CN114515298A - 用于防治骨质疏松、提高骨密度的动物双歧杆菌及其应用 - Google Patents
用于防治骨质疏松、提高骨密度的动物双歧杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于防治骨质疏松、提高骨密度的动物双歧杆菌及其应用，属于生物医药领域。本发明发现动物双歧杆菌LPL‑RH具有抑制破骨细胞分化的功能，同时增加去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度，可用于预防和/或治疗骨质疏松，为骨质疏松症的治疗和/或预防提供了一种新的思路及方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于防治骨质疏松、提高骨密度的动物双歧杆菌及其应用。
背景技术
骨重塑是一个由成骨细胞和破骨细胞共同完成的动态过程，成骨细胞产生的骨基质量和破骨细胞的骨吸收之间的平衡对于正常的骨代谢至关重要。这一过程受到局部微环境中各种激素和细胞因子的严格调控，其损伤可导致骨病。各种因素直接或间接影响骨重建，导致骨吸收/骨形成失衡，是骨代谢相关疾病的典型特征，在类风湿关节炎、某些类型肿瘤中的骨转移和牙周炎中，破骨细胞数量过多或功能增加是导致骨吸收的重要原因。骨代谢的调节非常复杂，基因、环境、生活方式等因素都对骨代谢有一定的影响。此外，遗传因素在骨转换中发挥重要作用，占骨密度变化的70-80％。影响骨密度的细胞有成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和具有自身结构和作用的内衬细胞。破骨细胞是大型的多核细胞，与破骨细胞发生有关，并负责骨吸收。成骨细胞是单核骨形成细胞，负责骨形成和矿化，在机械刺激和启动重塑反应中发挥作用。
骨质疏松症(OP)是一种代谢性骨骼疾病，以骨量降低、骨微观结构破坏、骨脆性增加，易发生骨折为特征，是骨吸收/骨形成失衡典型症状。激素替代疗法被证明可以降低骨质疏松患者骨折的风险，然而，由于需要每天注射，大多数患者都不适应这种治疗方式。此外，有研究表明，激素替代疗法增加了肿瘤发生的可能性。因此，寻找其他方法来增加骨形成和保持骨强度是至关重要的。
益生菌参与消化系统的各种过程，例如消化、代谢、上皮细胞的先天免疫、消除病原体以及通过它们与人体肠道的粘附而在大脑和肠道之间进行交流。同时，益生菌还可通过增加抗体反应和抑制单核细胞增殖等方式而参加免疫过程。有研究发现，益生菌通过调节肠道菌群在缓解骨质疏松方面有较好的应用潜力。例如，专利CN201810414459.4公开了一种改善骨质疏松的植物乳杆菌AR495菌株，该植物乳杆菌AR495能够有效改善因去卵巢而引起的小鼠骨质疏松，经统计学分析可显著增加其骨小梁密度、骨小梁数目和骨小梁厚度，从而显著增加弹性模量以降低骨折风险。专利CN202010633953.7则公开了一种植物乳杆菌HFY15，该发明通过实验验证HFY15的补充可增加成骨标记基因的表达，抑制破骨基因的表达，刺激骨的形成，为预防和治疗骨质疏松症提供了一种新的有效策略。
目前，采用益生菌治疗骨质疏松、提高骨密度的研究较少，因此，亟需发现更多的治疗和/或预防骨质疏松效果更好的益生菌，为预防和/或治疗骨质疏松提供新的思路或有效策略。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种用于防治骨质疏松、提高骨密度的动物双歧杆菌LPL-RH。本发明发现动物双歧杆菌LPL-RH具有抑制破骨细胞分化的功能，同时增加去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度，为骨质疏松症的治疗和/或预防提供了一种新的思路及方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种动物双歧杆菌LPL-RH在制备预防和/或治疗骨质疏松、提高骨密度的产品中的应用。
具体地，所述的动物双歧杆菌LPL-RH的保藏编号为CGMCC No.4599，保藏时间为2011年02月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。此菌种已于2011年8月17日在中国专利CN201110054259.0中公开，并于2012年11月28日获得授权。
具体地，所述的产品包含上述动物双歧杆菌LPL-RH。
进一步具体地，所述的产品为保健品、食品或药物。
进一步具体地，所述保健品的类型包括但不限于：药酒、胶囊、片剂、冲剂、茶制品、果汁、水果醋、口服液、软胶囊、颗粒、发酵奶制品、发酵谷制品、发酵豆制品、蜜膏、露剂、散剂、鲜汁、代餐粉等。
所述保健品还包括保健品添加剂。
