CN103757035B - 鼠灰链霉菌amp脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法 - Google Patents

鼠灰链霉菌amp脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法。该方法以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆入表达载体pKLAC1构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物筛选出多拷贝转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。本发明首次在乳酸克鲁维酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，可应用于食品、医药等领域。

Description

鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法
技术领域
本发明涉及AMP脱氨酶基因的真核表达，具体涉及一种鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法及其表达产物的应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
AMP脱氨酶，英文名为AMP deaminase，简写为AMPD，是一种氨基水解酶，其可催化AMP使其脱去氨基生成肌苷酸（IMP）和NH3，IMP在食品以及制药等领域中有重要应用。另外，AMP脱氨酶是嘌呤核苷酸代谢循环中的三种主要酶类之一，对于维持机体免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脱氨酶是工业生产中一种重要的酶。
AMP脱氨酶广泛存在于各种生物体内。其最早由鼠骨骼肌制备，随后又由人红血细胞制备，目前工业化生产中通常由酵母、霉菌等微生物发酵产AMP脱氨酶，但是在酶的提取纯化、酶活性以及稳定性等方面存在诸多问题。因此，利用DNA重组技术，将微生物来源的AMP脱氨酶基因在特定宿主中进行重组表达，可以有效改善上述问题。现在国内关于AMP脱氨酶基因重组表达的研究从未报道过，国外关于该酶的重组表达的研究较少，仅在申请号为CN200580013789.3的专利“放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用”（申请人：天野酶株式会社）中报道过一次。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本申请人经过研究改进，提供一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法。本发明首次在乳酸克鲁维酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定。
本发明的技术方案如下：
鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，是以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆入表达载体pKLAC1构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物筛选出多拷贝转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
具体的，所述方法步骤如下：
（1）鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端分别引入XhoI和BglII酶切位点，纯化回收PCR产物；
（2）重组表达载体的构建
将表达载体pKLAC1和步骤（1）所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；
（3）线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选
提取步骤（2）所得阳性克隆菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyceslactis GG799，使用步骤（1）所述引物对筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物进行PCR筛选出多拷贝转化子；
（4）重组酶在GG799中的表达
将步骤（3）筛选到的多拷贝转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2%的接种量接种至YPD培养基，于30℃、200r/min条件下进行液体发酵培养120h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
优选地，步骤（1）所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus）MCCCNo.1A01641。
本发明还提供了上述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。
本发明的有益技术效果在于：
本发明首次以鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因组为模板，通过重组载体pKLAC1-AMPD的构建，转化，阳性克隆转化子和多拷贝转化子的筛选，液体发酵等步骤及其工艺条件参数的精心分析和优化，在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis GG79）中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶。实验结果显示，本发明制备得到的重组AMP脱氨酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础，可应用于食品、医药等领域。
附图说明
图1为实施例2中重组表达载体pKLAC1-AMPD酶切验证电泳图。
图2为实施例4中Kluyveromyces lactis GG79重组菌不同发酵时间的酶活变化趋势图。
具体实施方式
以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。
以下实施例所涉及实验材料如下：
菌株：鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus）购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC），保藏编号MCCC No.1A01641，以下简称鼠灰链霉菌MCCC1A01641；E.coli JM109购自大连宝生物工程有限公司；Kluyveromyces lactisGG799、pKLAC1均购自New EnglandBiolabs公司。
所涉及其他试剂及试剂盒均为国产或进口商品。
实施例1鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
以鼠灰链霉菌MCCC1A01641基因组为模板，设计引物对AMPDF3/AMPDR3特异性扩增鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因，在其两端分别加入XhoI酶切位点和BglII酶切位点，引物对AMPDF3/AMPDR3序列如下：AMPDF3：5’-GTTCTCGAG GCGCCGCCGCCCCGGCAG-3’(SEQID NO:1)；AMPDR3：5’-GAAGATCTTCACCCCCGGGCGTGCGCCC-3’(SEQ ID NO:2)；
纯化回收PCR产物。
实施例2重组表达载体pKLAC1-AMPD的构建
将载体pKLAC1和实施例1所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，切胶回收纯化，酶切产物于16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109，提取pKLAC1-AMPD-JM109菌株质粒，用XhoI和BglII双酶切验证，筛选出pKLAC1-AMPD-JM109阳性菌株。重组表达载体pKLAC1-AMPD酶切验证电泳图如图1所示。
实施例3线性化质粒pKLAC1-AMPD对GG799的电转化以及转化子的筛选
提取实施例2所得pKLAC1-AMPD-JM109阳性菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyces lactis GG799，涂布YCB平板，于3～5天后挑取单菌落检测，通过蜗牛酶法提取重组子染色体基因组，使用特异性引物AMPDF3/AMPDR3进行PCR验证，从而得到阳性克隆转化子；然后利用pKLAC1载体自带的通用引物进行PCR以筛选出多拷贝转化子，所述通用引物序列如表1所示：
表1pKLAC1载体通用引物序列
实施例4重组酶在GG799中的表达
将实施例3筛选到的多拷贝转化子接种至30ml YPD培养基中培养24h（种子培养），将所得种子液以体积比2%的接种量接种至50ml YPD培养基中，于30℃、200r/min条件下进行液体发酵培养，在不同时间取样，通过分光光度法检测酶活。Kluyveromyces lactisGG799重组菌不同发酵时间酶活变化趋势图如图2所示。由图2可知，当发酵时间在120h时，酶活达到最大，约为220U/ml因此，本发明Kluyveromyces lactis GG799重组菌最佳发酵时间为120h。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端分别引入XhoI和BglII酶切位点，纯化回收PCR产物；
(2)重组表达载体的构建
将表达载体pKLAC1和步骤(1)所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；
(3)线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选
提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyces lactisGG799，使用步骤(1)所述引物对筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物进行PCR筛选出多拷贝转化子；
(4)重组酶在GG799中的表达
将步骤(3)筛选到的多拷贝转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2％的接种量接种至YPD培养基，于30℃、200r/min条件下进行液体发酵培养120h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
2.根据权利要求1所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于：步骤(1)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)MCCCNo.1A01641。
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