CN106755313B

CN106755313B - 弱后酸化保加利亚乳杆菌的快速筛选方法、实现所述方法的联合序列及其构建方法

Info

Publication number: CN106755313B
Application number: CN201611032396.3A
Authority: CN
Inventors: 于洁; 张和平; 孙志宏
Original assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Current assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2018-08-10
Anticipated expiration: 2036-11-17
Also published as: CN106755313A

Abstract

本发明提供用于筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌的联合序列，所述序列包括LdhL、LacZ和Pfk基因片段。本发明还提供一种弱后酸化保加利亚乳杆菌的快速筛选方法，包括提取待筛选的保加利亚乳杆菌基因组DNA；分别构建待筛选菌株的联合基因核酸序列；采用MEGA6.0软件包分析，经Clustal W比对，利用前述的联合序列与SEQ No.1所示的联合序列进行比对，构建最大似然法系统发育树，通过发育树获得保加利亚乳杆菌的分型；将发育树表现为与菌株保加利亚乳杆菌ND02为同一分支的菌株鉴定为弱后酸化保加利亚乳杆菌。本发明的筛选方法简单高效，可用于快速筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌菌株，为酸奶发酵剂的开发提供性能优良的菌株。

Description

弱后酸化保加利亚乳杆菌的快速筛选方法、实现所述方法的联合序列及其构建方法

【技术领域】

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种快速筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)的方法，以及实现所述方法的联合序列及所述联合序列的构建方法。

【背景技术】

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，简称保加利亚乳杆菌，属于化能异养型微生物，通过发酵作用代谢碳源，可利用葡萄糖、乳糖、果糖和甘露糖，产生D-乳酸和L-乳酸。保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌为发酵乳生产中的主要发酵剂菌种。在发酵乳生产过程中，发酵剂菌株可以产生乳酸赋予制品酸味，同时还可以产生醇、醛和酮等多种风味物质，改善发酵乳风味，然而如果菌株在贮存、运输和销售过程中仍保持较快的产酸能力，则会导致产品乳清析出过多，出现严重的后酸化，影响产品的货架期。研究表明保加利亚乳杆菌具有很强的耐酸性和产酸能力，是发酵乳发酵后期的优势菌群，因此也是导致后酸化的主要菌群。

保加利亚乳杆菌作为同型乳酸发酵菌株，首先乳糖在乳糖通透酶的作用下进入细胞内，之后在β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的作用下水解生成半乳糖和葡萄糖，半乳糖不能被利用并从细胞中排出，葡萄糖在糖酵解途径中生成乳酸和三磷酸腺苷。因此，β-半乳糖苷酶是乳糖分解为葡萄糖和半乳糖产生乳酸的关键酶，也是保加利亚乳杆菌产酸及后酸化的关键酶。另外，保加利亚乳杆菌发酵碳水化合物的过程中有许多酶的参与，例如糖酵解途径中有三步限速反应分别是由磷酸果糖激酶、己糖激酶和丙酮酸激酶所催化的。因此，β-半乳糖苷酶、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase)、乳糖脱氢酶(Lactatedehydrogenase)和H+-ATPase等在保加利亚乳杆菌产酸及后酸化起关键作用(乌兰,陈霞,杨梅,等.影响酸乳后酸化作用的相关因素及其作用机理研究进展[J].食品科学,2011,32(1):240-245.)。上述参考文献中阐述了这些关键酶的功能及其对后酸化起到关键作用，所选基因是对应的编码这些酶的基因。

目前，国内外对于控制发酵乳后酸化的方法有很多，主要集中于低温贮藏发酵乳、超高温杀菌和巴氏杀菌灭活发酵剂菌种、诱变弱后酸化突变株、添加防腐剂等。但这些方法中存在一些弊端，例如诱变育种菌的遗传稳定性和表达专一性还存在隐患，因此控制发酵乳后酸化的最佳方法为筛选低温下产酸弱的野生型保加利亚乳杆菌作为发酵剂菌株。然而传统筛选弱后酸化菌株的方法多依赖于菌株培养，用脱脂乳进行发酵实验，通过检测贮藏期间的pH值、滴定酸度变化和感官评鉴，既耗时耗力，又易产生误差。因此，建立一种高效的弱后酸化保加利亚乳杆菌的筛选方法显得尤为重要。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种弱后酸化保加利亚乳杆菌的快速筛选方法，以及实现该方法的联合基因序列。