所述保健品添加剂包括但不限于：香精香料、着色剂、甜味剂、酸味剂、增鲜剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、抗氧剂、营养强化剂等。
进一步具体地，所述的食品的类型包括但不限于：饼干、乳制品、代餐品、肉制品、酱汁、烘焙食品、酸奶、冰淇淋、发酵谷类基产品、果汁、米酒、糖果、糖浆、罐头食品、腌制品、调味品、豆制品、巧克力、馅料、茶制品、膨化食品等。
所述的食品还包括食品添加剂。
所述的食品添加剂包括但不限于防腐剂、酸度调节剂、抗结剂、消泡剂、抗氧化剂、漂白剂、膨松剂、胶基糖果中基础剂物质、着色剂、护色剂、乳化剂、酶制剂、增味剂、面粉处理剂、被膜剂、水分保持剂、营养强化剂、防腐剂、稳定剂和凝固剂、甜味剂、增稠剂、食品用天然香料、食品用合成香料等。
进一步具体地，所述的药物的剂型根据给药方式包括但不限于：经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型。
所述的经胃肠道给药剂型包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、油剂。
所述的非经胃肠道给药剂型包括但不限于：注射给药剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型、腔道给药剂型。
所述的注射给药剂型包括但不限于：静脉注射剂、肌内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、腔内注射剂。
所述的呼吸道给药剂型包括但不限于喷雾剂、气雾剂、粉雾剂。
所述的皮肤给药剂型包括但不限于外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂。
所述的粘膜给药剂型包括但不限于滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂。
所述的腔道给药剂型包括但不限于栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂及滴丸剂。
所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
所述的药学上可接受的辅料包括但不限于溶剂、乳化剂、崩解剂、增溶剂、抗氧剂、pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂、稀释剂、润湿剂、粘合剂、成膜剂等。
另一方面，本发明提供了上述动物双歧杆菌LPL-RH的全细胞产物在制备预防和/或治疗骨质疏松、提高骨密度的产品中的应用。
具体地，所述的动物双歧杆菌LPL-RH的保藏编号为CGMCC No.4599，保藏时间为2011年02月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。此菌种已于2011年8月17日在中国专利CN201110054259.0中公开，并于2012年11月28日获得授权。
具体地，所述的全细胞产物包括但不限于：发酵液、培养液、细胞裂解液、细胞裂解液的上清部分、细胞裂解液的沉淀部分等。需要说明的是，在未来的技术发展中对于全细胞产物的操作方法及其具体产物类型的新增技术由于未脱离本发明的发明点，也应当在本发明的上述要求保护的范围之内。
具体地，所述的产品包含上述动物双歧杆菌LPL-RH的全细胞产物。
进一步具体地，所述的产品为保健品、食品或药物。
进一步具体地，所述保健品的类型包括但不限于：药酒、胶囊、片剂、冲剂、茶制品、果汁、水果醋、口服液、软胶囊、颗粒、发酵奶制品、发酵谷制品、发酵豆制品、蜜膏、露剂、散剂、鲜汁、代餐粉等。
所述保健品还包括保健品添加剂。
所述保健品添加剂包括但不限于：香精香料、着色剂、甜味剂、酸味剂、增鲜剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、抗氧剂、营养强化剂等。
进一步具体地，所述的食品的类型包括但不限于：饼干、乳制品、代餐品、肉制品、酱汁、烘焙食品、酸奶、冰淇淋、发酵谷类基产品、果汁、米酒、糖果、糖浆、罐头食品、腌制品、调味品、豆制品、巧克力、馅料、茶制品、膨化食品等。
所述的食品还包括食品添加剂。
所述的食品添加剂包括但不限于防腐剂、酸度调节剂、抗结剂、消泡剂、抗氧化剂、漂白剂、膨松剂、胶基糖果中基础剂物质、着色剂、护色剂、乳化剂、酶制剂、增味剂、面粉处理剂、被膜剂、水分保持剂、营养强化剂、防腐剂、稳定剂和凝固剂、甜味剂、增稠剂、食品用天然香料、食品用合成香料等。
进一步具体地，所述的药物的剂型根据给药方式包括但不限于：经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型。
