CN102618662B - 6种食源性致病菌的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 - Google Patents
6种食源性致病菌的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102618662B CN102618662B CN 201210125861 CN201210125861A CN102618662B CN 102618662 B CN102618662 B CN 102618662B CN 201210125861 CN201210125861 CN 201210125861 CN 201210125861 A CN201210125861 A CN 201210125861A CN 102618662 B CN102618662 B CN 102618662B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- primer
- food
- amplification
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及常见食源性致病菌同步检测方法，特别是涉及一种基于GenomeLabTMGeXP多重基因表达分析技术的致病菌多重PCR快速检测方法，属于生物技术领域。本发明将特异性引物与通用性引物扩增相结合，PCR扩增的前16个循环采用较高的退火温度进行特异性引物的扩增，后16个循环中，通用引物进行大规模的通用性扩增，检测结果采用遗传分析系统的片段分析功能根据核酸片段长度的荧光信号进行自动化读取和分析，可同时实现对较多样品量的检测，有效地避免了普通多重PCR扩增出现的引物间的竞争效应。本发明旨在建立一种快速、高通量、高可靠性、高灵敏度的食源性致病菌的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及常见食源性致病菌同步检测方法，特别是涉及一种基于GenomeLabTM GeXP(GenomeLab eXpress Profiling)多重基因表达分析技术的沙门氏菌(Salmonella sp.)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌(Shigella sp.)、肠出血性大肠杆菌O157: H7(Escherichia coli O157: H7)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)等六种致病菌的多重PCR快速检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
食品安全问题以及相关的食源性疾病已成为公共健康领域中倍受关注的热点。加强食品中致病微生物的检测技术研究具有重要的现实意义，据世界卫生组织(WHO)统计，2005年世界范围内有150万人死于腹泻等疾病，其中有70%为食源性因素造成。在发展中国家情况更为严重，估计每年有2.7亿腹泻及其相关病例，导致240万5岁以下儿童死亡。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、肠出血性大肠杆菌O157: H7是常见污染食品的致病菌，主要通过饮水、食品感染人类，导致细菌性食物中毒。这些致病菌的常规检测需分离培养、生化和血清学鉴定等多个步骤，操作复杂，检测周期长(4～7d)，因此迫切需要发展快速、灵敏和特异的检测方法，对于预防和控制这些疾病的发生和流行至关重要。而基于多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的检测方法具有特异、高效、成本低、速度快等优点，目前已在多种致病微生物的检测中得到了初步的应用，是食源性致病菌快速检测技术的重要发展方向。但普通的多重PCR的多对引物之间存在竞争效应，导致有些目标菌检测灵敏度降低甚至不能被检测。
GeXP多重基因分析技术是一种全新的基因表达谱定量分析平台，是多重PCR领域的突破性技术，它巧妙的将多重PCR技术和毛细管电泳技术相结合，采用通用引物与特异引物相结合的方法，能够有效地避免竞争效应的出现从而实现一次进行多达20个基因的检测，并且可以同时进行较多样品量的检测，通过其毛细管电泳系统对多重PCR反应产物进行高通量的快速分析，从而实现真正的高通量、自动化的检测。GeXP技术的优势在于可在同一样本中对多个基因进行检测，大大提高了反应效率，节约资源和成本，毛细管电泳分析自动化操作也降低了人为操作的误差。近年来有越来越多的研究者对GeXP多重PCR技术的应用进行研究。迄今为止，尚未有成功利用GeXP多重PCR技术鉴定沙门氏菌(Salmonella sp.)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌(Shigella sp.)、肠出血性大肠杆菌O157: H7(Escherichia coli O157: H7)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)等六种致病菌的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的食源性致病菌检测方法的不足，本发明第一个目的是提供一种食源性致病菌检测特异性引物和通用引物，第二个目的是提供一种利用GeXP遗传分析技术和多重PCR技术的快速、高通量且易于观察结果的食源性致病菌检测方法。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
