CN103409434A

CN103409434A - 一种动物双歧杆菌eps生物合成基因簇

Info

Publication number: CN103409434A
Application number: CN2013102366821A
Authority: CN
Inventors: 李平兰; 刘丽莎; 范熠; 桂萌; 王洋; 尚楠
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明涉及一种动物双歧杆菌胞外多糖（EPS）基因簇，包括与转运、输出及糖链合成相关基因。所述菌株是分离自广西巴马长寿老人肠道的产功能性胞外多糖双歧杆菌LPL-RH（Bifidobacterium animalis LPL-RH），保藏号为：CGMCC NO.4599。所述基因簇分离自双歧杆菌LPL-RH，对其进行克隆并测序，基因簇包括与转运输出相关基因wzx、wzy、wzz和EPSa主链合成基因。本发明的EPS基因簇可用于产胞外多糖双歧杆菌的筛选及合成功能性胞外多糖菌株的基因改造。

Description

一种动物双歧杆菌EPS生物合成基因簇

技术领域

本发明涉及一种动物双歧杆菌EPS基因簇和包括该基因簇的动物双歧杆菌。

背景技术

双歧杆菌（Bifidobacterium）是在1899年由法国巴斯德研究院Tissier从母乳喂养婴儿粪便中分离的，专性厌氧，呈弯曲杆状、Y或棒槌状的不规则杆菌。近一个世纪的研究实践表明双歧杆菌是人体内重要的一种肠道益生菌，对宿主发挥生物屏障、维持肠道微生态平衡、免疫、延缓衰老和抗肿瘤等生理作用。双歧杆菌的存在及数量已成为评价人体肠道健康状况的重要指标，也作为益生菌广泛应用于食品和保健品。双歧杆菌许多表观特性及功能均与其代谢产物相关，因此对其代谢产物进行研究具有重要意义。

EPS均由若干相同的寡糖重复单元聚合而成，组成重复单元的单糖种类及数量不同，糖苷键的连接方式及侧链基团因种属而别，分为同多糖和杂多糖，但EPS生物合成均以重复单元核苷酸糖的连接开始，UDP-GlcNAc前体连接至内膜Undp上。双歧杆菌产生的胞外多糖为杂多糖，由不同的单糖通过糖苷键连接而成，包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖等。本发明涉及的菌株动物双歧杆菌LPL-RH（CGMCC NO.4599）能产生两种EPS，EPSa单糖组成为：Ara:Gal:Glc:Man=0.4:1.8:4.3:3.4，EPSb单糖组成为：LPL-RHa:Ara:Gal:Glc:Man=0.4:0.3:1.6:0.8:1.2，其结构分别如图1和图2组成。

自1996年，Stingele报道嗜热链球菌胞外多糖基因簇序列以来，许多乳酸菌EPS合成基因簇也相继得到报道，如乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌等，大多数乳酸菌eps基因簇均由调控、链长决定、重复单元合成和聚合输出4个区域构成，同种乳酸菌eps基因簇具有很高的同源性。双歧杆菌eps基因簇相关研究非常少，只有Saranna对短双歧杆菌UCC2003的eps基因簇进行报道，总长约25.6kb，共涉及20个相关EPS合成相关基因，其中包含两个操纵子eps1和eps2，但是只有eps1能正常转录指导EPS合成。其中Wzx（polysaccharide repeat unit transport protein）是一类膜整合蛋白家族，具有翻转酶（flippase）功能，将单糖单元从细胞膜的胞质面翻转到外周质空间，wzx缺失菌株会使O-unit中间产物在质膜内侧积累。Wzy（oligosaccharide repeat unit polymerase）负责将Wzx转运出的重复单元聚合形成长链多糖分子。对Wzy的预测发现乳酸菌Wzy蛋白有9～14个跨膜螺旋，不同菌株来源的Wzy同源性很低。Wzy是阐释EPS生物合成的关键酶，在体外利用同位素标记的RU-PP-Und为底物，验证Wzy蛋白参与多糖重复单元的聚合。Wzz（Chain length regulator）是一类Etk-like酪氨酸激酶，在多糖重复单元跨膜及聚合时作为辅助蛋白控制糖链长度。一种假设认为Wzz相当于分子计时器，控制Wzy活性，使其在聚合反应中平衡，另外一种假设认为起分子尺寸作用，控制Wzy与辅助蛋白状态控制糖链长度。