所述的经胃肠道给药剂型包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、油剂。
所述的非经胃肠道给药剂型包括但不限于：注射给药剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型、腔道给药剂型。
所述的注射给药剂型包括但不限于：静脉注射剂、肌内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、腔内注射剂。
所述的呼吸道给药剂型包括但不限于喷雾剂、气雾剂、粉雾剂。
所述的皮肤给药剂型包括但不限于外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂。
所述的粘膜给药剂型包括但不限于滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片及贴膜剂。
所述的腔道给药剂型包括但不限于栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂及滴丸剂。
所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
所述的药学上可接受的辅料包括但不限于溶剂、乳化剂、崩解剂、增溶剂、抗氧剂、pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂、稀释剂、润湿剂、粘合剂、成膜剂等。
又一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗骨质疏松、提高骨密度的产品，所述的产品包括上述动物双歧杆菌LPL-RH和/或动物双歧杆菌LPL-RH的全细胞产物。
具体地，所述的动物双歧杆菌LPL-RH的保藏编号为CGMCC No.4599，保藏时间为2011年02月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。此菌种已于2011年8月17日在中国专利CN201110054259.0中公开，并于2012年11月28日获得授权。
本发明中所述的药物、食品、保健品的制备方法可采用本领域目前现有的以及未来研发出的相关制备方法。应当明确的是采用何种具体制备方法并不能作为对本申请保护范围的限定。无论采用目前已有的还是未来研发的制备方法，只要包含上述微生物，均在本申请要求保护的范围内。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明发现动物双歧杆菌LPL-RH具有抑制破骨细胞分化的功能，同时增加去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度，可用于预防和/或治疗骨质疏松，为骨质疏松症的治疗和/或预防提供了一种新的思路及方法。
(2)本发明所述的动物双歧杆菌LPL-RH从广西巴马地区百岁长寿老人肠道筛选分离得到，安全且无任何毒副作用。
附图说明
图1为不同乳杆菌抑制破骨细胞分化检测结果图。
图2为动物双歧杆菌LPL-RH发酵液、胞内物对RAW264.7细胞增殖的检测结果图。
图3为RAW264.7细胞向破骨细胞分化染色及破骨细胞形成数量检测结果图。
图4为Cathepsin K、TRAP和MMP-9的mRNA相对表达量检测结果图。
图5为骨组织中OPG和RANKL的mRNA相对表达量检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验材料
1.实验用菌株及细胞、动物
采用动物双歧杆菌PLP-RH(保藏编号为CGMCC No.4599)为本发明实验组菌株，采用动物双歧杆菌CGMCC1353、动物双歧杆菌CGMCC2899、植物乳杆菌CGMCC1.573、长双歧杆菌CGMCC1.5082、副干酪乳杆菌CGMCC1.570、干酪乳杆菌CGMCC1.575、发酵乳杆菌CGMCC1.2029、鼠李糖乳杆菌CGMCC14007和罗伊氏乳杆菌CICC6226作为对照组菌株。
RAW264.7细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，中国。
SPF级雌性Wistar大鼠30只，体重220-240g，购于北京维通利华实验动物有限公司，将大鼠置于22±2℃环境控制的动物实验室中，进行12小时光/暗循环，并给予标准鼠粮和自由饮水。
2.主要试剂和仪器
