CN102080127B - 一种检测15种临床常见病原微生物的基因芯片 - Google Patents
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种检测15种临床常见病原微生物的基因芯片。该基因芯片包括固定在固相载体上的特异检测探针，这些探针是针对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、志贺菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、土曲霉、黄曲霉合米根霉的16SrRNA基因和ITS基因序列进行设计并经过反复试验筛选和验证得到的，其具有良好的杂交特异性和准确性。本发明芯片检测操作简单、省时，成本较低，适用于临床常见病原微生物的筛查、急重症患者的早期快速诊断以及突发感染事件病原的诊断，该芯片有助于临床快速诊断感染原，对临床疾患起到早发现、早诊断的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测临床常见病原微生物的基因芯片。
背景技术
感染性疾病一直以来都是临床最常见的致病因素之一，也是长期困扰临床疾病诊断和治疗的难题。除了日益增长的HIV、乙肝等各类病毒感染的患者外，临床目前最为多见的仍是各种常见细菌和真菌引起的感染疾病。随着全球老龄化现状突现，人口流动性增加，病原微生物的流行度和传播度加大，引起感染性疾病呈现多发和复合感染的趋势。由于病原体本身的变异以及曾经消失或控制的病原体死灰复燃，临床感染性疾病越来越复杂，如结核，曾经控制并仍在常规防疫，但每年仍有新增病例10000万，死亡约300万人，可见感染性疾病的控制不容忽视。
目前临床上，针对引起感染的病原微生物，多采用培养和生化鉴定等方法。这些方法耗时长、操作危险性高，从一定程度上制约了临床诊断和治疗的效果。因此研究一套针对微生物准确高效的检测系统，不仅可以减轻临床医务工作者的辛苦和危险，同时也能为病人的早期诊断治疗起到及时有效的辅助诊断作用。
随着PCR技术的成熟和普及，PCR-RFLP、PCR-SSCP、荧光定量PCR、RT-PCR等分子诊断技术相继应用到微生物检测上。(MuldrewKL.Molecular diagnos-tics of infectious diseases.[J]Curr Opin Pediatr.2009，21(1)：102-11)。病原微生物一直是临床工作中鉴定和诊断的重要环节，随着感染性疾病的增多和病情严重程度的加剧，通过分离培养的方法鉴定病原微生物已经无法满足临床的需求。基因芯片技术是上世纪90年代诞生的一项综合技术。它集合分子生物学和计算机学等多项学科技术于一体，通过将分子探针固定在载体上对目的基因进行快速有效的检测，不仅能保证结果的准确性，检测效率也显著提高。继Kozal等(Kozal MJ，Shah N，Shen N，Yang R，et al.Extensivepolymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene usinghigh-density oligonucleotide arrays.[J]Nat Med.1996.2(7)：753-9)首次在临床中应用基因芯片对HIV21蛋白酶基因多态性进行研究取得成功后，Kato-Maeda M等(Kato-Maeda M，Rhee JT，Gingeras TR etal.Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis.[J]Genome Res.2001.11(4)：547-54)利用基因芯片技术对分支杆菌菌种和结核分支杆菌耐利福平基因rpoB突变。结果表明基因芯片不仅可以用于测序，而且还可以通过聚类分析等统计学手段直接鉴定分枝杆菌菌种，于是基因芯片技术被正引入微生物鉴定诊断。Uchida K研究小组(Uchida K，Yayama T，Kokubo Y，et al.Direct detection of pathogensin osteoarticular infections by polymerase chain reaction amplificationand microarray hybridization.[J]Orthop Sci.2009，14(5)：471-83)和AK研究小组(