本发明将GeXP多重基因分析技术与多重PCR技术结合，在同一PCR反应体系中加入6对特异性引物和1对荧光标记的通用引物，PCR扩增的前16个循环采用较高的退火温度进行特异性引物的扩增，后16个循环中，通用引物可对特异性引物扩增产物片段进行通用性的扩增，同时扩增出多个长度不同的荧光标记的核酸片段，最后采用毛细血管电泳技术读取技术对多个目的基因进行有效分析，从而有效地避免了普通多重PCR扩增的引物间的竞争效应，提高了检测的灵敏性。
6种食源性致病菌的GeXP多重快速检测用引物，包6对特异性引物，1对阳性对照引物和1对通用引物，它们的核苷酸序列如下：
空肠曲杆菌特异性引物:上游SEQ ID NO1，下游SEQ ID NO2；
金黄色葡萄球菌特异性引物：上游SEQ ID NO3，下游SEQ ID NO4；
肠出血性大肠杆菌O157: H7特异性引物：上游SEQ ID NO5，下游SEQ ID NO6；
志贺氏菌特异性引物：上游SEQ ID NO7，下游SEQ ID NO8；
沙门氏菌特异性引物：上游SEQ ID NO9，下游SEQ ID NO10；
单核细胞增生李斯特氏菌特异性引物：上游SEQ ID NO11，下游SEQ ID NO12；
阳性对照引物：上游SEQ ID NO13，下游SEQ ID NO14；
通用引物：上游SEQ ID NO15，下游SEQ ID NO16。
进一步，在上述SEQ ID NO15的5’端用cy5荧光标记。
上述引物用于食源性致病菌的GeXP多重快速检测方法,包括如下步骤：
1）DNA提取
选用相应的商品化的细菌DNA提取试剂盒，提取致病菌DNA，获得待测DNA模板。所述致病菌包括空肠曲杆菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌O157: H7、志贺氏菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌。
2）GeXP多重PCR检测体系的构建
GeXP多重PCR检测体系含6对细菌特异性引物、1对阳性对照引物和1对通用性引物，能在一个反应管中对6类食源性致病菌中任意一类进行区分和检测。
GeXP多重PCR检测体系中每20μL反应体系包含：0.1mM的SEQ ID NO9～SEQ ID NO12各0.2μL，0.1mM的SEQ ID NO1～SEQ ID NO8和SEQ ID NO13、SEQ ID NO14各0.1μL，1.0mM的SEQ ID NO15和SEQ ID NO16各1. 0μL，10×PCR buffer 缓冲液2.0μL，25 mM的Mg2+ 2.0μL，10 mM 的dNTP 1.0μL，5U/μL的 Taq DNA聚合酶0.6μL，待测DNA模板1.0μL，pMD19质粒0.3μL，9.3μL灭菌去离子水。
反应程序为94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 30s，16个循环；94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 30s，16个循环。
3）PCR产物片段分析
首先将PCR产物用10mM的Tris-HCl稀释5倍待用，然后在每个样品管中加入甲酰胺38.5μL和DNA分子量标准品-400 0.5μL，震荡混匀，离心除去气泡并滴加矿物油之后加入分离缓冲液250μL，利用GeXP多重基因分析系统的片段分析程序进行分析。
4）结果判定
若出现217bp的阳性对照峰和相应PCR产物片段长度的产物峰则与该产物峰对应的致病菌检测结果为阳性，若出现217bp的阳性对照峰但未出现相应PCR产物片段长度的产物峰则为阴性。
6种目标菌相应的核酸片段长度为：单核细胞增生李斯特氏菌—156bp、肠出血性大肠杆菌O157: H7—242bp、志贺氏菌—256bp、金黄色葡萄球菌—269bp、空肠弯曲杆菌—316bp、沙门氏菌—320bp，阳性对照—217bp。
GeXP多重PCR检测体系的验证
验证采用18株菌株样本，将试验菌株经增菌培养后，用GeXP多重PCR检测体系进行检测，以验证所建体系的特异性。所述18株菌株样本包括肠炎沙门氏菌（ATCC13076）、鼠伤寒沙门氏菌（50115）、乌里地沙门氏菌（实验室分离）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）、单核细胞增生李斯特氏菌（54003）、英诺克李斯特氏菌（实验室分离）、大肠杆菌O157:H7（NCTC12900）、大肠杆菌O157:H7（51924）、大肠杆菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、金黄色葡萄球菌（26003）、表皮葡萄球菌（ATCC12228）、空肠弯曲杆菌（ATCC33291）、福氏志贺氏菌（ATCC12022）、鲍氏志贺氏菌（51523）、乙型溶血性链球菌（32210）、阪崎肠杆菌（ATCC51329）、肺炎克雷伯氏菌（ATCC700603）。