本发明的思路是以保加利亚乳杆菌的代谢糖类产酸途径出发，以编码产酸关键酶(如β-半乳糖苷酶、磷酸果糖激酶、乳糖脱氢酶、H⁺-ATP酶和F₀F₁-ATPase)的基因序列型与弱后酸化程度的相关性为依据，从已知的多种与保加利亚乳杆菌的代谢糖类产酸相关基因中选取与产酸和后酸化相关的基因为靶点，通过设计引物、PCR扩增获得多个关键酶基因片段，再经过测序、拼接、比对、构建系统发育关系的过程，通过对比实验最终选取特定的LdhL、LacZ和Pfk基因实现弱后酸化保加利亚乳杆菌的快速筛选。

为此，本发明提供用于筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌的联合序列，所述序列包括LdhL、LacZ和Pfk基因片段。

本发明提供上述联合序列在筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌中的应用。

上述的联合序列的构建方法包括以下步骤：

(1)根据菌株保加利亚乳杆菌ND02基因组的LdhL、LacZ和Pfk基因设计特异性扩增引物；

(2)利用引物通过PCR扩增模板DNA，分别得到LdhL、LacZ和Pfk基因片段，所述模板DNA是菌株保加利亚乳杆菌基因组DNA，

扩增体系：

模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM1.5μL，Taq DNA聚合酶5U/μL 0.5μL，ddH₂O补足至50μL；

扩增条件：

95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸10min，4℃保存；

(3)核苷酸序列测定

扩增产物按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序；

(4)拼接序列

将测序所得的双向序列导入软件DNAstar的Seqman模块中，结合序列峰图进行序列比对拼接及单碱基校对。

在该构建方法中，步骤(1)的引物如下:

表1三个后酸化相关基因信息和引物信息

上述构建方法中，其步骤(4)，拼接LdhL、LacZ、Pfk基因序列的顺序是不受限定的，即按照LdhL-LacZ-Pfk、Pfk-LdhL-LacZ、LacZ-Pfk-LdhL、LdhL-Pfk–LacZ、LacZ-LdhL-Pfk、Pfk-LdhL-LacZ的顺序拼接得到的联合基因均可实现本发明的技术方案。

本发明还提供用于快速筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌的联合序列，其核酸序列如SEQ No.1所示，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

本发明还提供一种弱后酸化保加利亚乳杆菌的快速筛选方法，包括以下步骤：

(1)取前期鉴定为保加利亚乳杆菌的菌株进行活化镜检，对确定为革兰氏阳性的纯培养物提取其基因组DNA；

(2)根据前述的构建方法，分别构建步骤(1)的待筛选菌株的联合基因核酸序列；

(3)采用MEGA6.0软件包分析，经Clustal W比对，利用步骤(2)的联合序列与SEQNo.1所示的联合序列进行比对，构建最大似然法系统发育树，通过发育树获得保加利亚乳杆菌的分型；

(4)将发育树表现为与菌株保加利亚乳杆菌ND02(对应SEQ No.1所示的联合序列的菌株)为同一分支的菌株鉴定为弱后酸化保加利亚乳杆菌，将发育树另一分支的菌株鉴定为后酸化较强的保加利亚乳杆菌。

在本发明的方法中，步骤(1)包括：

(1.1)取保存于安瓿管中的冻干菌粉，置于MRS培养基中活化复壮(37℃，24h)，对菌液涂片镜检，将镜检结果为革兰氏阳性的纯培养物传代培养三代。

(1.2)对上述三代纯培养物菌液进行洗涤处理，取0.5g洗脱菌体于500μLpH＝8.0的TE缓冲液中并充分混匀，置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化5min，反复冻融3次，加0.1mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，随后加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，最后用70体积％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用；

(1.3)使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测所提取DNA的浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶对发酵乳杆菌基因组DNA进行电泳检测。

与现有技术相比，本发明利用产酸和后酸化相关功能基因获得联合序列能够实现快速筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌，具有灵敏度高、操作简单和成本低的优点，可实现快速、精确、批量的筛选作业。