AK，Laakso S，Piiparinen P，AittakorpiA，et al.Rapid identification of bacterial pathogens using a PCR andmicroarray based assay.[J]BMC Microbiol.2009，9：161-177.)在前人的基础上也通过进一步优化条件和选择菌种，针对临床不同感染现状研制出各种组合的基因芯片。Dirk M.Leinberger等(Dirk M.Leinberger，Ulrike Schumacher，Ingo B.Autenrieth et al.Development of a DNAMicroarray for Detection and Identification of Fungal Pathogens Involvedin Invasive Mycoses.[J]CLIN.MICROBIOL.，2005，43(10)：4943-4953)人对于各种真菌也建立了稳定而高效的基因芯片鉴定方法。目前国内的微生物检测芯片多停留在科研水平，探针也多较单一或仅涉及16SrRNA基因局部，尚不能完全满足准确检测目的微生物的要求(薛建亚，翁心华等，细菌16SrRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用，第二军医大学学报，2007，28(8)：919-921)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于检测15种临床常见病原微生物的基因芯片。
本发明针对临床常见的病原微生物金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、志贺菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、土曲霉、黄曲霉、米根霉，从PUBMED在线数据库检索上述微生物的16SrRNA基因和ITS基因序列，通过DNAMAN 5.2.2(Lynnon Biosoft，USA)和NCBI BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行比对，找到它们的保守区域和高变区域，然后应用Primer Premier 5.0(PREMIER BiosoftInternational，CA)在这些保守区域中设计引物，高变区中设计探针。经过反复试验筛选和验证，得到了一组扩增效能好的引物以及一系列杂交特异性高准确度好的探针。本发明设计的引物不仅能得到满足杂交要求的目的片段，不同引物由于其反应温度相同可以通过不同的组合来满足实验的需要。所有探针均具备高准确性的同时能在同一条件下完成杂交反应。
基于此，本发明提供一种用于检测临床常见微生物的基因芯片，其包括固定在固相载体上的下述检测探针：
1)用于检测金黄色葡萄球菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
ACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC，
AGTGCTAAGTGTTAGGGGGT，以及
TAACCTTTTAGGAGCTAGCC；
2)用于检测铜绿假单胞菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
CCAAAACTACTGAGCTAGAG，
GTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGG，以及
CTAATCCCATAAAACCGATCGTAGT；
3)用于检测肺炎克雷伯菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
CTGGCAGGCTAGAGTCTTGT，以及
GACCTCATAAAGTATGTCGTAGT；
4)用于检测大肠杆菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
ACTCGTCAGCAAATCAGCAAGC，以及
AGCAAAGGTATTAACTTTACTCCCT；
5)用于检测奇异变形杆菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TCTGAAACTGGTTGGCTAG，以及
CAGCGAATCCTTTAGAGATAG；
6)用于检测产气肠杆菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TTATTAACCTTAACGCCTTCCTCCC，
GTAACGTCAATCGCCAAGGTTATTA，以及
CTGCCAGTTTCGAATGCAGTT；
7)用于检测荧光假单胞菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
CTAGAAAGTTCATTGGATGTCAAGG，
GCACCTGTCTCAATGTTCCC，以及
TGCCCACCATTACGTGCTG；
8)用于检测宋内志贺菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
ACCTGGAATTCTACCCCCCTC，以及
CGCACCTGAGCGTCAGTCT；
9)用于检测白假丝酵母菌的探针，选自以下序列中的一种或几种：
GCTTGCGGCGGTAACGTCCACCA，以及
CCCACCGCCAAAGCAAG；