GeXP多重PCR检测技术的原理是：分别根据6种致病菌基因的保守区域设计了6对特异性引物，其中特异性引物一端包含可与通用性引物结合的通用序列，退火温度为65℃左右。通用性引物是一段非生物来源的核苷酸编码序列，上游引物5’端用cy5荧光进行标记，退火温度为50℃左右。本发明以样本DNA为模板，在同一PCR反应体系中加入6对特异性引物和1对荧光标记的通用性引物（通用引物浓度为特异性引物浓度的20倍以上），PCR扩增的前16个循环采用较高的退火温度进行特异性引物的扩增，后16个循环中，通用引物可对特异性引物扩增产物片段进行通用性的扩增，同时扩增出多个长度不同的荧光标记的核酸片段，最后采用毛细管电泳读取技术对多个目的基因进行有效分析，从而有效地避免了普通多重PCR引物间的竞争效应，提高了检测的灵敏性。相比普通凝胶电泳，毛细管电泳系统对多重PCR反应产物进行分析有着操作简便、快速、准确的优点，能够对长度相差仅数个bp的核酸片段进行区分，并且可以同时实现对较多样品量的检测，从而实现真正的高通量、自动化的检测。
本发明的优点是：（1）高特异性：分别根据6种致病菌基因的保守区域分别设计6对特异性引物，引物特异性高，并且通用性引物的序列设计来自于一段非生物源性的核苷酸序列，避免了非特异性产物的通用性扩增；（2）灵敏度高：扩增模板仅需10ng或更少，检测结果可靠性达98%，PCR反应体系中加入6对特异性引物和1对荧光标记的通用引物，通用引物可对特异性引物扩增产物片段进行通用性的扩增，从而有效地避免了普通多重PCR扩增的引物间的竞争效应，提高检测灵敏度；（3）避免假阳性和假阴性：检测体系中加入阳性对照及阴性空白对照，能够有效避免假阳性和假阴性现象的出现。（4）鉴定自动化、操作简便，结果的可靠性、灵敏度高：采用毛细管电泳读取技术根据核酸片段长度的荧光信号进行自动化读取和分析，能够对长度相差仅数个bp的核酸片段进行区分，且可同时实现对较多样品量的检测；（5）快速、高效扩增：检测时间3个小时左右，可同时实现对较多样品量的检测；（7）用途广：可广泛用于食品中致病菌的安全快速检测。
附图说明
图1为阳性对照效果示意图；
图2为空白对照效果示意图；
图3为6种致病菌检测效果示意图；
图中，主峰（信号值＞50000）从左到右依次为单核细胞增生李斯特氏菌（156bp）、pMD19质粒阳性对照（217bp）、肠出血性大肠杆菌O157: H7（242bp）、志贺氏菌（256bp）、金黄色葡萄球菌（269bp）、空肠弯曲杆菌（316bp）、沙门氏菌（320bp）。
具体实施方式
采用的仪器设备参见下表1。
表1
| 仪器名称（规格） | 生产厂商 |
| GeXP多重基因表达分析系统 | 美国Beckman Coulter公司 |
| 梯度PCR仪（Veriti 96） | 美国Applied Biosystems公司 |
| 智能微生物培养气体工作站（Mark 2） | 荷兰Mart公司 |
| 台式高速冷冻离心机（SIGMA 3K15） | 美国SIGMA公司 |
| 小型台式高速离心机（Centrifuge 5417R） | 德国Eppendorf公司 |
| 全自动凝胶成像系统（BIO-BEST 200E） | 美国SIM公司 |
| 电泳仪 | 美国Bio-Rad公司 |
| 紫外分光光度计（BIOMATE 3） | 美国Thermo公司 |
甲酰胺溶液（Sample Load Solution）、分离缓冲液（Separation Buffer）、分离胶（Separation Gel）均购自美国Beckman公司，Fraser肉汤购自法国BIOMERIEUX公司，布氏肉汤购自英国OXIOD公司，营养肉汤、营养琼脂、10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤均购自北京陆桥技术责任有限公司。
实施例1，引物的设计
6种食源性致病菌GeXP多重PCR检测用引物为一套食源性致病菌的引物组，每种致病菌引物组由两对引物组成，一对为特异性引物，另一对为通用引物，通用引物的序列相同且上游引物5’端用cy5荧光进行标记，各特异性引物均含有能与通用引物相结合的序列。
1）通用引物的设计及合成
通用性引物是一段非生物来源的核苷酸编码序列，上游引物5’端用cy5荧光进行标记。通用性引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成。
2）特异性引物的设计及特异性验证
选择沙门氏菌的DNA解旋酶B亚基基因（gyrB）、单核细胞增生李斯特氏菌的DNA解旋酶B亚基基因（gyrB）、金黄色葡萄球菌的血浆凝固酶前体基因（coa）、肠出血性大肠杆菌O157: H7的脂多糖基因（rfbE）、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、空肠弯曲杆菌的dnaA基因、pMD19质粒作为目的基因，用GeXP Express引物设计分析软件分别设计各特异性PCR引物，经过 GenBank的BLAST程序对各引物及扩增产物同源性进行比对，引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司和宝生物工程（大连）有限公司合成。引物序列及产物大小见表2
表2
表中带下划线的碱基序列为与通用引物序列结合的序列.
通用引物是一段非生物来源的核苷酸编码序列，上游引物(SEQ ID NO15)的5’ 端用cy5荧光进行标记，序列见表3。
表3
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 退火温度 |
| SEQ ID NO15 | AGGTGACACTATAGAATA | 48℃ |
| SEQ ID NO16 | GTACGACTCACTATAGGGA | 56℃ |