【附图说明】

图1为待筛选保加利亚乳杆菌分离株的LdhL基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2为待筛选保加利亚乳杆菌分离株的LacZ基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3为待筛选保加利亚乳杆菌分离株的Pfk基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4为实施例3的系统发育树图；

图5为联合基因序列构建的系统发育树。

【具体实施方式】

以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。

在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为重量百分比、“份”均为重量份。

在本发明中，MRS培养基的组成是：

蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(NH₄)₂HC₆H₅O₇]2.0g，葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0g，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.58g，硫酸锰(MnSO₄·H₂O)0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。

实施例1菌株的活化、培养和鉴定

以内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库中通过其他现有技术已完成弱后酸化筛选的保加利亚乳杆菌作为分析对象，共收集菌株13株。菌株信息如表2：

表2 13株保加利亚乳杆菌的分离源和后酸化程度

对每份样品进行如下操作：

菌株活化：将保存于安瓿管中的冻干菌粉，置于MRS培养基中活化复壮(37℃，24h)，对菌液涂片镜检，将镜检结果为革兰氏阳性的纯培养物继续传代培养至第三代。

采用液氮冻融-CTAB法提取菌株DNA：对上述三代纯培养物菌液进行洗涤处理，取0.5g洗脱菌体于500μL pH＝8.0的TE缓冲液中并充分混匀，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0.1mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，随后加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，最后用70体积％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。

实施例2联合序列的构建

2.1设计引物

以公开的保加利亚乳杆菌ND02(Genbank编号CP002341)为模板，选取参与产酸和后酸化的关键酶(如β-半乳糖苷酶、磷酸果糖激酶、乳糖脱氢酶、H⁺-ATP酶和F₀F₁-ATPase)的基因LdhL、LacZ、Pfk、ATPsA和uncC为靶点。根据现有研究，这些关键基因均与保加利亚乳杆菌产酸能力与具有显著的相关性。采用Primer Premier 6.0软件设计特异性扩增引物，人工合成各引物如前述表3。

表3

2.2基因扩增

利用表1的引物通过PCR扩增模板DNA，分别得到表2的13株菌株的五个基因片段。

扩增体系：模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM 1.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，ddH₂O补足至50μL。

扩增条件：

95℃预变性5min；95℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min,30个循环；72℃末端延伸10min，4℃保存；

2.3核苷酸序列测定

扩增产物按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序，用于后续分析。

2.4数据分析

测序所得原始数据经DNASTAR软件中SeqMan模块质控、拼接，分别获得单一序列，再将每株菌的基因片段序列按LacZ-LdhL-Pfk的顺序串联起来，分别得到13条含有LacZ、LdhL和Pfk基因的联合序列。其中，样品序号1、分离株ND02得到的序列作为标准品，标记为SEQ No.1(其氨基酸序列如SEQ No.2)；样品序号2-12得到的序列用于比较和筛选。

实施例3构建发育树

采用MEGA6.0软件包分析联合序列，经Clustal W比对，对实施例2中的13株菌的序列与SEQ No.1的联合序列(对应保加利亚乳杆菌ND02)进行两两比对，计算序列间的距离，构建距离矩阵，以距离矩阵反映各序列之间亲缘关系。

然后通过最大似然法(Maximum likelihood)构建系统发育树，如图4所示。

由图1可以看出，以保加利亚乳杆菌ND02作为标准品，基于LacZ-LdhL-Pfk的联合基因序列构建的系统发育树可以看出：13株保加利亚乳杆菌构建的系统发育树主要为两个分支，其中一个分支中ND02、IMAU20298、IMAU20282、IMAU20302、IMAU20136、IMAU20331、IMAU20790、IMAU20769、IMAU20240、IMAU20401等菌株均为通过前期研究被证实为弱后酸化特性菌株，判断为弱后酸化菌株；另外一个分支中IMAU20312、IMAU20310、IMAU20743判断为后酸化强的菌株。这与刘娜等利用传统筛选方法对实施例1的各菌株后酸化性能测得的结果一致(刘娜,邵玉宇,乌兰,等.具有优良发酵特性的德氏乳杆菌保加利亚亚种的筛选[J].中国乳品工业,2013,41(7):7-11；扎木苏,秦艳婷,乌仁图雅,等.分离自蒙古国发酵乳制品的保加利亚乳杆菌产酸特性及发酵乳的酸组分[J].乳业科学与技术,2014,37(1):6-10.)。

