TW201827605A - 一種用於監控微生物相之動態變化的整合系統及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種用於監控微生物相之動態變化的整合性系統和方法。本發明可以追蹤複合性基質中微生物群的動態變化。
Description
本發明涉及一種用於監控微生物相之動態變化的系統及方法。
在醫學、環境、或是工業上之微生物相分析,尤其是工業的發酵過程中,特別是對於使用“固態”基質進行發酵的工業,相關微生物相隨時間變化(或成熟期間)的改變通常是複雜的,並且難以監控特殊發酵產物的產出。關於該議題很少有文獻發表。
最近的一些文獻聚焦於在酵母發酵過程中添加已知混合性菌株的微生物相;有些文獻則專注在對不同土壤生態系統的細菌群落組成進行單一測量時間點的研究。這些研究多係利用次世代定序方式來得知微生物相的組成,不但一次只能檢測單一時間點之結果,每一次的次世代定序就必須耗費1至3天不等的時間。因此,需要一個如本發明中明確、快速及全面性的整合系統及方法來監控微生物相隨時間改變的變化。
本說明書所使用之用詞“一”被用來描述本發明的元件和組成。這僅僅是為了方便並給予本發明的一般意義。該描述應該被理解為包括一個或者至少一個,且本說明書所使用的單數也包括複數,除非其是 明顯具有另外的意思。
本說明書所使用的“或”係用於描述“和/或”。
本說明書所述之”總核酸”或”核酸”與一般生物學用字並無不同,係指去氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。
本發明便是提供一種結合次世代定序(NGS)技術和高解析度核酸解離分析(HRM)的系統和方法,可應用在所有可能需監控微生物相變化的產業中,例如應用於那些需要監控發酵過程中之微生物相的變化及其群體數量的產業。
除一樣本的次世代定序(NGS)分析之外,本發明也主張將自一樣本中於不同時間點採集之每一樣品,使用具有適當的遺傳標記或聚合酶鏈鎖反應(PCR)產物(例如16s rDNA基因,或其它菌株特異性基因)的高解析度核酸解離分析(HRM)技術作為主要篩選工具,用以定期監控隨時間的改變之微生物相的變化及其群體數量。
高解析度解離分析(HRM)為一透過分析高解析度之解離曲線而得到檢測之核酸片段中微小序列之差異的技術。此技術廣泛用於基因表現、基因突變、基因修飾等研究,或應用於醫學之疾病診斷等研究上(https://en.wikipedia.org/wiki/High_Resolution_Melt)。
本發明提供一個整合性系統,包括以下組成:(a)一定序裝置,用於定序一樣本中的微生物相,以分析該微生物相之組成及特性;(b)一高解析度核酸解離分析儀器,用於分析自該樣本中採集至少二個具有微生物相之樣品,其中每一樣品係於不同之時間點自該樣本中所採 集者,並建立一微生物相解離圖形,以監控該樣本中微生物相之動態變化;及(c)一資料庫,連接至該定序裝置及該高解析度核酸解離分析儀器,用於紀錄該微生物相之組成、特性及解離圖形的分析數據。
較佳的,該定序裝置係指次世代定序(NGS)裝置。
較佳的本發明更進一步具有一優化方法如下:(a)優化的樣品(DNA)萃取方法:使用商業化試劑;(b)設計專有的16s rDNA引子;(c)設計專有的聚合酶鏈鎖反應條件和解離程序;及(d)專有且客製化的數據庫和軟體用於圖形之比較(圖譜比較)。
本發明中所使用的引子包括:
其中引子編號1、3、4係為16s rDNA之V3區域之引子對,引子編號2係為16s rDNA之V6區域之引子對。