从肠炎沙门氏菌（ATCC13076）、鼠伤寒沙门氏菌（50115）、乌里地沙门氏菌（实验室分离）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）、单核细胞增生李斯特氏菌（54003）、英诺克李斯特氏菌（实验室分离）、大肠杆菌O157:H7（NCTC12900）、大肠杆菌O157:H7（51924）、大肠杆菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、金黄色葡萄球菌（26003）、表皮葡萄球菌（ATCC12228）、空肠弯曲杆菌（ATCC33291）、福氏志贺氏菌（ATCC12022）、鲍氏志贺氏菌（51523）、乙型溶血性链球菌（32210）、阪崎肠杆菌（ATCC51329）、肺炎克雷伯氏菌（ATCC700603）中提取DNA进行单重PCR扩增以验证引物特异性，排除有非特异性扩增的引物。
实施例2，食源性致病菌GeXP多重PCR检测方法
1）菌株培养
金黄色葡萄球菌可采用10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤等培养，单核细胞增生李斯特菌可采用Fraser肉汤等培养，空肠弯曲杆菌可采用布氏肉汤等培养，其他细菌一般可通过营养肉汤或营养琼脂等培养，空肠弯曲杆菌需在微需氧42℃±1℃条件下培养36h，其它菌株需在37℃±1℃条件下培养18h。
2）DNA提取
采用细菌DNA提取商品化试剂盒（OMEGA Bacterial DNA Kit(200)）提取菌株样本DNA。具体步骤如下：取培养的1mL菌液离心获得菌体，或从营养琼脂平板上获得菌苔。按照试剂盒说明书规定步骤进行操作。获得待检DNA模板。
3）对照品的制备
用市售商品化pMD19质粒转化至JM109感受态细胞，抗性筛选，摇菌，PCR鉴定阳性者，用质粒提取试剂盒提取质粒作为阳性对照品，浓度控制在20～100ng/μL。以无菌去离子水作为阴性对照品。
4) GeXP单重PCR检测体系的构建
GeXP单重PCR检测体系采用20μL反应体系，包含细菌特异性引物SEQ ID NO1～SEQ ID NO12（0.1 mM）各0.3 μL，阳性对照引物SEQ ID NO13和SEQ ID NO14（0.1 mM）各0.3 μL，通用引物SEQ ID NO15和SEQ ID NO16（1.0 mM）各1.0 μL，10×PCR buffer 缓冲液2.0 μL，Mg2+（25 mM）2.0 μL，dNTP（10 mM） 1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5 μL，待检DNA模板1.0μL，pMD19质粒0.5μL，灭菌去离子水9.8μL。PCR程序为94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 30s，16个循环；94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 30s，16个循环。
5）GeXP多重PCR检测体系的建立
通过GeXP单重PCR检测体系一系列的优化步骤，最终建立了GeXP多重PCR检测体系。该体系含1对荧光标记的通用性引物和7对特异性引物，能在单管中对6类食源性致病菌的任意一类进行区分和检测。
最终确立的GeXP多重PCR检测体系采用20μL反应体系，包含特异性引物SEQ ID NO9～SEQ ID NO12（0.1 mM）各0.2 μL，SEQ ID NO1～SEQ ID NO8和SEQ ID NO13、SEQ ID NO14（0.1 mM）各0.1 μL，通用引物SEQ ID NO15和SEQ ID NO16（1.0 mM）各1.0 μL，10×PCR buffer缓冲液（500mM KCl，100mM Tris-HCl，pH8.5）2.0 μL，Mg2+（25 mM）2.0 μL，dNTP（10 mM）1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.6 μL，待测DNA模板1.0μL，pMD19质粒0.3μL，9.3μL灭菌去离子水。反应程序为94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 30s，16个循环；94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 30s，16个循环。
6）产物毛细管电泳分析
1、准备10mM Tris-HCl (Tris-HCl（1M，pH8.0)：去核酸水=1：99（V/V）)。
2、稀释PCR产物，所需试剂及使用量见表4。
表4
| 试剂 | 使用量 |
| 10mM Tris-HCl pH8.0 | 8μL |
| PCR反应产物 | 2μL |
| Total | 10μL |
注：可再加入Tris-HCl（10mM，pH8.0）以优化预稀释样品的浓度。
3、配制上样体系（40μL），所需试剂及使用量见表5。
表5
| 试剂 | 使用量 |
| 甲酰胺（SLS） | 38.5μL |
| DNA分子量标准品-400 | 0.5μL |
| 稀释的PCR产物 | 1μL |
| Total | 40μL |
4、震荡混匀，离心以去除气泡。
5、每孔加一滴矿物油。
6、配制缓冲体系。对应上样板加样的孔在缓冲液板上每孔加入3/4体积的分离缓冲液（Separation Buffer）。
7、GeXP多重基因分析系统运用片段分析程序进行分析。
PCR产物要避光放置。短期保存放置4℃冰箱。
7）结果判定
参见附图，结果示意图中包含主峰和数个很小的杂峰，主峰（信号值＞50000）为6种菌的特异性扩增产物和阳性对照扩增产物，当所检测的六种致病菌菌均为阳性结果时图中出现7个主峰，从左到右依次为单核细胞增生李斯特氏菌（156bp）、pMD19质粒阳性对照（217bp）、肠出血性大肠杆菌O157: H7（242bp）、志贺氏菌（256bp）、金黄色葡萄球菌（269bp）、空肠弯曲杆菌（316bp）、沙门氏菌（320bp）。当使用不同浓度的核酸模板扩增时，各个菌所代表的峰面积有所变化，但各个主峰大都呈现在相同位置。