此外，通过同样的方法，构建同样含有LacZ、LdhL和Pfk基因、但具备不同拼接顺序的联合序列，其拼接顺序为LdhL-LacZ-Pfk。

同样借助MEGA6.0软件包进行比对、计算序列间的距离，构建发育树。

结果发现，同样样含有LacZ、LdhL和Pfk基因、但具备不同拼接顺序的联合序列均能得到如图4所示的结果，与期望的一致，表明在联合基因中，关键基因的拼接顺序对系统发育树没有影响。

对照实施例1构建基于LacZ、Pfk和uncC联合基因核酸序列的发育树

根据实施例2得到的13株分离株的五种基因片段，构建用含有LacZ、Pfk和uncC基因的联合序列。

与实施例3类似，以保加利亚乳杆菌ND02扩增得到的基因片段LacZ、Pfk和uncC串联起来，按照LacZ、Pfk和uncC的顺序拼接获得SEQ No.3的联合基因核酸序列，作为筛选方法所用的标准品。

分别将待筛选菌株扩增得到的基因片段LacZ、Pfk和uncC串联起来，获得待筛选菌株的联合基因核酸序列。

采用MEGA6.0软件包分析联合基因核酸序列，经Clustal W比对，对13株待筛选菌的联合基因核酸序列与SEQ No.3的的联合基因核酸序列进行两两比对，计算序列间的距离，构建距离矩阵，以距离矩阵反映各序列之间亲缘关系，如图5所示。

由基于LacZ、Pfk和uncC的联合基因序列构建的系统发育树(图5)可以看出：弱后酸化菌株分布在进化树不同的分支中，分布无序，无法通过进化关系来判断弱后酸化菌株菌株，不能实现有效筛选。按照现有技术的记载，尽管uncC基因(F₀F₁-ATPase)同样被认为是保加利亚乳杆菌产酸关键酶的基因，但以该基因和其他几个关键基因构成的联合序列却未能与本发明的技术方案一样实现有效筛选。

可见基于LacZ、Pfk和uncC的联合基因不适用于本发明的方法。

类似地，经过验证，其它基因片段拼接组合构成的联合如LacZ-Pfk-LdhL、LacZ-Pfk-uncC-LdhL、LacZ-Pfk-uncC-LdhL-ATPsA等均不能得到与图4相同的结果，因而无法实现有效筛选，不能实现本发明的目的。

可见，本发明的方法简单高效，可用于快速筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌菌株，为酸奶发酵剂的开发提供性能优良的菌株。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古农业大学

