CN106480185A - 富产胞外多糖的嗜热链球菌的快速筛选方法及实现所述方法的联合基因核酸序列 - Google Patents

富产胞外多糖的嗜热链球菌的快速筛选方法及实现所述方法的联合基因核酸序列 Download PDF

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Abstract

本发明提供含有嗜热链球菌的功能基因epsA、epsC和epsD的联合基因核酸序列在筛选富产胞外多糖的嗜热链球菌中的应用。本发明还提供一种富产胞外多糖的嗜热链球菌的快速筛选方法，包括(1)提取待筛选菌株基因组DNA；(2)构建待筛选菌株的联合基因核酸序列；(3)采用MEGA6.0软件中的Clustal W比对方法，将所得联合基因核酸序列与如SEQ No.1的序列进行比对，构建系统发育树；(4)将发育树表现为与嗜热链球菌ND03为同一分支的菌株鉴定为富产胞外多糖的嗜热链球菌，将处于发育树另一分支的菌株鉴定为低产胞外多糖的嗜热链球菌，所得结果与根据现有技术得到的筛选结果完全一致。

Description

富产胞外多糖的嗜热链球菌的快速筛选方法及实现所述方法 的联合基因核酸序列
【技术领域】
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种快速筛选富产胞外多糖的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的方法，以及实现所述方法的联合基因核酸序列、其构建方法及应用。
【背景技术】
胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是一些微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外环境中的一种水溶性高分子多糖，属于微生物的次级代谢产物。近几十年来，微生物胞外多糖由于在产品结构、性能及生产方面所具有的独特优势而得到大力研究和开发，新的微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。
在众多产胞外多糖的微生物中，乳酸菌成为了产胞外多糖研究的重点。由于乳酸菌是食品级工业生产菌，安全性高，而且乳酸菌生长极为迅速，它的胞外多糖提取工艺更简单，价格便宜、比其它微生物多糖更适用于人类，所以近年来对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多。乳酸菌胞外多糖可赋予发酵乳制品特殊的质构和风味，起到安全的食品添加剂的作用，它还有可能成为食品级多糖的一个良好来源而广泛用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及持水。目前，乳酸菌胞外多糖已作为稳定剂、增稠剂被用于酸奶、奶酪等发酵奶制品的生产中。此外，胞外多糖还具有降低胆固醇、抗氧化、抗肿瘤、对消化道的调节等作用。
尽管产细菌胞外多糖的菌种繁多，但真正具有实际应用价值并可以工业化生产的并不多。目前用于生产胞外多糖的菌种主要有乳酸杆菌属(Lactobacillus)和链球菌属(Streptococcus)。其中，嗜热链球菌作为重要的产胞外多糖菌种被广泛研究。然而，并非所有嗜热链球菌菌株都可以用于工业化生产胞外多糖，不同嗜热链球菌菌株产胞外多糖的能力差异很大。传统筛选富产胞外多糖菌株的方法多依赖于菌株培养，耗时耗力，且效率较低。因此，建立一种高效的富产胞外多糖嗜热链球菌的筛选方法显得尤为重要。
研究发现，嗜热链球菌产胞外多糖的能力与其基因组中含有胞外多糖合成相关的基因簇的基因型存在显著相关性。《嗜热链球菌胞外多糖的结构生物合成与遗传调控》(范丽平等人)发现嗜热链球菌Sfi39染色体上有一段20kb的与胞外多糖合成相关的基因簇，并证实其中的基因epsA、epsB是调控序列，epsC与胞外多糖的聚合有关，epsD与胞外多糖的跨膜转运有关，epsE和epsG两个基因参与了胞外多糖的生物合成。令人疑惑的是在不产胞外多糖的菌株中也发现了这样的基因。此外，在基因簇中还存在有很多功能未知基因。
由此可以看出，尽管已经有很多关于嗜热链球菌胞外多糖合成相关基因的研究，但目前尚未有明确的结论表明富产胞外多糖的嗜热链球菌取决于哪些基因，也缺少通过生物工程方法借助基因信息快速、准确筛选富产胞外多糖的嗜热链球菌的方法。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种富产胞外多糖的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的快速筛选方法，以及实现该方法的联合基因核酸序列、其构建方法及应用。
本发明的思路是以嗜热链球菌的代谢途径为依据，从大量参与胞外多糖合成的基因中选取特定的epsA、epsC和epsD基因为靶点，通过设计引物、PCR扩增获得含有epsA、epsC和epsD基因片段的联合序列，并通过测序、构建系统发育关系实现富产胞外多糖的嗜热链球菌的快速筛选。
在与嗜热链球菌胞外多糖合成相关的大量功能基因中，本发明通过实验验证其中的epsA、epsC和epsD基因是合成胞外多糖的关键基因，并验证了嗜热链球菌胞外多糖合成能力与epsA、epsC和epsD基因序列型具有显著的相关性。
为此，本发明提供含有嗜热链球菌的功能基因epsA、epsC和epsD的联合基因核酸序列在筛选富产胞外多糖的嗜热链球菌中的应用。
作为用于筛选富产胞外多糖的比对序列，本发明提供如SEQ No.1所示的联合基因核酸序列。该序列是由嗜热链球菌Streptococcus thermophilus ND03的epsA、epsC和epsD基因的部分核酸序列构成。
上述联合基因核酸序列的构建方法包括以下步骤：
(1)根据嗜热链球菌基因组的功能基因epsA、epsC和epsD设计特异性扩增引物；
(2)利用步骤(1)的引物通过PCR扩增模板DNA，所述模板DNA为嗜热链球菌基因组DNA，扩增体系为：
模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM1.5μL，Taq DNA聚合酶5U/μL 0.5μL，ddH2O补足至50μL；