8）GeXP多重PCR方法检测18株菌株
对18株菌株（包括标准菌株和从检测样品中分离的菌株）进行检测以验证所建体系的特异性。所述18株菌株样本包括肠炎沙门氏菌（ATCC13076）、鼠伤寒沙门氏菌（50115）、乌里地沙门氏菌（实验室分离）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC7644）、单核细胞增生李斯特氏菌（54003）、英诺克李斯特氏菌（实验室分离）、大肠杆菌O157:H7（NCTC12900）、大肠杆菌O157:H7（51924）、大肠杆菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、金黄色葡萄球菌（26003）、表皮葡萄球菌（ATCC12228）、空肠弯曲杆菌（ATCC33291）、福氏志贺氏菌（ATCC12022）、鲍氏志贺氏菌（51523）、乙型溶血性链球菌（32210）阪崎肠杆菌（ATCC51329）、肺炎克雷伯氏菌（ATCC700603）。
9）废弃物处理
依照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。
以下对上述结果作进一步的讨论。
1. GeXP多重PCR检测技术的原理。
本发明分别根据6种致病菌基因的保守区域设计了6对特异性引物，其中特异性引物一端包含可与通用性引物结合的通用序列，退火温度为65℃左右。通用性引物是一段非生物来源的核苷酸编码序列，上游引物5’端用cy5荧光进行标记，退火温度为50℃左右。本发明以样本DNA为模板，在同一PCR反应体系中加入6对特异性引物和1对荧光标记的通用性引物（通用引物浓度为特异性引物浓度的20倍以上），PCR扩增的前16个循环采用较高的退火温度进行特异性引物的扩增，后16个循环中，通用引物可对特异性引物扩增产物片段进行通用性的扩增，同时扩增出多个长度不同的荧光标记的核酸片段，最后采用毛细管电泳读取技术对多个目的基因进行有效分析，从而有效地避免了普通多重PCR引物间的竞争效应，提高了检测的灵敏性。相比普通凝胶电泳，毛细管电泳系统对多重PCR反应产物进行分析有着操作简便、快速、准确的优点，能够对长度相差仅数个bp的核酸片段进行区分，并且可以同时实现对较多样品量的检测，从而实现真正的高通量、自动化的检测。
本实施例中，为确保检测结果的准确性加入了阳性对照以及阴性空白对照，能够有效避免普通PCR假阳性和假阴性现象的出现。
2. GeXP多重PCR检测体系的建立。
GeXP多重PCR检测体系的建立，主要包括两方面的挑战：1、多重引物间存在竞争效应，导致某类致病菌峰值很小甚至检测不出；2、特异性引物与通用性引物退火温度有一定差别。因此优化的重点主要集中在优化多重引物的扩增及优化PCR程序。具体涉及各特异性引物浓度和比例，通用引物浓度，Taq酶浓度，PCR程序设置等方面。为提高引物扩增效率，采用特异性引物扩增和通用性引物扩增相分离的方法，在高温（60℃）进行特异性引物退火扩增16个循环，在低温（52℃）进行通用性引物退火扩增16个循环。实验结果表明这种方法具有良好的效果，最终构建的体系检测相应目标菌的典型结果如图所示。
3. GeXP多重PCR检测体系检测18株菌株样本
利用上述建立的GeXP多重PCR检测体系检测18株分离株及标准株，结果显示对所检测的6种常见食源性致病菌，该体系均能进行准确区分和检测。检测结果见表6。
表6
| 试验菌株 | 菌株来源或菌株号 | 检测结果 | 试验菌株 | 菌株来源或菌株号 | 检测结果 |
| 肠炎沙门氏菌 | ATCC13076 | + | 大肠杆菌 | ATCC8739 | - |
| 鼠伤寒沙门氏菌 | 50115 | + | 空肠弯曲杆菌 | ATCC33291 | + |
| 乌里地沙门氏菌 | 实验室分离鉴定 | + | 金黄色葡萄球菌 | ATCC6538 | + |
| 单核细胞增生李斯特氏菌 | ATCC7644 | + | 金黄色葡萄球菌 | 26003 | + |
| 单核细胞增生李斯特氏菌 | 54003 | + | 表皮葡萄球菌 | ATCC12228 | - |
| 英诺克李斯特氏菌 | 实验室分离鉴定 | - | 福氏志贺氏菌 | ATCC12022 | + |
| 大肠杆菌O157:H7 | NCTC12900 | + | 鲍氏志贺氏菌 | 51523 | + |
| 大肠杆菌O157:H7 | 51924 | + | 乙型溶血性链球菌 | 32210 | - |
| 阪崎肠杆菌 | ATCC51329 | - | 肺炎克雷伯氏菌 | ATCC700603 | - |
从表中可以看出，该检测方法对于常见食源性致病菌的检测有较好的特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心；肖进文
<120> 6种食源性致病菌GeXP多重快速检测用引物和检测方法
<160> 16
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO1
aggtgacact atagaataat cagca(a/g)ggtt taatggcg 38
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO2
gtacgactca ctatagggaa cccgcactat catagccac 39