获得双歧杆菌EPS基因簇的序列及功能对了解益生菌胞外多糖合成调控机制有重要帮助，也能为产粘双歧杆菌的筛选、功能性EPS筛选及菌株的代谢调控提供依据。

发明内容

本发明人从广西巴马长寿老人肠道内分离到产糖菌株LPL-RH，利用分子生物学手段将菌株LPL-RH鉴定为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis LPL-RH），进一步对菌株LPL-RH的EPS基因簇序列进行克隆及比对，获得参与EPS合成过程多糖聚合、糖基转移、糖链长度控制以及多糖转运和输出相关基因的序列，为进一步了解双歧杆菌LPL-RH胞外多糖生物合成途径和调控机制奠定了基础。

本发明的目的之一是对产EPS双歧杆菌LPL-RH基因簇中相关基因进行克隆和测序。

本发明的目的之二是通过对相关基因的克隆分析确定EPS基因簇与EPS合成之间的关系。

本发明的目的之三是提供EPS相关基因在产EPS双歧杆菌的筛选、鉴定及改造方面的应用。

本发明中涉及的菌株动物双歧杆菌LPL-RH（Bifidobacterium animalis LPL-RH）已于2011年2月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，100101），保藏号：CGMCC No.4599。

本发明提供双歧杆菌EPS相关基因wzx、wzy、wzz的克隆方法，包括：

a.从GeneBank公布的动物双歧杆菌全基因组相关基因序列设计引物；

b.利用上述引物对本发明菌株LPL-RH进行PCR扩增，获得目的片段；

c.将PCR产物克隆并测序。

本发明提供EPSa主链合成基因的克隆方法，包括：

a.从已扩增的两个wzx基因设计特异性引物；

b.利用上述引物对菌株LPL-RH进行PCR扩增，获得目的片段，包括8个ORF；

c.将产物测序并分析。

本发明所述动物双歧杆菌LPL-RH能产生功能性胞外多糖EPSa和EPSb，对其EPS基因簇研究发现与胞外多糖合成转运及EPSa主链合成相关基因，可用于产功能性EPS双歧杆菌筛选及产EPS菌株的改造。

附图说明

图1双歧杆菌EPSa重复单元结构图

图2双歧杆菌EPSb重复单元结构图

图3基于16S rDNA序列的系统发育树

图4基于tuf序列的系统发育树

图5动物双歧杆菌LPL-RH部分EPS基因结构

具体实施方式

下列实施例用于说明本发明，但不限制本发明范围。

实施例1.产糖双歧杆菌LPL-RH的鉴定

采用CTAB法提取双歧杆菌基因组DNA：将双歧杆菌LPL-RH按3%接种于TPY液体培养基，37℃厌氧培养12h至稳定期，4℃10000r/min离心10min，收集菌体并用TE（pH=8.0）洗涤2次。将菌体悬浮于9.5mL TE中，并加入0.5mL10%SDS，50uL20mg/mL蛋白酶K和25uL50mg/mL溶菌酶，37度水浴1h。随后加入1.5mL5mol/L氯化钠和1.5mLCTAB-NaCl在65℃水浴20min。等体积加异戊醇-氯仿（1：24），充分混匀后离心（12000r/min 15min）。去除沉淀后上清液加等体积异戊醇-氯仿-酚（1：24：25），充分混匀后以12000r/min离心15min。加入0.6倍异丙醇于-20℃放置20min后12000r/min20min，用70%乙醇清洗沉淀，12000r/min离心5min，室温放置5min。沉淀溶于1mLTE（pH=8.0）中，加入适量RNaseA，37℃水浴1h，电泳检验基因组质量，置-20℃保存备用。