扩增条件为：
95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，47℃退火45s，72℃延伸1min，然后65℃延伸10min，4℃保存；
(3)核苷酸序列测定
扩增产物分别按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序；
(4)拼接序列
将测序所得的序列导入软件DNAstar的Seqman模块中，结合序列峰图进行序列比对拼接及单碱基校对，连接得到所述联合基因核酸序列。
优选地，步骤(1)所述的嗜热链球菌是嗜热链球菌Streptococcus thermophilusND03。
优选地，步骤(1)所述特异性扩增引物如下：
epsA：
epsA-F:TTATTTTTCCTCCATCA
epsA-R:ATTCGTACGCGAACTCAT
epsC：
epsC-F:TTAAATTTTATCTGTATCAG
epsC-R:GTCCAAAGTTTATGTAGCAA
epsD：
epsD-F:TCCTTTTCTACGACGAT
epsD-R:TTGAATATTTGTGCGAAT
本发明还提供一种富产胞外多糖的嗜热链球菌的快速筛选方法，包括以下步骤：
(1)取待筛选的嗜热链球菌菌株，提取其基因组DNA；
(2)根据前述的构建方法，构建步骤(1)的待筛选菌株的联合基因核酸序列；
(3)采用MEGA6.0软件中的Clustal W比对方法，将步骤(2)的待筛选菌株的联合基因核酸序列与如SEQ No.1所示的联合基因核酸序列进行比对，并利用最大似然法构建系统发育树，通过发育树获得待筛选的嗜热链球菌的分型；
(4)将发育树表现为与嗜热链球菌Streptococcus thermophilus ND03为同一分支的菌株鉴定为富产胞外多糖的嗜热链球菌，将处于发育树另一分支的嗜热链球菌菌株鉴定为低产胞外多糖的嗜热链球菌。
在本发明的快速筛选方法中，步骤(1)包括：
(1.1)取保存于安瓿管中的冻干菌粉，置于MRS培养基中活化复壮(37℃，24h)，对菌液涂片镜检，将镜检结果为革兰氏阳性的纯培养物继代培养三代；
(1.2)对上述三代纯培养物菌液进行洗涤处理，取0.5g洗脱菌体于500μL pH＝8.0的TE缓冲液中并充分混匀，置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化5min，反复冻融3次，加0.1mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，随后加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，最后用70vol％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用；
(1.3)使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测所提取DNA的浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶对发酵乳杆菌基因组DNA进行电泳检测。
在本发明的方法中，步骤(2)包括：
(2.1)根据已经公开的菌株Streptococcus thermophilus ND03的功能基因epsA、epsC和epsD设计特异性扩增引物：
epsA：
epsA-F:TTATTTTTCCTCCATCA
epsA-R:ATTCGTACGCGAACTCAT
epsC：
epsC-F:TTAAATTTTATCTGTATCAG
epsC-R:GTCCAAAGTTTATGTAGCAA
epsD：
epsD-F:TCCTTTTCTACGACGAT
epsD-R:TTGAATATTTGTGCGAAT
(2.2)以待筛选菌株的基因组DNA为模板，分别利用引物通过PCR扩增目的基因的DNA片段
扩增体系：
模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM1.5μL，Taq DNA聚合酶5U/μL 0.5μL，ddH2O补足至50μL；
扩增条件：
95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，47℃退火45s，72℃延伸1min，然后65℃延伸10min，4℃保存；
(2.3)核苷酸序列测定
扩增产物按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序；
(2.4)拼接序列
将测序所得的双向序列导入软件DNAstar的Seqman模块中，结合序列峰图进行序列比对拼接及单碱基校对，分别构建得到待筛选菌株的联合基因核酸序列。
经过对比与验证，本发明利用胞外多糖合成相关功能基因筛选鉴定富产胞外多糖嗜热链球菌，具有灵敏度高、操作简单和成本低的优点，可实现快速精确的筛选目标菌株的目的。
【附图说明】
图1为实施例3的系统发育树图；
图2为对照实施例1的系统发育树图；
其中，●为高产胞外多糖菌株。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为重量百分比、“份”均为重量份。
在本发明中，MRS培养基的组成是：
蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。
实施例1菌株的活化、培养和鉴定
以内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库中通过现有技术已完成产胞外多糖特性分析的嗜热链球菌样品作为分析对象，共收集菌株20株。菌株信息如下：
表1嗜热链球菌菌株分离源和产胞外多糖特性
对每份样品进行如下操作：
菌株活化：将保存于安瓿管中的冻干菌粉，置于MRS培养基中活化复壮(37℃，24h)，对菌液涂片镜检，将镜检结果为革兰氏阳性的纯培养物继续传代培养至第三代。