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO3
aggtgacact atagaataga aacaagagaa gc(g/a)gttgc 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO4
gtacgactca ctatagggat gtaattgtgc cctgtggaa 39
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO5
aggtgacact atagaatatg aaggtggaat ggttgtca 38
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO6
gtacgactca ctatagggat cagc(a/g)atttc acgttttcg 39
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO7
aggtgacact atagaataat taac(c/a)tcttc gccggact 38
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO8
gtacgactca ctatagggag cagagacggt atcggaaag 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO9
aggtgacact atagaatagt gaaattatcg ccacgttcg 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO10
gtacgactca ctatagggat catcgcaccg tcaaaggaa 39
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO11
aggtgacact atagaatagg atacaaccat gaatccgg 38
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO12
gtacgactca ctatagggaa tttacgacga ggttccacg 39
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO13
aggtgacact atagaatatc acgctgtagg tatctcag 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO14
gtacgactca ctatagggac gctctgctaa tcctgtta 38
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO15
aggtgacact atagaata 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO16
gtacgactca ctataggga 19
Claims (1)
1. 6种食源性致病菌的GeXP多重快速检测用引物组，所述6种食源性致病菌为空肠曲杆菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌O157: H7、志贺氏菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：包括6对特异性引物，1对阳性对照引物和1对通用引物，它们的核苷酸序列如下：
空肠曲杆菌特异性引物:上游SEQ ID NO:1，下游SEQ ID NO:2；
金黄色葡萄球菌特异性引物：上游SEQ ID NO:3，下游SEQ ID NO:4；
肠出血性大肠杆菌O157: H7特异性引物：上游SEQ ID NO:5，下游SEQ ID NO:6；
志贺氏菌特异性引物：上游SEQ ID NO:7，下游SEQ ID NO:8；
沙门氏菌特异性引物：上游SEQ ID NO:9，下游SEQ ID NO:10；
单核增生李斯特菌特异性引物：上游SEQ ID NO:11，下游SEQ ID NO:12；
阳性对照引物：上游SEQ ID NO:13，下游SEQ ID NO:14；
通用引物：上游SEQ ID NO:15，下游SEQ ID NO:16；
所述通用引物上游SEQ ID NO:15的5’端用cy5荧光标记。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210125861 CN102618662B (zh) | 2012-04-26 | 2012-04-26 | 6种食源性致病菌的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210125861 CN102618662B (zh) | 2012-04-26 | 2012-04-26 | 6种食源性致病菌的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102618662A CN102618662A (zh) | 2012-08-01 |
| CN102618662B true CN102618662B (zh) | 2013-11-06 |
Family
ID=46558865