DMEM培养基、胰蛋白酶、PBS缓冲液、RANKL(美国GIBCO)；MRS培养基(青岛海博，中国)；胎牛血清(Cellmax)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液(南京建成生物工程研究所，中国)；CCK8检测试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；Trizol(Invitrogen)；异丙醇、三氯乙酸、无水乙醇和DEPC水均购自生工(上海，中国)；骨钙素(BCG)、碱性磷酸酶(ALP)及钙(Ca)测定试剂盒均购自沈阳万类生物科技有限公司；SYBGREEN试剂盒、TB Green Premix Ex Taq II(宝生物工程(大连)有限公司)。
空气恒温摇床KYC-100C(上海福马实验设备有限公司)、生物安全柜(赛默飞世尔科技公司)、离心机(贝克曼柯尔特公司)、Nanodrop 2000(赛默飞世尔科技公司)、Instron5900电子万能材料实验机、小动物全自动高分辨率X光机(bruker)、ABI7500实时荧光定量PCR仪(赛默飞，美国)、倒置显微镜(奥林巴斯，日本)。
3.数据统计分析
所有数据以均值±标准差表示。使用统计软件SPSS3.0对数据进行单因素方差分析，当P<0.05有统计学差异。
实施例1.动物双歧杆菌LPL-RH抑制破骨细胞分化
将活化后的各乳酸菌(动物双歧杆菌PLP-RH、动物双歧杆菌CGMCC1353、动物双歧杆菌CGMCC2899、植物乳杆菌CGMCC1.573、长双歧杆菌CGMCC1.5082、副干酪乳杆菌CGMCC1.570、干酪乳杆菌CGMCC1.575、发酵乳杆菌CGMCC1.2029、鼠李糖乳杆菌CGMCC14007和罗伊氏乳杆菌CICC6226)均按照1×107CFU/mL的初始密度接种至MRS液体培养基中，培养16h，取1mL PBS培养液4000r/min离心10min，取上清，再用0.22μm滤膜过滤，然后用NaOH调节pH值至7.0即为所用发酵液。将菌沉淀用1mL PBS重悬后，100℃水浴中热灭活5min，死菌超声破碎45min，4000r/min离心10min，取上清即为胞内物。
将RAW264.7细胞以1×105cell/mL的浓度铺于加细胞爬片的12孔板中，分组：每株乳酸菌实验分组均相同：第1组为RANKL诱导组，第2组为RANKL+发酵液(体积占培养基2％)，第3组为RANKL+胞内物(体积占培养基2％)，各组均以50ng/mL RANKL诱导5d，第2组和第3组于同时加入相应成分共培养。第5d时，取出细胞爬片，按照抗酒石酸酸性磷酸酶染液试剂盒操作说明书进行染色，倒置显微镜观察拍照。每个处理条件拍6个随机视野，对细胞核数量≥2个的多核破骨细胞进行计数，结果如图1所示。
根据图1可知，本发明所述的动物双歧杆菌LPL-RH发酵液及胞内物抑制破骨细胞分化的能力明显优于其他对比菌株。
实施例2.动物双歧杆菌LPL-RH抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化
1.动物双歧杆菌LPL-RH发酵液及胞内物的制备
将活化后的动物双歧杆菌PLP-RH按照1×107CFU/mL的初始密度接种至MRS液体培养基中，培养16h，取1mL PBS培养液4000r/min离心10min，取上清，再用0.22μm滤膜过滤，然后用NaOH调节pH值至7.0即为所用发酵液。将菌沉淀用1mL PBS重悬后，100℃水浴中热灭活5min，死菌超声破碎45min，4000r/min离心10min，取上清即为胞内物。
2.细胞活力测定
将RAW264.7细胞以1×105cell/mL的浓度铺于96孔板中，以DMEM培养基进行培养，分组：第1组为RANKL诱导组，第2组为RANKL+发酵液(体积占培养基2％)，第3组为RANKL+胞内物(体积占培养基2％)，各组均以50ng/mL RANKL诱导5d，第2组和第3组于同时加入相应成分共培养，第5d，每孔加入10μL CCK8试剂，于37℃培养箱避光孵育1h后在450nm波长下测吸光度。检测结果如图2所示。
根据图2可知，在动物双歧杆菌LPL-RH的菌数量为107CFU/mL时，发酵液、胞内物和RAW264.7细胞共培养对细胞增殖没有显著性影响。
3.细胞形态学观察和计数
将RAW264.7细胞以1×105cell/mL的浓度铺于加细胞爬片的12孔板中，细胞分组及处理方法同上述步骤2。第5d时，取出细胞爬片，按照抗酒石酸酸性磷酸酶染液试剂盒操作说明书进行染色。倒置显微镜观察拍照。每个处理条件拍6个随机视野，对细胞核数量≥2个的多核破骨细胞进行计数。检测结果如图3所示。
采用TRAP染色法，在高倍光学显微镜下随机取6个视野并进行计数，细胞核数目≥2个且TRAP染色阳性视为破骨细胞。模型组、发酵液组及胞内物组向破骨细胞分化的数量分别为54±8、23±5和14±4个。根据图3检测结果可知，与模型组相比较，发酵液组及胞内物组均能够抑制破骨细胞的分化，差异有统计学意义。