以细菌16S rRNA基因通用引物（LPW57/LPW205）及双歧杆菌tuf基因引物（tuf1/tuf2）为引物，菌体总DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果。PCR反应产物纯化后，连接T载体后测序（北京博迈德生物技术有限公司），将结果与GenBank中收录的其他菌株序列进行分析比对，采用MEGA4.1软件Kimura模型，邻位连接法，进行1000次相似度重复计算分析同源性并构建系统发育树。

图3结果显示了双歧杆菌LPL-RH与其他同属标准株的亲缘关系。通过16S rRNA序列分析，菌株LPL-RH与Bifidobacterium animalis subsp.lactis DSM10140（Genbank序列号：CP001606.1）和Bifidobacteriumanimalis JCM1190（Genbank序列号：NR_043438.1）的亲缘关系最近，同源性均为99%。生物分类学是不断发展变化的动态过程，近30年来，众多研究成果对双歧杆菌的分类提供了新的参考，2004年，Masco等将动物双歧杆菌和乳双歧杆菌合并为动物双歧杆菌种，成为两个独立的亚种，研究人员已认可这一分类命名方式，鉴于双歧杆菌LPL-RH跟两个种的亲缘关系较近，本专利将利用看家基因对菌株LPL-RH进一步鉴定。

利用tuf基因对菌株LPL-RH的鉴定结果如图4所示，LPL-RH与B.animalis subsp.lactis DSM10140（Genbank序列号：CP001606.1）、CNCMI2494（Genbank序列号：CP002915.1）的亲缘关系最近，同源性达100%，与B.animalis subsp.animalis ATCC25527（Genbank序列号：CP002567.1）的亲缘关系稍远，为99%。目前，用于双歧杆菌系统发育分析的看家基因有hsp60（编码热休克蛋白heat-shock protein）、rpoB（编码RNA聚合酶β亚单位RNA polymeraseβ-subunit gene）、atpD（编码ATP合成酶F1的β亚单位,ATPsynthase F1beta subunit）、groEL（编码groEL蛋白,groEL protein）、tuf（编码延伸因子Tu,elongation factorTu）等。

综合上述分子学鉴定结果，确定菌株LPL-RH属于动物双歧杆菌中的乳亚种，为后续基因簇的研究奠定了基础。

实施例2.双歧杆菌胞外多糖输出转运相关基因的克隆及分析

1.引物设计

根据GenBank中已报道的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis AD011，GenBank序列号：NC_011835.1)全基因组序列信息，利用Primer Premier5.0设计多糖重复单元转运子(polysaccharidetransporter，wzx)等引物见表1。

表1引物列表

2.PCR反应体系及条件

反应体系（25μL）：Taq Mix12.5μL，dd H₂O10.5μL，上下游引物（见表）各0.5μL，模板1μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，退火45s，72℃延伸2min，共30个循环，72℃终延伸10min。

3.PCR产物纯化及测序

取1g琼脂糖加入1×TAE缓冲液100mL，加热融化后冷却至60℃，加入6μL染色液Gold view，倒入安装点样梳的凝胶槽内。待胶凝固后，取适量样品加入点样孔，在TAE缓冲液100V条件下电泳20min，在紫外灯下检验PCR产物纯度，将目的条带从凝胶上切下，纯化后克隆到测序载体pGEM-T中，转化E.coli后，在含有IPTG和X-gal的平板上挑选白色菌落进行鉴定。纯化后的目的条带送至博迈德（北京）测序。

4.生物信息学分析

相似性比较采用NCBI的BLAST软件在线分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。多序列比对采用ClustalW程序在线分析Oattp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/)。

结果：

EPS生物合成通常由一大簇基因编码，基因簇常单向排列，转录形成mRNA。以提取的动物双歧杆菌乳亚种LPL-RH基因组DNA为模板，经PCR扩增与多糖合成输出及转运相关基因。