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210125861 Expired - Fee Related CN102618662B (zh) | 2012-04-26 | 2012-04-26 | 6种食源性致病菌的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102618662B (zh) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102994648B (zh) * | 2012-06-21 | 2015-04-08 | 宁波海尔施基因科技有限公司 | 一种基于毛细电泳的呼吸道病毒的多重基因检测方法 |
| CN102899424B (zh) * | 2012-10-23 | 2014-01-15 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒 |
| CN102899423B (zh) * | 2012-10-23 | 2014-04-16 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 同时鉴别6种鸡呼吸道病病毒的GeXP快速检测试剂盒 |
| CN103074452B (zh) * | 2013-01-25 | 2014-04-23 | 海尔施生物医药股份有限公司 | 一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法 |
| CN103074449B (zh) * | 2013-01-25 | 2014-04-23 | 海尔施生物医药股份有限公司 | 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法 |
| CN103074451B (zh) * | 2013-01-25 | 2014-04-23 | 海尔施生物医药股份有限公司 | 一种同步检测二十二种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法 |
| ES2971094T3 (es) | 2015-04-07 | 2024-06-03 | Polyskope Labs | Detección de uno o más patógenos |
| CN105567868B (zh) * | 2015-11-17 | 2021-06-25 | 天津海关动植物与食品检测中心 | 用于检测赤羽病毒、牛病毒性腹泻病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 |
| CN105441539A (zh) * | 2015-12-03 | 2016-03-30 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种同时检测12种腹泻病原菌的试剂盒及其应用 |
| CN105525031B (zh) * | 2016-03-08 | 2018-12-11 | 南京美宁康诚生物科技有限公司 | 11种肠道致病菌核酸多重pcr检测试剂盒及其应用 |
| CN106755553B (zh) * | 2017-03-21 | 2020-04-10 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 鉴定或辅助鉴定食源性致病菌的GeXP多重PCR方法的成套试剂与应用 |
| CN107502672B (zh) * | 2017-10-12 | 2020-12-04 | 山东艾克韦生物技术有限公司 | 同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其应用 |
| CN112760413A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-07 | 苏州大学 | 公共引物介导的多重定量pcr检测技术在转基因大豆检测中的应用 |
| CN115725749A (zh) * | 2022-11-17 | 2023-03-03 | 广州艾基生物技术有限公司 | 小鼠源细胞str检测试剂盒、方法及应用 |
-
2012
- 2012-04-26 CN CN 201210125861 patent/CN102618662B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Biao suo ect.al.Development of an oligoucleotide-based microarray to detect multiple foodborne pathogens.《Molecular cellular probes》.2010,77-86. |
| Detectuion and identification of bacterial entropathogens by polymerase chain reaction and conventional techniques in childhood acute gastroenteritis in Gaza,Palestine;Farid H.Abu Elamreen;《International journal of infectious disease》;20071130;501-507 * |
