CN102453753A - 一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法。本发明解决传统的蜡样芽孢杆菌检测方法费时费力、灵敏度低以及现有的基因检测技术必须进行预增菌，无法快速检测原料乳中蜡样芽孢杆菌并且易污染的问题。检测方法：一、对待检测的原料乳进行脱脂处理；二、加入EDTA-Na溶液进行水浴；三、过滤水浴后的脱脂乳；四、收集洗脱液；五、提取菌体DNA，并进行Real Time RT-PCR检测。本发明操作简单；不需要预增菌，具有快速的优点；本发明能够快速过滤原料乳中的菌体；本发明对蜡样芽孢杆菌的致病基因进行了引物设计，针对性强、特异性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测原料乳中细菌的方法。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种革兰式阳性菌，能形成芽孢，因此广泛存在于自然界中，其中一些菌株极易污染食物从而引起食物中毒，特别是在蛋白质和碳水化合物含量丰富的食品中，如肉类、米饭中，尤其是原料乳和乳制品中。
原料乳作为一种广泛食用并且很多乳制品加工的原辅料，是人类非常理性的营养食品之一，随着人们生活水平的逐步提高，人们对乳及乳制品的需求也在以较高的速度增长，然而由于蜡样芽孢杆菌对原料乳的污染造成人群食物中毒的事件却频频发生。因此，为提高食品的安全性，对原料乳及乳制品中致病性蜡样芽孢杆菌的检测势在必行。
传统的检测蜡样芽孢杆菌的方法主要采用生化方法，这种方法费时费力，且灵敏度不高；随着科学技术的发展，现在已经建立了分子生物学检测水平的基因检测技术，如PCR和LAMP技术，但这些技术大都采用预增菌来获得足够的菌体，在预增菌步骤后再进行PCR检测，能够达到很低的检出限，然而预增菌步骤一般需要10-14h，耗时长，增加了检测时间及检测成本，并且LAMP技术极易污染，不能保证结果的准确度。
随着我国乳制品行业的快速发展，原料乳及乳制品的安全性也受到越来越多的重视。因此，现在急需一种能够快速检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决传统的蜡样芽孢杆菌检测方法费时费力、灵敏度低以及现有的基因检测技术必须进行预增菌，无法快速检测原料乳中蜡样芽孢杆菌并且易污染的问题，而提供的一种快速检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法。
本发明一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法按以下步骤实现：一、将待检测的原料乳离心进行脱脂；二、将脱脂乳与EDTA-Na溶液以5-7∶1的比例向脱脂乳中加入体积浓度为60％的EDTA-Na溶液，在37℃的温度下水浴20-30min；三、将水浴后的样品进行无菌过滤；四、用生理盐水洗脱滤膜上的菌体，离心2次后弃掉上清，收集菌体；五、利用细菌DNA提取试剂盒提取菌体基因组DNA作为模板，进行Real Time RT-PCR检测，根据扩增曲线和融解曲线进行分析；即得到检测结果；其中步骤五中20ul反应体系由10ul的2×SYBR buffer、2.0ul的DNA模板、1.0ul的引物和7.0ul的灭菌双蒸水组成；扩增反应条件为预变性95℃30s，变性95℃5s，退火60℃35s，共40个循环；蜡样芽孢杆菌上游引物为5’-AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3’，下游引物为5’-GGCTTATTCGCTATGCG-3’。
本发明采用的蜡样芽孢杆菌引物为根据蜡样芽孢杆菌肠毒素基因(entFM)设计的特异性引物。
本发明操作简单、省时，检测的全部操作时间在5h以内；本发明不需要预增菌，具有快速的优点；本发明采用离心脱脂后用EDTA盐溶液处理原料乳中的蛋白质，鼠酪蛋白胶束解离成小分子单体，能够快速过滤原料乳中的菌体；本发明对蜡样芽孢杆菌的致病基因进行了引物设计，针对性强、特异性好。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法按以下步骤实现：一、将待检测的原料乳离心进行脱脂；二、将脱脂乳与EDTA-Na溶液以5-7∶1的比例向脱脂乳中加入体积浓度为60％的EDTA-Na溶液，在37℃的温度下水浴20-30min；三、将水浴后的样品进行无菌过滤；四、用生理盐水洗脱滤膜上的菌体，离心2次后弃掉上清，收集菌体；五、利用细菌DNA提取试剂盒提取菌体基因组DNA作为模板，进行Real Time RT-PCR检测，根据扩增曲线和融解曲线进行分析；即得到检测结果；其中步骤五中20ul反应体系由10ul的2×SYBR buffer、2.0ul的DNA模板、1.0ul的引物和7.0ul的灭菌双蒸水组成；扩增反应条件为预变性95℃30s，变性95℃5s，退火60℃35s，共40个循环；蜡样芽孢杆菌上游引物为5’-AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3’，下游引物为5’-GGCTTATTCGCTATGCG-3’。
本实施方式中EDTA-Na溶液为市售的常规试剂。