利用上述引子進行聚合酶鏈鎖反應時,本發明包含一聚合酶鏈鎖反應產物不超過300個鹼基對之特色,其可提升高解析度核酸解離分析之解析度。
較佳的,本發明之高解析度核酸解離分析儀器包含一聚合酶鏈鎖反應儀,針對每一樣品執行非對稱性聚合酶鏈鎖反應,用以擴增該每一樣品之小片段核酸,以提高該些小核酸片段在高解析度核酸解離分析時之準確度。
較佳的,本發明之高解析度核酸解離分析儀器可進一步自該資料庫提取資料,用以確認該微生物相之組成、特性及解離圖形的分析數據。
較佳的,本發明之高解析度核酸解離分析儀器可進一步自該資料庫反覆提取已完成分析之數據,於更後續之監控時,無須重複該微生物相之成分及特性的分類學分析,亦無須重複先前時間點的解離分析。
本發明之系統可用於追蹤複合性基質中已知或未知微生物相之動態變化的整合性系統作為一個品質管制標準。該系統不僅可以追蹤真細菌的組成物,還可以追蹤真核生物的組成物。藉由結合額外的化學特性分析和特定的感官品評小組分析,可以生產出穩定的高品質發酵產品。
本發明亦提供一種新穎的方法,藉由本發明之整合性系統,結合次世代定序(NGS)技術和高解析度核酸解離分析(HRM)圖形,以定量和定性的方式監控隨時間改變之微生物相的變化。另外,本發明觀察到,一旦建立初始的次世代定序(NGS)圖形,本發明可以簡單地僅使用高解析度核酸解離分析(HRM)技術建立整體的解離圖形,並且追蹤微生 物相在一段時間內的變化。
本發明用於監控微生物相之動態變化的方法,其簡單流程如圖1所示。
本發明用於追蹤微生物相動態變化的方法,包括:(a)自一樣本中採集至少二個具有微生物相之樣品,其中每一樣品係於不同之時間點自該樣本中所採集者;(b)萃取該每一樣品的總核酸;(c)擴增該每一樣品的總核酸,各自得一擴增後之小片段核酸;(d)分析每一樣品的該擴增後之小片段核酸,其中該分析方法包含一高解析度核酸解離分析;及(e)於高解析度核酸解離分析後,基於每一樣品之分析結果,建立一高解析度核酸解離分析圖形以監控該樣本中微生物相的動態變化。
較佳的,該擴增該每一樣品的總核酸之步驟係透過非對稱性聚合酶鏈鎖反應進行擴增,以提升高解析度核酸解離分析曲線之準確度。
另一方面,該擴增後之小片段核酸可進一步透過定序步驟進行一樣本之微生物相的分類學的定性分析,該定性分析可與高解析度核酸解離分析同時進行,且一旦完成分析之後,該分析結果會存檔於一資料庫中,可隨時讀取分析結果,不用於每次分析前都進行一次定性分析。
較佳的,該定序步驟係指次世代定序(NGS)。
較佳的,本發明之方法僅需於分析前,針對一樣本做一次該擴增之小片段核酸之分析,取得初始微生物相之組成分類學分析結果即可。
與單純次世代定序(NGS)相比,本發明具有以下優點:
快速(小於4小時)且具成本效益;當沒必要時,不需要去辨識每一個微生物菌株個體,相反地,本發明辨識一屬於特定的群體(混合的微生物)的獨特的高解析度核酸解離分析(HRM)圖形,以快速連接特定的“表現型”並具有人性化的數據分析。
本發明可用於分析來自複合性基質的微生物相,例如食物材料、土壤樣品、臨床標本或沼氣。因此,本發明可以應用於食品產業、農業產業、醫療產業或能源產業。
本發明也可應用於口腔微生物相、皮膚微生物相或與腸道微生物相之分析。
1‧‧‧用於追蹤不同微生物相之動態變化的整合性系統
10‧‧‧一定序裝置
11‧‧‧一資料庫
12‧‧‧一高解析度核酸解離分析儀器
圖1為本發明用於監控微生物相之動態變化的方法之簡單流程。
圖2顯示使用NanoDrop 2000分光光度計量測所萃取的總DNA的濃度和品質;樣品b1=wl_small volume(0.2克的白色穀物在低溫發酵),樣品b2=wl_large volume(2克的白色穀物在低溫發酵),樣品b3=rl_small volume(0.2克的紅色穀物在低溫發酵),樣品b4=rl_large volume(2克的紅色穀物在低溫發酵)。