| Development of an oligoucleotide-based microarray to detect multiple foodborne pathogens;Biao suo ect.al;《Molecular cellular probes》;20100430;77-86 * |
| FaridH.AbuElamreen.DetectuionandidentificationofbacterialentropathogensbypolymerasechainreactionandconventionaltechniquesinchildhoodacutegastroenteritisinGaza Palestine.《International journal of infectious disease》.2007 |
| 刘金华等.几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评述.《吉林大学学报（医学版）》.2012,382-385. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102618662A (zh) | 2012-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102618662B (zh) | 6种食源性致病菌的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 | |
| CN102127592B (zh) | 快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的pcr方法及试剂盒 | |
| CN103966353B (zh) | 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物 | |
| CN103898208A (zh) | 一种快速高通量的肠源致病菌检测方法 | |
| CN106434917A (zh) | 一种金黄色葡萄球菌的lamp引物组及检测试剂盒与使用方法 | |
| CN104450940B (zh) | 一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒 | |
| CN102363815B (zh) | 运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法 | |
| CN109735638B (zh) | 鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌st121的多重pcr检测引物、试剂盒、方法及应用 | |
| CN102154497B (zh) | 食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法 | |
| CN102703588A (zh) | 基于多重pcr的水中13种病原微生物同步快速检测方法 | |
| US20220098645A1 (en) | Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method | |
| CN107746890A (zh) | 鉴定单增李斯特菌血清型的多重pcr检测引物及方法 | |
| CN111154900B (zh) | 铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 | |
| CN102304573B (zh) | 一种用于细菌诊断的核苷酸序列及应用 | |
| CN102676664A (zh) | 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法 | |
| CN112725480B (zh) | 一种利用lamp技术快速检测伤寒沙门氏菌的引物组、检测方法、试剂盒 | |
| CN104342496B (zh) | 一种快速检测、鉴定李斯特属细菌的方法 | |
| CN102220427B (zh) | 四种食源性致病菌多重pcr检测法及检测引物组和试剂盒 | |
| CN101492741A (zh) | 一种定量检测猪肺炎支原体的方法 | |
| CN113528687A (zh) | 一种利用lamp技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用 | |
| CN103436623A (zh) | 一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法 | |
| CN113957164B (zh) | 一种婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌属的CRISPR One Pot检测方法及其试剂盒 | |
| CN107723348A (zh) | 鉴定单增李斯特菌1/2c血清型的NASBA检测方法 | |
| CN111020040B (zh) | 乳制品中致病菌多重荧光定量pcr检测引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN104278036B (zh) | 一组特异识别宋内氏志贺氏菌的寡核苷酸适配子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131106 Termination date: 20140426 |