<120> 弱后酸化保加利亚乳杆菌的快速筛选方法、实现所述方法的联合序列及其构

建方法

<130> 16270.1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3085

<212> DNA

<213> 保加利亚乳杆菌ND02联合序列

<400> 1

ttcgactgga ccaagaagta caacttgctg gtcaccaacg ttccggtcta ctccccgcgg 60

gcgatcgctg aaatgacggt tacccaggcc atgtacctcc tgcgcaagat cggggaattc 120

cgctatcgta tggaccatga ccatgacttt acttggccaa gtaacttgat cagcaatgaa 180

atctacaacc tgactgtcgg cttgatcggg gtcggtcaca tcggcagcgc cgtggcagaa 240

atcttctcag ccatgggggc caaggtcatc gcctatgacg tggcttacaa cccggaattt 300

gaaccatttt tgacctacac cgactttgac acggtcttga aagaagctga catcgtctcc 360

ctccacactc ccctcttccc atcaacggaa aacatgatcg gggaaaagca gctgaaggaa 420

atgaagaagt ctgcctactt gatcaactgt gcccggggcg aattagtcga cactggagcc 480

ttgatcaagg ccttgcagga tggcgaaatc gccggtgccg gcctggacac tttggctggg 540

gaatccagct actttggcca cactggcctg acggacagcg aaatcccaga agactacaag 600

accctggcca agatgccaaa aaatgcgggt catcgttgac ggctttgaca aggtagccgc 660

catgaagaag acctacaaga agctcaacct agacgctttg gcggttttgg gcggcaacgg 720

gtcacttaag tcagccaaca tgctggccca agaaggcttg aacgtgatcg gcctgccaaa 780

gaccatcgac aacgacactt gggggactga ctacaccttc ggtttccaaa gcgccattga 840

tattgccacc agatacctgg atgacatcca cactactgct caaagccact cccgggtctt 900

cgtcgtcgaa gtcatgggcc acaaggttgg ccacatcacc ctggccgccg gcctggctgc 960

cggcagcgac attatccttt tgccggaaat cccttatgac atcaatgtcg tggccaagaa1020

ggtcaaggaa agacaaaagt ctggcaaggg cttcacggtc attgccgccg ctgaaggggc1080

aatttccaag gaagacgcca ccctgtccaa gaagaagtac aaggctaagg ttgccgctag1140

aaacggcgcc agcgtggtta acgaaatcgc tgcccaattg caggaagttt tgccagacgc1200

tgaaatcaga acggcggtca tcggccacgc tcaacggggc ggccggccag atgcctacga1260

tcggcaaatc tcaacccgct tcgggattga aggggcccgc ctgatcatga accggtcctt1320

aaaagctggg cccaatcaga agcgagcagc tggaattcac tctggctgat ttgccagtag1380

ctgcttggag cgcggaaaag cctaaccttt accaggtccg cctgtattta taccaggaag1440

gcagcctctt agaggttagc cggcaggaag tgggtttccg caactttgaa ctaaaagacg1500

ggattatgta ccttaacggc cagcggatcg tcttcaaggg ggtcaaccgg cacgaatttg1560

acagtaagtt ggctcgggct atcacggaag aggatatgat ctgggacatc aagaccatga1620

agcgaagcaa catcaatgct gtccgctgct ctcactaccc gaaccagtcc ctcttttacc1680

ggctctgtga caagtacggc ctttacgtca ttgatgaagc taacctggaa agccacggca1740

cctgggaaaa agtggggggg cacgaagatc ctagcttcaa tgttccaggc gatgaccagc1800

attggctggg agccagctta tcccgggtga agaacatgat ggctcgggac aagaaccatg1860

cttcaatcct gatctggtct ttaggcaatg agtcttacgc cggcactgtc tttgcccaaa1920

tggctgatta cgtccggaag gctgatccga cccgggttca gcactatgaa ggggtgaccc1980

acaaccggaa gtttgacgac gccacccaga ttgaaagccg gatgtatgct ccggccaagg2040

taattgaaga atacttgacc aataaaccag ccaagccatt tatctcagtt gaatacgctc2100

acgccatggg caactccgtc ggtgacctgg ccgcctacac ggccttggaa aaataccccc2160

actaccaggg cggcttcatc tgggactgga ttgaccaagg actggaaaaa gacgggcacc2220

tgctttatgg gggcgacttc gatgaccggc caaccgacta tgaattctgc gggaacggcc2280

tggtctttgc tgaccggact gaatcgccga aactggctaa tgtcaaggct ctttacgcca2340

accttaagtt agaagtaaaa gatgggcagc tcttcctcaa aaacgacaat ttatttacca2400

acagctcatc ttactacttc ttgactagtc ttttggtcga tggcaagttg acctaccaga2460

gccggcctct gacctttggc ctggagcctg gcgaatccgg gacctttgcc ctgccttggc2520

cggaagtcgc tgacgaaaaa ggggaggtcg tctaccgggt aacggcccac ttaaaagaag2580