10)用于检测光滑假丝酵母菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TTTCTTTTAGTAGAAAACAACT，以及
CAGTATGTGGGACACGAGCGC
；
11)用于检测热带假丝酵母菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
AAGTCGCTTAAAATAAGTTTCCACG，
AAGTTATGAAATAAATTGTGGTGGC，以及
GTGGCGGGAGCAATCCTA；
12)用于检测近平滑假丝酵母菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TTTGGTAGGCCTTCTATATGG，
CTATATGGGGCCTGCCAGA，以及
AATTTTATTTAATGTCAACCGA；
13)用于检测土曲霉的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
ATTGCAAAGAATCACACTCA，
AAAAACAAGTTGCAAATAAATG，以及
CTTTCAGAACAGGGTTCATGTTG；
14)用于检测黄曲霉的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TACAATCAACTCAGACTTCACTAGA，
AAAAAGATTGATTTGCGTTCGG，以及
CAGAGTTCGTGGTGTCTCCG；
15)用于检测黄曲霉的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TTTCTAGGTTTATTATGAAGGGTGC，
AATGTTATGTGTGGGTTTGTGATGA，以及
GCGATGCGACCCATTACCA。
上述基因芯片，其还可包括固定在固相载体上的下述探针中的一种或多种：
GTCAAATCATCATGCCCCTTA，
GTCAAGTCATCATGGCCCTTA
Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT，以及
AACTTTCAACAATGGATCTCTT。
上述的基因芯片，其还可包括阴性对照点，该阴性对照点为探针稀释液，不含有任何杂交探针。
本发明基因芯片的固相载体可以是任何不影响核酸杂交，且可稳定连接杂交探针的载体，例如经过醛基修饰的玻璃片等。
进一步，本发明还提供一种含有上述基因芯片的检测试剂盒。该试剂盒还可进一步含有下述引物中的一种或多种：
srr-rl AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，
srr-dg GACTACCAGGGTATCTAATCC，
srr-ra CGTAGGTGGCAAGCGTTATC，
srr-pg TGTGCGGGTCCCCGTCAATT，
srr-gd GAATTGACGGGGACCCGCACAAGC，
srr-ak TACGGCTACCTTGTTACGACTT，
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG，以及
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATG。
本发明基因芯片优选在固相载体上连接上述全部探针，这样在检测时可以提供更为准确的结果；优选，在所述试剂盒中的引物包括上述全部srr系列引物和ITS引物。当然，本领域技术人员应当理解这不是必须的。
本发明基因芯片可以分为检测系统和监控系统两个部分(图1)。监控系统包括3个部分：①阴性对照，为探针稀释液(去离子纯水)布控在点阵的四周，正常反应下该点无信号。若扫描结果显示该点显色，表明探针稀释液有污染或点样过程有污染。②阳性对照，包括两部分，一为设计的针对不同病原微生物的通用探针，布控在矩阵中间，共3×3个点。正常反应下为待检物中有相应病原微生物则该点显色，若无信号可能是待检物中无对应病原微生物或实验失败；二为合成的标记有Cy3的20T探针，该探针点样至芯片上用于检测荧光信号强度，若检测探针荧光信号强度明显小于该阳性探针，可视其为非杂交阳性结果或该探针效能欠佳。③平行对照，为每条检测探针平行点样3次，即每条探针荧光显色点为3个，每种微生物根据探针的不同，检测点从3～15个不等。若平行点信号强度均一，说明实验操作过程控制良好，探针结合能力好，具有可重复性，若平行点显色效果不等，表明探针结合能力不稳定或实验操作过程控制欠佳。
本发明提供的基因芯片和试剂盒具有如下优点：①针对不同的病原微生物有相应的通用引物进行PCR扩增，减少反应复杂程度，简化实验操作；②扩增得到的产物均具有较高的特异性，长度适中，能满足不同实验的需求；③探针设计合理，能在42℃进行稳定的杂交；④系统包含监控和检测两个体系，可同时检测15种临床常见的病原微生物，并对该芯片中不包含的病原微生物可以做初步检测诊断。本芯片在检测同时具备监测功能，对过程和结果起到控制作用。因此，该芯片可快速检测15种临床常见病原微生物，适用于临床常规检测、急重症快速检测和突发传染疾病筛查。本发明为临床感染的快速诊断提供了技术支持，也为未来临床微生物检测基因芯片的应用普及奠定了基础。