4.实时荧光定量PCR
MMP-9、TRAP和cathepsin K都是破骨细胞的关键标志物，在骨吸收中发挥重要作用。cathepsin K是吸收陷窝中最丰富的组织蛋白酶，在有机基质降解和TRAP裂解成其激活形式中起着至关重要的作用。Cathepsin K和TRAP基因的破坏已被证明会导致骨质疏松症。MMP-9也在有机基质的再吸收中发挥作用，因为这种蛋白水平的升高存在于再吸收陷窝中。因此，本申请进一步采用qPCR检测本发明所述的动物双歧杆菌LPL-RH对MMP-9、TRAP和cathepsin K的作用。
将RAW264.7细胞以1×105cell/mL的浓度铺于12孔板中，细胞分组及处理方法同上述步骤2。在与不同组分共培养5d后，吸弃培养液，PBS清洗三遍，每孔中加入1mL Trizol，轻轻吹打细胞，常规方法提取细胞的RNA，反转录获得cDNA，进行实时荧光定量检测。其中，所用的引物序列如下表1所示。检测结果如图4所示。
表1
由图4可知，通过破骨细胞特异性基因表达的检测，进一步表明了动物双歧杆菌LPL-RH的作用，通过RT-PCR检测组织蛋白酶K(Cathepsin K)、TRAP和MMP-9的表达，与模型组相比，发酵液及胞内物组抑制了所有三个主要破骨细胞特异性标记物基因的表达。这表明，动物双歧杆菌LPL-RH发酵液和胞内物均能显著的抑制破骨细胞的分化，而此抑制作用是通过抑制MMP-9、TRAP和cathepsin K等关键破骨基因表达实现的。
实施例3.动物双歧杆菌LPL-RH提高去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度
1.实验动物分组
大鼠适应性喂养7天后按体重随机分为假手术组、模型组和治疗组，每组10只。除假手术组外，其他两组采用去卵巢法复制骨质疏松模型。1％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，于无菌条件下在背侧正中切口，进入腹腔在肾下极附近找到卵巢，用4号线结扎并摘除双侧卵巢，分层缝合切口。假手术组的术式相同，但不摘除卵巢。术后康复两周，治疗组每天灌胃浓度为108-109CFU/mL的动物双歧杆菌LPL-RH株1mL，连续治疗18周，假手术组和模型组以同体积的灭菌水灌胃。
2.标本采集与检测
(1)体重检测
大鼠体重检测如下表2所示。
表2.动物双歧杆菌LPL-RH对去卵巢骨质疏松大鼠体重的影响
| 组别 | 初始体重g | 终末体重g | 增加体重g |
| 假手术组 | 226.60±8.09 | 316.00±9.97 | 89.40±13.12 |
| 模型组 | 231.93±10.03 | 323.00±13.12 | 91.07±7.81 |
| 治疗组 | 233.93±11.94 | 319.67±22.80 | 85.73±28.30 |
由表2可见，各组大鼠初始体重差异无统计学意义，实验结束后，体重增加无明显差异(P<0.05)，没有观察到胃肠道紊乱的状况，即本申请所述的动物双歧杆菌LPL-RH不影响大鼠的生长和发育。
(2)股骨X线扫描
灌胃结束后，所有大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死，取出每只大鼠左侧股骨，剃除软骨组织，用X线机测定股骨全长、中点和股骨远心端骨密度。检测结果如下表3所示。
表3.动物双歧杆菌LPL-RH对大鼠股骨骨密度的影响
注：*与假手术组比较，P<0.05，#与模型组相比，P<0.05。
由表3可知，模型组股骨全骨、中点及远心端骨密度均低于假手术组(p<0.05)，造模成功。动物双歧杆菌LPL-RH治疗组的骨密度升高，全骨骨密度及远心端骨密度与模型组相比差异有统计学意义(p<0.05)。
(3)股骨生物力学测定
取小鼠右侧股骨，剃除软骨组织，采用三点弯曲试验法对力学参数进行测试。应用Instron 5900电子万能材料实验机，将股骨水平放置于跨距为6mm的支架上，然后以1mm/min的速度垂直向下挤压股骨中段，直至股骨折断，记载载荷-变形曲线，计算以下骨生物力学参数：1)最大弯曲载荷：骨断裂前所承受的最大载荷，单位为牛顿(N)。2)最大弯曲应力：在所考察的截面某一点单位面积上的最大弯曲内力，单位MPa。3)弹性模量：衡量物体抵抗弹性变形能力大小的尺度，单位MPa。检测结果如下表4所示。
表4.动物双歧杆菌LPL-RH对大鼠股骨生物力学的影响
| 组别 | 最大弯曲载荷(N) | 最大弯曲应力(MPa) | 弹性模量(GPa) |