1.由WZX1特异性引物扩增出1192bp的片段（附1.1），编码一个397-aa的蛋白（附2.1），经BLASTx比对分析该序列为编码动物双歧杆菌乳亚种LPL-RH多糖重复单元转运子（polysaccharide repeat unittransport protein）合成的wzx基因序列。应用欧洲生物信息学研究所（EBI，http://ebi.ac.uk/clustalw）clustalw在线多序列比对，该序列与动物双歧杆菌乳亚种AD011（Genbank序列号：YP_002469458.1）及BB-12（Genbank序列号：YP_005575778.1）等具有高度同源性，达100%。与其他双歧杆菌同源性较低，与角双歧杆菌DSM20098（Genbank序列号：ZP_04448625.1）同源性为44%，与短双歧杆菌杆菌DSM20213（Genbank序列号：ZP_06595526.1）同源性为41%。由WZX2特异性引物扩增出1196bp的片段（附1.2），编码一个391-aa的蛋白（附2.2），经BLASTx比对分析该序列为编码动物双歧杆菌乳亚种LPL-RH多糖重复单元转运子（polysaccharide repeat unit transport protein）合成的wzx基因序列。该序列与动物双歧杆菌乳亚种AD011（Genbank序列号：YP_002469467.1）和HN019（Genbank序列号：ZP_02963542.1）等具有100%同源性。与动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527（Genbank序列号：YP_006280514.1）的同源性为53%，与其他乳酸菌的同源性非常低，与保加利亚乳杆菌ATCC BAA-36（Genbank序列号：YP_813685.1）和约氏乳杆菌（Genbank序列号：ABM21412.1）的同源性分别为33%和36%。扩增到的两个wzx片段均与已报道的动物双歧杆菌乳亚种AD011等全基因组序列中的wzx基因具有非常高的保守性，据目前已报道的动物双歧杆菌乳亚种全基因组序列，该种eps基因簇均含有两个wzx，分别位于eps基因簇的两侧。目前乳酸菌的EPS输出机制并不十分清楚，有文献报道，Wzx（polysaccharide repeat unit transport protein）是一类膜整合蛋白家族，具有翻转酶（flippase）功能，将单糖单元从细胞膜的胞质面翻转到外周质空间，wzx缺失菌株会使O-unit中间产物在质膜内侧积累。

2.由WZY特异性引物扩增出920bp的片段（附1.3），编码一个305-aa的蛋白（附2.3），经BLASTx比对分析该序列为编码动物双歧杆菌乳亚种LPL-RH多糖重复单元聚合酶（Oligasaccharide repeat unitpolymerase）合成的wzy基因序列。该序列与动物双歧杆菌乳亚种AD011（Genbank序列号：YP_002469461.1）和CNCM I-2494（Genbank序列号：YP_005578569.1）等具有100%同源性。与动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527（Genbank序列号：YP_006280516.1）的同源性为98%，与其他乳酸菌的同源性非常低，与干酪乳杆菌CRF28（Genbank序列号：ZP_12634045.1）同源性为33%，和鼠李糖乳杆菌HN001（Genbank序列号：ZP_03212030.1）的同源性分别为28%。Wzy（oligosaccharide repeat unit polymerase）负责将Wzx转运出的重复单元聚合形成长链多糖分子。对Wzy的预测发现乳酸菌Wzy蛋白有9～14个跨膜螺旋，不同菌株来源的Wzy同源性很低。Wzy是阐释EPS生物合成的关键酶，在体外利用同位素标记的RU-PP-Und为底物，验证Wzy蛋白参与多糖重复单元的聚合。

3.WZZ特异性引物扩增到一个长约1497bp片段（附1.4），编码一个498-aa的蛋白（附2.4），经BLASTx比对分析该序列为编码动物双歧杆菌乳亚种LPL-RH多糖链长控制蛋白（Tyrosine-protein kinase）合成的wzz基因序列。该序列与动物双歧杆菌乳亚种AD011（Genbank序列号：YP_002469481.1）和BB-12（Genbank序列号：YP_005575809.1）的同源性高达100%，与青春双歧杆菌ATCC15703（Genbank序列号：YP_910221.1）的同源性为57%，与长双歧杆菌KACC91563（Genbank序列号：YP_005587807.1）的同源性为50%。Wzz（Chain length regulator）是一类Etk-like酪氨酸激酶，在多糖重复单元跨膜及聚合时作为辅助蛋白控制糖链长度。一种假设认为Wzz相当于分子计时器，控制Wzy活性，使其在聚合反应中平衡，另外一种假设认为起分子尺寸作用，控制Wzy与辅助蛋白状态控制糖链长度。