acttgccttg ggcggatgag ggcttcactg tggctgaagc agaagaagta gctcaaaagc2640

tgccggaatt taagccggaa gggcggccag atttagttga ttccgactac aacctaggcc2700

tgaaaggaaa taacttccaa attctcttct ccaaggtcaa gggctggccg gtttccctca2760

agtatgccgg tagggaatac ttgaagcggc tgccggaatt taccttctgg cgggccctga2820

cggacaacga ccggggagct ggttacggct atgatctggc ccggtgggaa aatgccggca2880

agtatgcccg cttgaaagac atcagctgcg aggtcaagga agactccgtt ttggtcaaga2940

ctgcctttac gttgcctgtc gccttaaagg gtgatttaac cgtgacctat gaagtcgatg3000

gacggggcaa gattgctgta acagctgact tcccaggcgc ggaagaagcc ggtctcttgc3060

cagcctttgg cttgaacctg gccct 3085

<210> 2

<211> 984

<212> PRT

<213> 保加利亚乳杆菌ND02联合序列的氨基酸序列

<400> 2

Phe Asp Trp Thr Lys Lys Tyr Asn Leu Leu Val Thr Asn Val Pro Val

1 5 10 15

Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Ala Glu Met Thr Val Thr Gln Ala Met Tyr

20 25 30

Leu Leu Arg Lys Ile Gly Glu Phe Arg Tyr Arg Met Asp His Asp His

35 40 45

Asp Phe Thr Trp Pro Ser Asn Leu Ile Ser Asn Glu Ile Tyr Asn Leu

50 55 60

Thr Val Gly Leu Ile Gly Val Gly His Ile Gly Ser Ala Val Ala Glu

65 70 75 80

Ile Phe Ser Ala Met Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Val Ala Tyr

85 90 95

Asn Pro Glu Phe Glu Pro Phe Leu Thr Tyr Thr Asp Phe Asp Thr Val

100 105 110

Leu Lys Glu Ala Asp Ile Val Ser Leu His Thr Pro Leu Phe Pro Ser

115 120 125

Thr Glu Asn Met Ile Gly Glu Lys Gln Leu Lys Glu Met Lys Lys Ser

130 135 140

Ala Tyr Leu Ile Asn Cys Ala Arg Gly Glu Leu Val Asp Thr Gly Ala

145 150 155 160

Leu Ile Lys Ala Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Gly Ala Gly Leu Asp

165 170 175

Thr Leu Ala Gly Glu Ser Ser Tyr Phe Gly His Thr Gly Leu Thr Asp

180 185 190

Ser Glu Ile Pro Glu Asp Tyr Lys Thr Leu Ala Lys Met Pro Lys Asn

195 200 205

Ala Gly His Arg Arg Leu Gln Gly Ser Arg His Glu Glu Asp Leu Gln

210 215 220

Glu Ala Gln Pro Arg Arg Phe Gly Gly Phe Gly Arg Gln Arg Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Gln His Ala Gly Pro Arg Arg Leu Glu Arg Asp Arg Pro Ala

245 250 255

Lys Asp His Arg Gln Arg His Leu Gly Asp Leu His Leu Arg Phe Pro

260 265 270

Lys Arg His Tyr Cys His Gln Ile Pro Gly His Pro His Tyr Cys Ser

275 280 285

Lys Pro Leu Pro Gly Leu Arg Arg Arg Ser His Gly Pro Gln Gly Trp

290 295 300

Pro His His Pro Gly Arg Arg Pro Gly Cys Arg Gln Arg His Tyr Pro

305 310 315 320

Phe Ala Gly Asn Pro Leu His Gln Cys Arg Gly Gln Glu Gly Gln Gly

325 330 335

Lys Thr Lys Val Trp Gln Gly Leu His Gly His Cys Arg Arg Arg Gly

340 345 350

Asn Phe Gln Gly Arg Arg His Pro Val Gln Glu Glu Val Gln Gly Gly

355 360 365

Cys Arg Lys Arg Arg Gln Arg Gly Arg Asn Arg Cys Pro Ile Ala Gly

370 375 380

Ser Phe Ala Arg Arg Asn Gln Asn Gly Gly His Arg Pro Arg Ser Thr

385 390 395 400

Gly Arg Pro Ala Arg Cys Leu Arg Ser Ala Asn Leu Asn Pro Leu Arg

405 410 415

Asp Arg Gly Pro Pro Asp His Glu Pro Val Leu Lys Ser Trp Ala Gln

420 425 430

Ser Glu Ala Ser Ser Trp Asn Ser Leu Trp Leu Ile Cys Gln Leu Leu

435 440 445

Gly Ala Arg Lys Ser Leu Thr Phe Thr Arg Ser Ala Cys Ile Tyr Thr

450 455 460

Arg Lys Ala Ala Ser Arg Leu Ala Gly Arg Lys Trp Val Ser Ala Thr

465 470 475 480

Leu Asn Lys Thr Gly Leu Cys Thr Leu Thr Ala Ser Gly Ser Ser Ser

485 490 495

Arg Gly Ser Thr Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser Trp Leu Gly Leu Ser