| 假手术组 | 131±13.3 | 134±1.7 | 13.6±1.1 |
| 模型组 | 104±12.2** | 110±1.3** | 8.4±0.3** |
| 治疗组 | 125±7.8# | 128±1.1# | 12.5±0.9# |
注：**与假手术组比较，P<0.01，#与模型组相比，P<0.05。
由表4可知，股骨三点弯曲实验中，模型组与假手术组相比，最大弯曲载荷、最大弯曲应力、弹性模量均有明显差异(p<0.01)，治疗组与模型组相比较，最大弯曲载荷、最大弯曲应力、弹性模量显著提高(p<0.05)。
(4)盲肠称重及内容物检测
每组取6只动物的盲肠称重，检测内容物pH值。采用气相色谱法测定内容物短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的浓度。检测结果如下表5所示。
表5.动物双歧杆菌LPL-RH对大鼠结肠内容物pH值及短链脂肪酸的影响
| 组别 | pH | 乙酸 | 丙酸 | 丁酸 |
| 假手术组 | 7.56±0.65 | 36.98±8.57 | 16.41±1.72 | 7.67±1.55 |
| 模型组 | 7.63±0.33 | 41.67±12.57 | 15.03±1.82 | 6.89±1.92 |
| 治疗组 | 7.60±0.42 | 38.45±7.98 | 25.83±2.93* | 15.67±1.52** |
注：*与模型组比较，P<0.05，**与模型组相比，P<0.01。
由表5可知，动物双歧杆菌LPL-RH对肠道内容物pH值没有影响，对乙酸含量没有产生明显影响，但是丙酸及丁酸水平与模型组相比差异显著，说明外源补充LPL-RH益生菌能够提高肠道丙酸、丁酸的代谢水平。
(5)血清生化指标检测
将提前备好的大鼠血清骨钙素(BCG)试剂盒、大鼠碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、大鼠Ca试剂盒和血清样本放入EP管中，放入全自动生化分析仪中，按照说明书要求进行操作，测定各组大鼠血清样本中的上述生化水平并记录测量结果。检测结果如下表6所示。
表6.动物双歧杆菌LPL-RH对大鼠血清生化指标的影响
| 组别 | BCG(mg/L) | ALP(μml/L) | Ca(mmol/L) |
| 假手术组 | 1.75±0.26 | 160.18±11.7 | 13.69±2.14 |
| 模型组 | 0.62±0.21** | 100.20±14.3** | 5.44±1.13** |
| 治疗组 | 1.42±0.32## | 156.34±13.90## | 9.56±1.9## |
注：**与假手术组比较，P<0.01，##与模型组相比，P<0.01。
由表6可知，血清中BCG、ALP、Ca浓度检测发现，模型组明显低于假手术组(P<0.01)，治疗组补充动物双歧杆菌LPL-RH后，BCG、ALP、Ca浓度明显升高，与模型组相比差异显著(P<0.01)。
(6)实时荧光定量PCR
取材取下的各组大鼠左侧股骨用液氮速冻后研磨，常规方法提取细胞的RNA，反转录获得cDNA，进行实时荧光定量检测。引物如下表7所示。
表7
检测结果如图5，由图5可知，在模型组，OPG基因表达量明显低于其余两组，RANKL基因表达量明显高于另外两组(p<0.05)；治疗组，OPG基因表达量较模型组组明显升高(p<0.05)且趋向于假手术组，RANKL基因表达量较模型组明显降低且趋向于假手术组。这表明动物双歧杆菌LPL-RH能通过调节OPG/RANK/RANKL轴，影响OPG和RANKL基因的表达，从而发挥抗骨质疏松作用。
本发明通过去卵巢大鼠骨质疏松模型证明，补充动物双歧杆菌LPL-RH能够增加股骨密度，促进肠道短链脂肪酸代谢，提高血清中BCG、ALP、Ca浓度，并且本发明发现动物双歧杆菌LPL-RH提高了OPG表达，降低了RANKL基因的表达，从而发挥抗骨质疏松作用，这为骨质疏松的防治提供了新的思路和候选菌株。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨美华生物技术股份有限公司
<120> 用于防治骨质疏松、提高骨密度的动物双歧杆菌及其应用
<130> 20220307
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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gtcatccagt ttggtgtcgc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 8
ataccaggaa atgagcttga caaag 25