实施例3.动物双歧杆菌EPSa主链合成基因克隆及分析

1.引物设计

根据测序得到的序列比对结果，并参考动物双歧杆菌乳杆菌产EPS基因簇的各基因顺序，设计上下游引物（5’-GCGTATCTTTGGCTGTTTC-3’；5’-CAATGTGCTTAGGAGGAGG-3’）扩增基因簇并确定相关基因的顺序，确定双歧杆菌LPL-RH产EPS基因簇的基因组成及排列顺序。

2.PCR反应体系及条件

3.PCR产物纯化及测序

取1g琼脂糖加入1×TAE缓冲液100mL，加热融化后冷却至60℃，加入6μL染色液Gold view，倒入安装点样梳的凝胶槽内。待胶凝固后，取适量样品加入点样孔，在TAE缓冲液100V条件下电泳20min，在紫外灯下检验PCR产物纯度，将目的条带从凝胶上切下，纯化后的目的条带送至博迈德（北京）测序，获得的序列结果通过Blast进行分析。

4.生物信息学分析

相似性比较采用NCBI的BLAST软件在线分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。多序列比对采用ClustalW程序在线分析attp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw。

结果：

经过测序及结果分析表明其中包括8个与EPS生物合成相关基因如表2所示。

表2动物双歧杆菌乳亚种eps基因簇基因功能预测

扩增的8.4kb的基因簇结构图如图5所示。

ORF1：基因片段大小为1248bp（附1.5），编码一个415aa的蛋白质（附2.5），该基因编码的蛋白与许多糖核苷酸脱氢酶（uridine diphosphate glucose dehydrogenase）有同源性，与动物双歧杆菌乳亚种AD011（Genbank序列号：YP_002469466.1）、BI-04（Genbank序列号：YP_002968799.1）同源性为99%，与动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527（Genbank序列号：YP_006280521.1）同源性为96%，与长双歧杆菌35B（Genbank序列号：ZP_14373596.1）同源性为79%，与婴儿双歧杆菌ATCC1569（Genbank序列号：YP_002323822.1）同源性为73%，与乳酸乳球菌A76（Genbank序列号：YP_005874690.1）同源性为65%。这类蛋白参与糖核苷酸脱氢反应，生成UDP-葡萄糖醛酸，另可在差向异构酶作用下生成UDP-半乳糖醛酸，是某些EPS如黄原胶等的合成前体，前期研究表明菌株LPL-RH产生的EPS也含有糖醛酸，与该基因作用相关。

ORF2：基因片段大小为1062bp（附1.6），编码一个353aa的蛋白质（附2.6），该基因编码的蛋白与多糖合成相关蛋白（polysaccharide biosynthesis protein）有同源性，与动物双歧杆菌乳亚种AD011（Genbank序列号：YP_002469465.1）、BB-12（Genbank序列号：YP_005575785.1）同源性为100%，与动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527（Genbank序列号：YP_006280520.1）同源性为54%，与婴儿双歧杆菌ATCC1569（Genbank序列号：YP_002323545.1）同源性为34%，与干酪乳杆菌A2-362（Genbank序列号：ZP_12630852.1）同源性为33%，与植物乳杆菌WCFS1（Genbank序列号：YP_004889078.1）同源性为31%。这类蛋白参与多糖的生物合成。

ORF3：基因片段大小为765bp（附1.7），编码一个281aa的蛋白质（附2.7），该基因编码的蛋白与糖基转移酶（glycosyl transferase family protein）有同源性，与动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527（Genbank序列号：YP_006280519.1）同源性为96%，与德氏乳杆菌20072（Genbank序列号：ZP_16891230.1）同源性为49%。这类蛋白参与多糖合成中的糖基转移，对应EPSa中主链→6)-α-D-Glcp-(1→的糖基转移。