采用液氮冻融-CTAB法提取菌株DNA：对上述三代纯培养物菌液进行洗涤处理，取0.5g洗脱菌体于500μLpH＝8.0的TE缓冲液中并充分混匀，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0.1mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，随后加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，最后用70％(体积)乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。
实施例2联合基因核酸序列的构建
根据现有技术的记载，嗜热链球菌中与胞外多糖合成相关的基因有很多，但并非对这些相关基因进行随意组合拼接都能够实现有效筛选。一方面，本发明的方法需要选择基因组中的保守基因序列作为扩增的目的基因，根据《Genomic insights into highexopolysaccharide-producing dairy starter bacterium Streptococcusthermophilus ASCC 1275》(Qinglong Wu等人)，在嗜热链球菌中与胞外多糖合成相关的基因簇中，只有epsA、epsB、epsC和epsD是保守序列，可以用于分型。其它基因保守性较差，无法用于分型。
而在epsA、epsB、epsC和epsD基因中，本发明通过实验验证只有以epsA、epsC和epsD基因片段构建的联合基因核酸序列获得的分型结果能够实现有效筛选，而其他联合序列无法实现有效筛选。
2.1设计引物
以嗜热链球菌Streptococcus thermophilus ND03(全基因组序列Genbank编号CP002340)为模板，选取参与胞外多糖合成的关键基因epsA、epsB、epsC和epsD为靶点。采用Primer Premier 5.0软件设计特异性扩增引物，人工合成各引物如表2。
表2四个胞外多糖合成基因信息和引物信息
2.2扩增模板DNA
利用表1的引物通过PCR扩增模板DNA，分别得到四种基因片段。
扩增体系：模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM 1.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，ddH2O补足至50μL。
扩增条件：
95℃预变性5min；95℃变性1min，47℃退火45s，72℃延伸1min,30个循环；65℃末端延伸10min，4℃保存；
2.3核苷酸序列测定
扩增产物按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序，用于后续分析。
2.4数据分析
测序所得原始数据经DNASTAR软件中SeqMan模块质控、拼接，获得单一序列。
实施例3构建发育树
以嗜热链球菌Streptococcus thermophilus ND03扩增得到的基因片段按epsA-epsC-epsD的顺序串联起来，获得SEQ No.1的联合基因核酸序列，作为筛选方法所用的标准品。
分别以待筛选的20株菌株扩增得到的基因片段按epsA-epsC-epsD的顺序串联起来，获得待筛选菌株的联合基因核酸序列。
采用MEGA6.0软件包分析联合基因核酸序列，经Clustal W比对，对得到的20株待筛选菌株的联合基因核酸序列与SEQ No.1的联合基因核酸序列进行两两比对，计算序列间的距离，构建距离矩阵，以距离矩阵反映各序列之间亲缘关系，用最大似然法(Maximumlikelihood)构建系统发育树，如图1所示。
由基于epsA-epsC-epsD的联合基因序列构建的系统发育树(图1)可以看出：20株嗜热链球菌株构建的系统发育树被分为两个分支，其中一个分支包括ND03、MGB18-6、MGB22-6、MGB78-2、MGC4-4、NM82-3、NM82-4、NM83-2、QH46-1-1、S13-6等菌株，均具有富产胞外多糖特性，判断为富产胞外多糖菌株；另外一个分支包括MGA46-1、MGB53-5、MGB59-1、MGB61-4、MGB64-1、MGB64-2、MGB65-5、MGC20-3、XJ13-9、XJ68304等菌株，均产胞外多糖较低，判断为低产胞外多糖菌株。该结果与根据现有技术得到的筛选结果完全一致。
对照实施例1构建基于epsA-epsB-epsC-epsD联合基因核酸序列的发育树
与实施例3类似，以嗜热链球菌Streptococcus thermophilus ND03扩增得到的基因片段按epsA-epsB-epsC-epsD的顺序串联起来，获得SEQ No.2的联合基因核酸序列，作为筛选方法所用的标准品。
分别以待筛选菌株扩增得到的基因片段按epsA-epsB-epsC-epsD的顺序串联起来，获得待筛选菌株的联合基因核酸序列。
采用MEGA6.0软件包分析联合基因核酸序列，经Clustal W比对，对20株待筛选菌的联合基因核酸序列与SEQ No.2的的联合基因核酸序列进行两两比对，计算序列间的距离，构建距离矩阵，以距离矩阵反映各序列之间亲缘关系，如图2所示。
由基于epsA-epsB-epsC-epsD的联合基因序列构建的系统发育树(图2)可以看出：富产胞外多糖菌株分布在进化树不同的分支中，分布无序，无法通过进化关系来判断富产胞外多糖菌株，不能实现有效筛选。可见这种基因组合形式是不适用于本发明的方法。
类似地，其它基因片段组合形式如epsA-epsB-epsC，epsA-epsB-epsD，epsB-epsC-epsD，epsA-epsB，epsA-epsC等也无法实现有效筛选，不适用于本发明的方法。
可见，本发明的含有嗜热链球菌基因组的epsA、epsC和epsD功能基因的联合基因核酸序列可用于快速筛选富产胞外多糖嗜热链球菌菌株，根据发育树结果，将与菌株Streptococcus thermophilus ND03为同一分支的菌株鉴定为富产胞外多糖的嗜热链球菌，将发育树另一分支的嗜热链球菌菌株鉴定为低产胞外多糖的嗜热链球菌，其结果与现有技术筛选得到的结果完全一致。