圖3顯示使用V3引子的擴增結果。
圖4顯示樣品間(不同“屬”)不同微生物的多樣性;在“屬”級,樣品b1-b4顯示不同的多樣性。七個相對較大的群體(黑色箭頭所指的區域)是:1:未分類的,2:假單胞桿菌屬,3:不動桿菌屬,4:未分類的,5:腸桿菌屬,6:魏斯氏菌屬,7:乳酸桿菌屬。
圖5顯示所萃取出來的小片段核酸的高解析度核酸解離分析(HRM)結果,代表複合性基質之微生物相。圖A描述了樣品b1和b2的高解析度核酸解離分析圖形(normalized melting peaks);圖B描述了樣品b3和b4的高解析度核酸解離分析圖形(normalized melting peaks)。
圖6顯示微生物相(微生物群系,總體基因體,或微生物相)在白色穀物之低溫發酵過程中隨時間變化(12/7~12/11,共5天)的監控結果(normalized melting peaks)。
圖7顯示微生物相(微生物群系,總體基因體,或微生物相)在白色穀物之中等溫度發酵過程中隨時間變化(12/8~12/15,共8天)的監控結果(normalized melting peaks)。
圖8顯示微生物相(微生物群系,總體基因體,或微生物相)在紅色穀物之低溫發酵過程中隨時間變化(2/17~2/22,共6天)的監控結果(normalized melting peaks)。
圖9顯示微生物相(微生物群系,總體基因體,或微生物相)在紅色穀物之中等溫度發酵過程中隨時間變化(2/24~3/2,共7天)的監控結果(normalized melting peaks)。
圖10顯示取自污水及污泥樣本之微生物相在沼氣中隨時間變化(不同發酵池)的監控結果(normalized melting peaks)。
圖11顯示以16s rDNA V6引子對進行對稱性聚合酶鏈鎖反應與不對稱性聚合酶鏈鎖反應分析取自污水及污泥樣本之微生物相在沼氣中隨時間變化(不同發酵池)的監控結果(normalized melting peaks)。
圖12顯示本發明之追蹤精確發酵過程中不同微生物相之動 態變化的整合性系統之示意圖。
以下實施方式僅代表本發明的各個不同方面和特徵,並非用於限制本發明。
用於實施本發明之樣本可來自口腔、腸道、皮膚、土壤、污水、或發酵過程等之任一微生物相樣本。
本發明所使用之樣品係自一樣本中,於不同時間點採集而得者。該不同時間點依照實驗需求或樣本微生物相之不同而有所變動。
本實施方式係使用該精確發酵(Precision Fermentation;PF)系統監控“純穀物固態發酵”過程中細菌群落隨時間的變化。最理想的是使用該精確發酵系統來預測在高品質酒精飲料生產中最佳微生物相的組成。
組成一:樣品準備步驟-決定最佳的樣品取樣量
材料:1041207BWL(在低溫下發酵的白色穀物)和1050222BRL(在低溫下發酵的紅色穀物)。
從該兩種樣品中,使用兩種不同的取樣量(0.2克和2克),透過均質化及標準化過程,以mericon試劑來萃取總核酸,判定最佳的取樣量。
圖1顯示兩種不同取樣量所萃取後的DNA皆可得到相似的DNA濃度和品質。
在初步的分光光度計分析後,於次世代定序(NGS)分析前, 先以所設計的引子來擴增萃取出的總核酸中的混合狀16S rDNA的V3區域。擴增結果如圖2所示。
基於圖1和圖2的結果,兩個取樣量(0.2克和2克)皆適用於PF系統。
組成二:以本發明之用於追蹤不同微生物相之動態變化的整合性系統1之定序裝置10進行初始微生物相分析