ORF4：基因片段大小为885bp（附1.8），编码一个295aa的蛋白质（附2.8），该基因编码的蛋白与糖基转移酶（glycosyl transferase family protein）有同源性，与动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527（Genbank序列号：YP_006280518.1）同源性为94%，与罗伊氏乳杆菌100-23（Genbank序列号：ZP_03072814.1）同源性为40%，与保加利亚乳杆菌ND02（Genbank序列号：YP_004034789.1）同源性为40%，与瑞士乳杆菌DPC4571（Genbank序列号：YP_001577965.1）同源性为38%。这类蛋白参与多糖合成中的糖基转移过程，特异性转移→3)-α-D-Galp-(1→残基，据旭日花研究发现双歧杆菌LPL-RH产生的EPSa中含有此种糖残基结构，该基因与此残基的合成相关。

ORF5：基因片段大小为894bp（附1.9），编码一个297aa的蛋白质（附2.9），该基因编码的蛋白与鼠李糖基转移酶（dTDP-LPL-RHamnosyl transferase,RfbF）有同源性，与动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527（Genbank序列号：YP_006280517.1）同源性为97%，与乳酸乳球菌CNCMI-1631（Genbank序列号：ZP_12676637.1）同源性为36%，与加氏乳杆菌MV-22（Genbank序列号：ZP_07711971.1）同源性为31%，与植物乳杆菌NC8（Genbank序列号：ZP_12890238.1）同源性为32%。这类蛋白参与多糖合成中的鼠李糖基转移过程，在双歧杆菌LPL-RH产生的EPSa中负责主链→6)-α-D-Man-(1→糖基转移。

ORF6：基因片段大小为1344bp（附1.10），编码一个448aa的蛋白质（附2.10），该基因编码的蛋白与重复单元聚合酶（oligosaccharide repeat unit polymerase，Wzy）有同源性。

ORF7：基因片段大小为1014bp（附1.11），编码一个337aa的蛋白质（附2.11），该基因编码的蛋白与糖基转移酶（glycosyltransferase）有同源性，与动物双歧杆菌动物亚种ATCC25527（Genbank序列号：YP_006280515.1）同源性为96%，与唾液乳杆菌GJ-24（Genbank序列号：ZP_12456259.1）同源性为40%，与嗜热链球菌LMD-9（Genbank序列号：YP_820799.1）同源性为33%。这类蛋白参与多糖合成中的糖基转移过程，参与EPSa主链→4)-α-D-Manf-(1→糖基转移。

ORF8：基因片段大小为888bp（附1.12），编码一个295aa的蛋白质（附2.12），该基因编码的蛋白与糖基转移酶（glycosyltransferase）有同源性，与动物双歧杆菌乳亚种HN019（Genbank序列号：ZP_02963534.1）同源性为100%，与没食子双歧杆菌动物亚种DSM20093（Genbank序列号：ZP_05965520.2）同源性为53%，与干酪乳杆菌zhang（Genbank序列号：YP_003789067.1）同源性为33%，与嗜热链球菌M18（Genbank序列号：ZP_12657424.1）同源性为32%。这类蛋白参与多糖合成中的糖基转移过程，负责EPSa中主链→4)-α-D-Glcp-(1→糖基转移。

结论：

通过从已知基因克隆双歧杆菌胞外多糖生物合成基因簇，获得与EPS糖链合成及转运相关基因wzx、wzy、wzz，并扩增到产糖双歧杆菌EPSa的主链合成相关基因，其中ORF3、4、5、7、8分别对应EPSa主链中葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基、甘露糖基和葡萄糖基转移，指导合成EPSa主链。

Claims

1.一种动物双歧杆菌胞外多糖基因簇中转运输出相关基因wzx、wzy、wzz，其特征在于所述基因簇的核苷酸序列见附1.1-1.4。

2.一种动物双歧杆菌胞外多糖基因簇中转运输出相关基因wzx、wzy、wzz编码的蛋白，其特征在于所述基因编码的氨基酸序列见附2.1-2.4。

3.一种动物双歧杆菌EPSa合成重复单元主链相关基因的核苷酸序列，见附1.5-1.12。

4.一种动物双歧杆菌EPSa合成重复单元主链相关基因编码的氨基酸序列，见附2.5-2.12。

5.权利要求1中胞外多糖合成转运基因，权利要求3中EPSa主链合成基因在筛选、改造产胞外多糖双歧杆菌的应用。