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<212> DNA
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<400> 9
acaatgaaca agtggctgtg ctg 23
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 10
gggtttctgg gtcataatgc aag 23
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<212> DNA
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gcagcatcgc tctgttcctg ta 22
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 12
gcatgagtca ggtagtgctt ctgtg 25
Claims (15)
1.一种动物双歧杆菌LPL-RH在制备预防和/或治疗骨质疏松、提高骨密度的产品中的应用，其特征在于：所述的动物双歧杆菌LPL-RH的保藏编号为CGMCC No.4599，保藏时间为2011年02月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的产品包含动物双歧杆菌LPL-RH。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的产品为保健品、食品或药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述保健品的类型包括：药酒、胶囊、片剂、冲剂、茶制品、果汁、水果醋、口服液、软胶囊、颗粒、发酵奶制品、发酵谷制品、发酵豆制品、蜜膏、露剂、散剂、鲜汁或代餐粉。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的食品的类型包括：饼干、乳制品、代餐品、肉制品、酱汁、烘焙食品、酸奶、冰淇淋、发酵谷类基产品、果汁、米酒、糖果、糖浆、罐头食品、腌制品、调味品、豆制品、巧克力、馅料、茶制品或膨化食品。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物的剂型根据给药方式包括但不限于：经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的经胃肠道给药剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或油剂；所述的非经胃肠道给药剂型包括：注射给药剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型或腔道给药剂型。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的药学上可接受的辅料包括溶剂、乳化剂、崩解剂、增溶剂、抗氧剂、pH调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂、稀释剂、润湿剂、粘合剂或成膜剂。
10.一种动物双歧杆菌LPL-RH的全细胞产物在制备预防和/或治疗骨质疏松、提高骨密度的产品中的应用，其特征在于：所述的动物双歧杆菌LPL-RH的保藏编号为CGMCCNo.4599，保藏时间为2011年02月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的全细胞产物包括：发酵液、培养液、细胞裂解液、细胞裂解液的上清部分和/或细胞裂解液的沉淀部分。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的产品包含动物双歧杆菌LPL-RH的全细胞产物。
13.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的产品为保健品、食品或药物。
14.一种预防和/或治疗骨质疏松、提高骨密度的产品，其特征在于：所述的产品包括动物双歧杆菌LPL-RH和/或动物双歧杆菌LPL-RH的全细胞产物。
15.根据权利要求14所述的产品，其特征在于：所述的动物双歧杆菌LPL-RH的保藏编号为CGMCC No.4599，保藏时间为2011年02月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
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