本實施方式所用之定序裝置為次世代定序(NGS)裝置。
初始次世代定序(NGS)分析結果總結於表1。使用Geengene資料庫並依據辨識出的操作分類單元(OTU)序列,將所有樣品分配到其所屬之物種階層(界、門、綱、目、科、屬、種)。
圖3為次世代定序(NGS)結果,該結果說明了樣品間不同的微生物多樣性(不同“屬”)。基本上,樣品b1和b2應擁有相似的一般多樣性分布以證實樣品來源,雖取樣量不同(分別為0.2克和2克),但b1和b2皆來自樣品(1041207BWL)。
基於該次世代定序(NGS)的結果,當使用萃取出的總核酸 作為模板來擴增部分16s rDNA序列(參見組成三)來進行高解析度核酸解離分析(HRM)時,我們也預測一種類似或相同的解離圖形。雖取樣數量不同(OTU序列的數量),但樣品b3和b4亦顯示出相似的一般多樣性分布。
儘管該結果證實了b3和b4在組成一的分析中顯示其來自相同的樣品(1050222BRL),但是當使用擴增的小片段核酸來進行高解析度核酸解離分析(HRM)時,應該存在不同的解離圖形(參見組成三)。
組成三:以高解析度核酸解離分析儀器12確認次世代定序(NGS)之結果並建立一微生物相解離圖譜
圖3的次世代定序(NGS)數據顯示,樣品b1和b2在微生物相中具有相似的多樣性分布,在每個“屬”中亦具有些微不同的OTU序列數量。樣品b3和b4在微生物相中雖也顯示出相似的多樣性分布,但在某些“屬”中則具有不同量的OTUs。例如:乳酸菌群(如粉紅色條所示)在樣品b3和b4之間的群體數量上是不同的。
在設計專有的PCR的條件之下,使用V3引子進行高解析解離後,其結果如圖4所示。圖4A是樣品b1和b2(在低溫下發酵的白色穀物)的高解析度核酸解離分析(HRM)圖形,該圖形顯示出在b1和b2間,有非常相似的解離圖形,該圖形結果也再次證實先前的次世代定序(NGS)的結果。
此外,圖4B顯示,在70℃至87℃的高解析度核酸解離分析(HRM)溫度譜圖之下,樣品b3和b4(在低溫下發酵的紅色穀物)存在於一相似的高解析度核酸解離分析(HRM)解離圖形,但在87℃至90℃的高解析度核酸解離分析(HRM)溫度圖譜之下則有變化(圖4A和B)。該結果 也再次證實先前的次世代定序(NGS)的結果(樣品b3和b4之間存在不同的OTU序列)。
比較高解析度核酸解離分析(HRM)的圖形與次世代定序(NGS)的結果,我們可發現哪種發酵條件與次世代定序(NGS)的結果相符合,從而獲得更好的發酵條件。由於該“分布”結果與次世代定序(NGS)的數據及高解析度核酸解離分析(HRM)的圖形相符合,因此,在定性和定量兩種方式的考量上,我們主張使用高解析度核酸解離分析(HRM)作為常規篩選工具,取代使用上費時又費力的次世代定序(NGS)技術,用以監控微生物相的變化。
本發明之整合性系統另包含一資料庫11,可蒐集該次世代定序之結果,以利後續高解析度核酸解離分析之重複再分析或比對,不用再額外增加執行次世代定序之時間及金錢之成本。
總之,藉由本發明之整合性系統1,結合優化的樣品製備步驟、初始的次世代定序(NGS)分析及設計專屬的高解析解離等方法,本發明不僅可以從複合性基質中辨識“特定的”微生物相,而且還可以監控其隨時間改變的組成物變化(培養期間)。
本實施方式揭示如何在釀造產業中應用本發明所主張的精確發酵系統來追蹤及監控“固態發酵”期間的微生物相變化的方法。本發明所主張的精確發酵系統除了可應用於釀造產業之外,亦可以應用於其他發酵產業,特別適用於“固態發酵”。
以下的數據是以使用不同溫度處理的不同類型固態發酵基 質所完成的。