500 505 510

Arg Lys Arg Ile Ser Gly Thr Ser Arg Pro Ser Glu Ala Thr Ser Met

515 520 525

Leu Ser Ala Ala Leu Thr Thr Arg Thr Ser Pro Ser Phe Thr Gly Ser

530 535 540

Val Thr Ser Thr Ala Phe Thr Ser Leu Met Lys Leu Thr Trp Lys Ala

545 550 555 560

Thr Ala Pro Gly Lys Lys Trp Gly Gly Thr Lys Ile Leu Ala Ser Met

565 570 575

Phe Gln Ala Met Thr Ser Ile Gly Trp Glu Pro Ala Tyr Pro Gly Arg

580 585 590

Thr Trp Leu Gly Thr Arg Thr Met Leu Gln Ser Ser Gly Leu Ala Met

595 600 605

Ser Leu Thr Pro Ala Leu Ser Leu Pro Lys Trp Leu Ile Thr Ser Gly

610 615 620

Arg Leu Ile Arg Pro Gly Phe Ser Thr Met Lys Gly Pro Thr Thr Gly

625 630 635 640

Ser Leu Thr Thr Pro Pro Arg Leu Lys Ala Gly Cys Met Leu Arg Pro

645 650 655

Arg Leu Lys Asn Thr Pro Ile Asn Gln Pro Ser His Leu Ser Gln Leu

660 665 670

Asn Thr Leu Thr Pro Trp Ala Thr Pro Ser Val Thr Trp Pro Pro Thr

675 680 685

Arg Pro Trp Lys Asn Thr Pro Thr Thr Arg Ala Ala Ser Ser Gly Thr

690 695 700

Gly Leu Thr Lys Asp Trp Lys Lys Thr Gly Thr Cys Phe Met Gly Ala

705 710 715 720

Thr Ser Met Thr Gly Gln Pro Thr Met Asn Ser Ala Gly Thr Ala Trp

725 730 735

Ser Leu Leu Thr Gly Leu Asn Arg Arg Asn Trp Leu Met Ser Arg Leu

740 745 750

Phe Thr Pro Thr Leu Ser Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Ser Lys Thr

755 760 765

Thr Ile Tyr Leu Pro Thr Ala His Leu Thr Thr Ser Leu Val Phe Trp

770 775 780

Ser Met Ala Ser Pro Thr Arg Ala Gly Leu Pro Leu Ala Trp Ser Leu

785 790 795 800

Ala Asn Pro Gly Pro Leu Pro Cys Leu Gly Arg Lys Ser Leu Thr Lys

805 810 815

Lys Gly Arg Ser Ser Thr Gly Arg Pro Thr Lys Lys Thr Cys Leu Gly

820 825 830

Arg Met Arg Ala Ser Leu Trp Leu Lys Gln Lys Lys Leu Lys Ser Cys

835 840 845

Arg Asn Leu Ser Arg Lys Gly Gly Gln Ile Leu Ile Pro Thr Thr Thr

850 855 860

Ala Lys Glu Ile Thr Ser Lys Phe Ser Ser Pro Arg Ser Arg Ala Gly

865 870 875 880

Arg Phe Pro Ser Ser Met Pro Val Gly Asn Thr Ser Gly Cys Arg Asn

885 890 895

Leu Pro Ser Gly Gly Pro Arg Thr Thr Thr Gly Glu Leu Val Thr Ala

900 905 910

Met Ile Trp Pro Gly Gly Lys Met Pro Ala Ser Met Pro Ala Lys Thr

915 920 925

Ser Ala Ala Arg Ser Arg Lys Thr Pro Phe Trp Ser Arg Leu Pro Leu

930 935 940

Arg Cys Leu Ser Pro Arg Val Ile Pro Pro Met Lys Ser Met Asp Gly

945 950 955 960

Ala Arg Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gln Ala Arg Lys Lys Pro Val Ser