本实施方式无扩增曲线说明检测的原料乳中不含蜡样芽孢杆菌；有扩增曲线说明被检测的原料乳中含有蜡样芽孢杆菌。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中离心是在3000g的条件下离心20min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中将脱脂乳与EDTA-Na溶液以6∶1的比例向脱脂乳中加入体积浓度为60％的EDTA-Na溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中脱脂乳在37℃的温度下水浴25min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中水浴后的脱脂乳利用0.22um孔径的蔡氏滤器进行无菌过滤。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中洗脱液是在9000g的条件下离心15min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法按以下步骤实现：一、将待检测的原料乳进行脱脂：将待测原料乳在3000g的条件下离心20min进行脱脂；二、将脱脂乳与EDTA-Na溶液以6∶1的比例向脱脂乳中加入体积浓度为60％的EDTA-Na溶液，在37℃的温度下水浴25min；三、采用0.22um孔径的蔡氏滤器在无菌条件下对水浴后的脱脂乳进行过滤将水浴后的样品进行无菌过滤；四、将滤膜四成碎块，用生理盐水在涡旋振荡器上进行震荡，洗脱滤膜上的菌体，然后在9000g的条件下离心洗脱液15min，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，9000g的条件下离心洗脱液15min，弃掉上清后收集菌体；五、利用细菌DNA提取试剂盒提取菌体基因组DNA作为模板，进行Real Time RT-PCR检测，20ulReal Time RT-PCR反应体系由10ul的2×SYBR buffer、2.0ul的DNA模板、1.0ul的引物和7.0ul的灭菌双蒸水组成；扩增反应条件为预变性95℃30s，变性95℃5s，退火60℃35s，共40个循环。
Claims (8)
1.一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于：检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法按以下步骤实现：一、将待检测的原料乳离心进行脱脂；二、将脱脂乳与EDTA-Na溶液以5-7∶1的比例向脱脂乳中加入体积浓度为60％的EDTA-Na溶液，在37℃的温度下水浴20-30min；三、将水浴后的样品进行无菌过滤；四、用生理盐水洗脱滤膜上的菌体，离心2次后弃掉上清，收集菌体；五、利用细菌DNA提取试剂盒提取菌体基因组DNA作为模板，进行Real TimeRT-PCR检测，根据扩增曲线和融解曲线进行分析；即得到检测结果；其中步骤五中20ul反应体系由10ul的2×SYBR buffer、2.0ul的DNA模板、1.0ul的引物和7.0ul的灭菌双蒸水组成；扩增反应条件为预变性95℃30s，变性95℃5s，退火60℃35s，共40个循环；蜡样芽孢杆菌上游引物为5’-AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3’，下游引物为5’-GGCTTATTCGCTATGCG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于：步骤一中待测样品是在3000g的条件下离心20min。
3.根据权利要求1所述的一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于：步骤二中将脱脂乳与EDTA-Na溶液以6∶1的比例向脱脂乳中加入体积浓度为60％的EDTA-Na溶液。
4.根据权利要求1所述的一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于：步骤二中水浴条件为37℃，25min。
5.根据权利要求1所述的一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于步骤三中采用0.22um孔径的蔡氏过滤器进行无菌过滤。
6.根据权利要求1所述的一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于：步骤四中菌体洗脱液在9000g，15min的条件下离心2次。
7.根据权利要求1所述的一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征 在于；步骤五中利用细菌DNA提取试剂盒提取菌体基因组DNA。
8.根据权利要求1所述的一种检测原料乳中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于：步骤五中提取的菌体DNA直接作为Real Time RT-PCR反应的模板。
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|---|---|---|---|---|
| CN102936621A (zh) * | 2012-08-27 | 2013-02-20 | 上海交通大学 | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 |
| CN104032000A (zh) * | 2012-08-27 | 2014-09-10 | 上海交通大学 | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 |
| CN105803058A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-07-27 | 南昌大学 | 利用高分辨熔解曲线检测菌群的分析方法 |
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2010
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| CN102936621B (zh) * | 2012-08-27 | 2014-06-11 | 上海交通大学 | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 |
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