本實施方式之步驟包括自一樣本中採集至少二個具有微生物相之樣品,其中每一樣品係於不同之時間點自該樣本中所採集者;其次,萃取該每一樣品的總核酸當作模板,擴增該每一樣品的總核酸,各自得一擴增後之小片段核酸;再以一高解析度核酸解離分析來分析每一樣品的該擴增後之小片段核酸;於高解析度核酸解離分析後,基於每一樣品之分析結果,建立一高解析度核酸解離分析圖形以監控微生物相的動態變化。
本實施方式之材料及溫度條件包括:白色穀物,紅色穀物,低溫和中等溫度(圖5至圖8)。
參考圖5,樣品“wl”代表低溫下的白色穀物。該白色穀物係生產(成熟)於2015年12月7日至2015年12月11日之間的不同批次(即不同日期)。從來自不同日期(2015年12月7日至2015年12月11日)的“wl”樣品之間,我們可以觀察到不同的高解析度核酸解離分析(HRM)圖形。所有樣品均做雙重複分析。
參考圖6,樣品“wm”代表中等溫度的白色穀物。該白色穀物係生產(成熟)於2015年12月8日至2015年12月15日之間的不同批次(即不同日期)。從來自不同日期(2015年12月8日至2015年12月15日)的“wm”樣品之間,我們可以觀察到不同的高解析度核酸解離分析(HRM)圖形。所有樣品均做雙重複分析。
參考圖7,樣品“rl”代表低溫的紅色穀物。該紅色穀物係生產(成熟)於2016年2月17日至2016年2月22日之間的不同批次(即不同日期)。從來自不同日期(2016年2月17日至2016年2月22日)的“rl”樣品之 間,我們可以觀察到不同的高解析度核酸解離分析(HRM)圖形。所有樣品均做雙重複分析。
參考圖8,樣品“rm”代表中等溫度的紅色穀物。該紅色穀物係生產(成熟)於2016年2月24日至2016年3月02日的不同批次(即不同日期)。從來自不同日期(2016年2月24日至2016年3月02日)的“rm”樣品之間,我們可以觀察到不同的高解析度核酸解離分析(HRM)圖形。所有樣品均做雙重複分析。
根據該監控隨時間而改變的微生物相的精確發酵系統,操作人員可以比較不同時間點的高解析度核酸解離分析(HRM)圖形(圖5至圖8)的發酵產品,並決定哪種微生物相是最適合操作人員操作的產品。
於本實施方式中,沼氣的監控指示了產生電力的最佳圖形。藉由監控混合的(複雜的)微生物群體“隨著時間的”變化,可以用於預測適合發電的最佳甲烷產量之最佳組成(或所謂的高解析度核酸解離分析(HRM)圖形)。
本實施方式使用三個樣品來進行所主張保護的發明:未處理的污水,調理池中的未處理污水和濃縮的污泥。圖9顯示微生物相(高解析度核酸解離分析(HRM)圖形)。
藉著比較這三個圖形,本發明可以指出產生較好效率的最佳微生物相。
本實施方式亦以16s rDNA之V6區域之引子對進行對稱性及非對稱性聚合酶鏈鎖反應之比較,藉此比較對稱性及非對稱性聚合酶鏈鎖 反應擴增結果是否對於高解析度核酸解離分析的圖形有所影響,其結果參見圖10。其說明影響高解析度核酸解離分析結果的因子包括了擴增之小片段核酸長度及引子濃度。本實施方式採用非對稱性引子濃度並擴增16s rDNA V6小片段核酸產物。藉由非對稱性聚合酶鏈鎖反應及較短的擴增片段來降低偏差值及增加解離分析之解析度。
於一更佳實施方式,以16s rDNA V6引子對進行非對稱性聚合酶鏈鎖反應後所產生的波峰多於對稱性聚合酶鏈鎖反應,其更易於監測微生物相隨時間動態變化之資料分析及判讀。
本實施方式說明操作者操作本發明之用於追蹤不同微生物相之動態變化的整合性系統1之操作方式。