Claims (7)

1.含有嗜热链球菌基因组的epsA、epsC和epsD功能基因的联合基因核酸序列在筛选富产胞外多糖的嗜热链球菌中的应用。
2.权利要求1所述的联合基因核酸序列的构建方法，其特征在于所述构建方法包括以下步骤：
(1)根据嗜热链球菌基因组的功能基因epsA、epsC和epsD设计特异性扩增引物；
(2)利用步骤(1)的引物通过PCR扩增模板DNA，所述模板DNA为嗜热链球菌基因组DNA，扩增体系为：
模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM 1.5μL，Taq DNA聚合酶5U/μL 0.5μL，ddH2O补足至50μL；
扩增条件为：
95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，47℃退火45s，72℃延伸1min，然后65℃延伸10min，4℃保存；
(3)核苷酸序列测定
扩增产物分别按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序；
(4)拼接序列
将测序所得的序列导入软件DNAstar的Seqman模块中，结合序列峰图进行序列比对拼接及单碱基校对，连接得到所述联合基因核酸序列。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤(1)所述的嗜热链球菌是嗜热链球菌Streptococcus thermophilus ND03。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于步骤(1)所述特异性扩增引物如下：
epsA：
epsA-F:TTATTTTTCCTCCATCA
epsA-R:ATTCGTACGCGAACTCAT
epsC：
epsC-F:TTAAATTTTATCTGTATCAG
epsC-R:GTCCAAAGTTTATGTAGCAA
epsD：
epsD-F:TCCTTTTCTACGACGAT
epsD-R:TTGAATATTTGTGCGAAT
5.用于筛选富产胞外多糖的联合基因核酸序列，所述序列如SEQ No.1所示。
6.富产胞外多糖的嗜热链球菌的快速筛选方法，其特征在于所述快速筛选方法包括以下步骤：
(1)取待筛选的嗜热链球菌菌株，提取其基因组DNA；
(2)根据权利要求2所述的构建方法，构建步骤(1)的菌株的联合基因核酸序列；
(3)采用MEGA6.0软件中的Clustal W比对方法，将步骤(2)的联合基因核酸序列与权利要求5所述的联合基因核酸序列进行比对，并利用最大似然法构建系统发育树，通过发育树获得待筛选的嗜热链球菌的分型；
(4)将发育树表现为与嗜热链球菌Streptococcus thermophilus ND03为同一分支的菌株鉴定为富产胞外多糖的嗜热链球菌，将处于发育树另一分支的嗜热链球菌菌株鉴定为低产胞外多糖的嗜热链球菌。
7.根据权利要求5所述的快速筛选方法，其特征在于步骤(1)包括：
(1.1)取保存于安瓿管中的冻干菌粉，置于MRS培养基中活化复壮，对菌液涂片镜检，将镜检结果为革兰氏阳性的纯培养物继代培养三代，提取其基因组DNA；
(1.2)对上述三代纯培养物菌液进行洗涤处理，取0.5g洗脱菌体于500μL pH＝8.0的TE缓冲液中并充分混匀，置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化5min，反复冻融3次，加0.1mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，随后加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，最后用70vol％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用；
(1.3)使用紫外分光光度计检测所提取DNA的浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶对嗜热链球菌基因组DNA进行电泳检测。
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