色魏斯氏菌的ssDNA适配体及其筛选方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102010866B (zh) * 2010-09-29 2012-10-31 江南大学 一种特异识别志贺氏菌的寡核苷酸适配子

Also Published As

Publication number Publication date
CN103031305A (zh) 2013-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102453767B (zh) 一种快速定量检测植物乳杆菌st-ⅲ的方法及其试剂盒
CN103031305B (zh) 一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用
CN102127592A (zh) 快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的pcr方法及试剂盒
CN103789435A (zh) 一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法
CN106834295A (zh) 一种特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体及其定向筛选方法
Ding et al. Eubacterial and archaeal community characteristics in the man-made pit mud revealed by combined PCR-DGGE and FISH analyses
CN102010865B (zh) 一种特异识别单核细胞增生李斯特菌的寡核苷酸适配子
Liang et al. Comparison of bacterial community in matured and degenerated pit mud from Chinese Luzhou‐flavour liquor distillery in different regions
Muthaiyan et al. Current perspectives on detection of microbial contamination in bioethanol fermentors
CN103913446A (zh) 一种基于染料AccuBlue免标记适配体传感器检测食源性致病菌的方法
CN102154473B (zh) 一种基因芯片及其在水产病原微生物检测中的应用
CN103436608B (zh) 基于核酸适体的快速检测方法及试剂盒
CN102010866B (zh) 一种特异识别志贺氏菌的寡核苷酸适配子
CN104630230A (zh) 一组特异识别大田软海绵酸的核酸适配体
CN103993104A (zh) 用于检测急性呼吸道传染性疾病的引物群、探针群及其应用方法和试剂盒
CN103031306B (zh) 一种特异性识别副溶血性弧菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用
CN102676664A (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN100569952C (zh) 检测与酿造有关的微生物的方法和可用于此方法的核酸分子
CN104278036B (zh) 一组特异识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子
Zheng et al. Point-of-care detection of 16S rRNA of Staphylococcus aureus based on multiple biotin-labeled DNA probes
CN114566224B (zh) 一种用于鉴别或区分不同海拔人群的模型及其应用
CN107190010B (zh) 一组与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体及其应用
KR101362725B1 (ko) 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도
CN112280878B (zh) 一种检测副溶血性弧菌的特异性靶点、引物、检测方法及应用
CN105331688A (zh) 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 214000 Jiangsu city of Wuxi province through road beam Creek area No. 898 South 7 floor, beam Creek area of food science and Technology Park

Patentee after: Jiangnan University

Address before: No. 1800 road 214122 Jiangsu Lihu Binhu District City of Wuxi Province

Patentee before: Jiangnan University

CP02 Change in the address of a patent holder