操作者將自一樣本中,於不同時間點採集之至少二個具有微生物相之樣品進行均質化與標準化之處理之後,進行樣品之總核酸的萃取,再以該萃取之總核酸當作模板,以專屬之引子對(如16s rDNA V3或16s rDNA V6引子對)進行小片段核酸之擴增,為使後續分析之結果最佳化,該擴增之小片段核酸大小不超過300個鹼基對。於不同時間採集自同一樣本之每一個樣品皆經過前述步驟之處理。
其次,操作者可利用本發明之定序裝置10進行最初始之樣品小片段核酸的定序,並分析定序結果,得到該樣品之微生物相組成並加以分類,其分析結果將存檔於一資料庫11中;同時,每一個不同時間點採集之樣品的小片段核酸也利用本發明之高解析度核酸解離分析儀器12進行解離分析,基於每一樣品的解離分析結果建立一個解離分析圖形,用以監控 微生物相的動態變化。
操作者可將定序結果及解離分析圖形進行比較,得到一具定性及定量之微生物相動態變化的分析結果,該結果都可存檔於資料庫11中,若後續仍繼續採樣,則可自資料庫11中獲得先前之分析結果進行比較,不需再重複一次已經完成之分析。
Claims (10)
- 一種快速追蹤微生物相之動態變化的方法,包括:(a)自一樣本中採集至少二個具有微生物相之樣品,其中每一樣品係於不同之時間點自該樣本中所採集者;(b)萃取該每一樣品的總核酸;(c)擴增該每一樣品的總核酸,各自得一擴增後之小片段核酸;(d)分析每一樣品的該擴增後之小片段核酸,其中該分析方法包含一高解析度核酸解離分析;及(e)於高解析度核酸解離分析後,基於每一樣品之分析結果,建立一高解析度核酸解離分析圖形以監控該樣本中微生物相的動態變化。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該擴增該每一樣品的總核酸係透過非對稱性聚合酶鏈鎖反應進行擴增之步驟,以提升高解析度核酸解離分析曲線之準確度。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該擴增後之小片段核酸進一步透過定序步驟進行該一樣本之微生物相的分類學分析。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法,其中該定序步驟係指次世代定序(NGS)。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該擴增後之小片段核酸係指長度不大於300個鹼基對之混合狀16S rDNA的V3或V6區域之片段。
- 一種用於追蹤微生物相之動態變化的整合性系統,包括:(a)一定序裝置,用於定序一樣本中的微生物相,以分析該微生物相之組成及特性; (b)一高解析度核酸解離分析儀器,用於分析自該樣本中採集至少二個具有微生物相之樣品,其中每一樣品係於不同之時間點自該樣本中所採集者,並建立一微生物相解離圖形,用以監控該樣本中微生物相之動態變化;及(c)一資料庫,連接至該定序裝置及該高解析度核酸解離分析儀器,用於紀錄該微生物相之組成、特性及解離圖形的分析數據。
- 如申請專利範圍第6項所述之系統,其中該定序裝置係指次世代定序(NGS)裝置。
- 如申請專利範圍第6項所述之系統,其中該高解析度核酸解離分析儀器進一步自該資料庫提取資料,用以確認該微生物相之組成、特性及解離圖形的分析數據。
- 如申請專利範圍第6項所述之系統,其中該高解析度核酸解離分析儀器進一步結合一聚合酶鏈鎖反應儀,其針對每一樣品執行聚合酶鏈鎖反應,用以擴增該每一樣品之小片段核酸。
- 如申請專利範圍第9項所述之系統,其中該聚合酶鏈鎖反應進一步係指非對稱性聚合酶鏈鎖反應。
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