965 970 975

Cys Gln Pro Leu Ala Thr Trp Pro

980

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物ldhL-F

<400> 3

tcagaatcgt tggcttcaac acc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物ldhL-R

<400> 4

tgtagaaggc tgagtgcgga gta 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物lacZ-F

<400> 5

gggatagtga aggtgacttg gttg 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物lacZ-R

<400> 6

agcggtaatc ggtcagttct ttt 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物pfk -F

<400> 7

tgggcacttc ccgccagcca ttca 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物pfk -R

<400> 8

agcggtaatc ggtcagttct ttt 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物ATPsA-F

<400> 9

aaaggattta gctgctgcac ttg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物ATPsA-R

<400> 10

taacgatagc caggattgga acg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物uncC-F

<400> 11

gcattcgcca aagtagccgt tca 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物uncC-R

<400> 12

aagcctatcc gccaatcagt tca 23

Claims

1.用于筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌的联合序列，所述序列由LdhL、LacZ和Pfk基因组成。

2.由保加利亚乳杆菌LdhL、LacZ和Pfk基因组成的联合序列在筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌中的应用。

3.权利要求1所述的联合序列的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

(1)依据保加利亚乳杆菌的基因组，分别对LdhL、LacZ和Pfk功能基因设计特异性扩增引物；

(2)利用引物通过PCR扩增模板DNA，扩增得到LdhL、LacZ和Pfk功能片段，所述模板DNA为保加利亚乳杆菌基因组DNA，

扩增体系：

模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM 1.5μL，Taq DNA聚合酶5U/μL 0.5μL，ddH₂O补足至50μL；

扩增条件：

(3)核苷酸序列测定

扩增产物按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序；

(4)拼接序列

将测序所得的序列导入软件DNAstar的Seqman模块中，结合序列峰图进行序列比对拼接及单碱基校对，拼接LdhL、LacZ、Pfk基因序列得到所述联合序列。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(1)中，所述保加利亚乳杆菌是保加利亚乳杆菌ND02。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于步骤(1)的引物如下：

ldhL：

ldhL-F:TCAGAATCGTTGGCTTCAACACC

ldhL-R:TGTAGAAGGCTGAGTGCGGAGTA

lacZ：

lacZ-F:GGGATAGTGAAGGTGACTTGGTTG

lacZ-R:AGCGGTAATCGGTCAGTTCTTTT

pfk：

pfk-F:TGGGCACTTCCCGCCAGCCATTCA

pfk-R:CTTCGCCTTGCTTCAAGACAACC。

6.用于快速筛选弱后酸化保加利亚乳杆菌的联合序列，其核酸序列如SEQ No.1所示。

7.根据权利要求6所述的联合序列，其特征在于所述联合序列是根据权利要求3所述的构建方法得到的，其中，步骤(2)中以保加利亚乳杆菌ND02基因组DNA作为模板DNA。

8.弱后酸化保加利亚乳杆菌的快速筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)根据权利要求3所述的方法，构建步骤(1)的待筛选菌株的联合序列；

(3)采用MEGA6.0软件包分析，经Clustal W比对，将步骤(2)的联合序列与权利要求6所述的联合序列进行比对，构建步骤(1)的待筛选菌株和保加利亚乳杆菌ND02的最大似然法系统发育树，通过发育树获得保加利亚乳杆菌的分型；

(4)将发育树表现为与保加利亚乳杆菌ND02为同一分支的菌株鉴定为弱后酸化保加利亚乳杆菌，将处于发育树另一分支的保加利亚乳杆菌菌株鉴定为后酸化强保加利亚乳杆菌。

9.根据权利要求8所述的快速筛选方法，其特征在于步骤(1)包括：

(1.1)取保存于安瓿管中的冻干菌粉，置于MRS培养基中活化复壮，对菌液涂片镜检，将镜检结果为革兰氏阳性的纯培养物继代培养三代，提取其基因组DNA；

(1.3)使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测所提取DNA的浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶对保加利亚乳杆菌菌株基因组DNA进行电泳检测。