附图说明
图1检测15种临床常见病原微生物的芯片点样矩阵
图中：○：阴性对照；●：阳性对照；▲：革兰氏阳性菌通用探针△：革兰氏阴性菌通用探针；■：真菌通用探针；⊙：检测探针
上半部份为细菌检测探针分布矩阵；下半部分为真菌检测探针分布矩阵。图2检测结果图(2.1～2.3仅显示细菌部分矩阵，2.4、2.5仅显示真菌部分)
其中：2.1：铜绿假单胞菌、产气肠杆菌和奇异变形杆菌的检测结果；
2.2：金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌的检测结果；
2.3：铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌和志贺菌的检测结果；
2.4：热带假丝酵母菌、土曲霉、米根霉和光滑假丝酵母菌的检测结果；
2.5：近平滑假丝酵母菌、黄曲霉和白色念珠菌的检测结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1基因芯片的制备
本例以醛基玻片为固相载体，说明本发明基因芯片的制备方法。(1)以经过醛基处理的玻片为载体；
(2)设计引物和探针：
首先从PUBMED在线数据库检索金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、志贺菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、土曲霉、黄曲霉、米根霉的16SrRNA基因和ITS基因序列，通过DNAMAN 5.2.2(Lynnon Biosoft，USA)和NCBIBLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行比对，找到它们的保守区域和高变区域，然后应用Primer Premier 5.0(PREMIERBiosoft International，CA)在这些保守区域中设计引物，高变区中设计探针。经过反复试验筛选和验证，得到了一组扩增效能好的引物(表1和表2)以及一系列杂交特异性高准确度好的探针(表3)，在合成探针时在探针的5’端加载10T长臂后固定于载体上。
本例中srr系列引物为针对细菌16SrRNA基因的引物系列。三对引物相互重叠，很好的涵盖了16SrRNA基因的全长，为设计探针提供了更大的选择范围。同时所设计的引物获得片段长度为400～800bp左右，不仅长度适中，更可通过选择进行组合，完成杂交、测序等反应，引物的具体参数见表1所示。Srr系列引物可在同一反应条件下完成PCR扩增反应，所得到的混合产物能很好的满足杂交的需要，为芯片杂交节省了时间并降低了成本。通过srr系列引物获得16SrRNA基因的全部序列，弥补了过去微生物检测芯片目的片段小，涵盖信息少的不足，实得芯片包含的信息量更大，检测效率更高，准确性更好。
(3)芯片点阵布控
每张芯片包含43种探针(图1)。芯片包含监控系统和检测系统(图1)。
监控系统包括3个部分：①阴性对照，为探针稀释液(去离子纯水)布控在点阵的四周，正常反应下该点无信号。若扫描结果显示该点显色，表明探针稀释液有污染或点样过程有污染。②阳性对照，包括两部分，一为设计的针对不同病原微生物的通用探针，布控在矩阵中间，共3×3个点。正常反应下为待检物中有相应病原微生物则该点显色，若无信号可能是待检物中无对应病原微生物或实验失败；二为合成的标记有Cy3的20T探针，该探针点样至芯片上用于检测荧光信号强度，若检测探针荧光信号强度明显小于该阳性探针，可视其为非杂交阳性结果或该探针效能欠佳。③平行对照，为每条检测探针平行点样3次，即每条探针荧光显色点为3个，每种微生物根据探针的不同，检测点从3～15个不等。若平行点信号强度均一，说明实验操作过程控制良好，探针结合能力好，具有可重复性，若平行点显色效果不等，表明探针结合能力不稳定或实验操作过程控制欠佳。
检测系统由针对15种病原微生物的39条探针点样组成，每条探针均采用去离子纯水稀释为25μM工作液，平行点样3次即每条探针均有3个点显示。所有探针根据检测的微生物集合排布。当点样点经过扫描后显示绿色荧光信号，表明待检样本中含有该探针检测的微生物。多条探针同时显色则表示为待测样本中含有混合检出物。
(4)监控系统与检测系统的点阵布控
监控系统与检测系统的点阵布控在同一区域同时完成。采用Arrayit SpotBot 3点样仪点布于醛基玻片上，室温避光放置12h，待探针完全固定于载体上后，可置于4℃保存。
杂交完成后，以2×SSC-0.1％SDS溶液洗涤，5min×2次；0.5×SSC-0.1％SDS溶液洗涤，15min×1次；甩片机甩干后，应用博奥基因芯片扫描仪扫描荧光信号，判读结果。
表1srr系列通用引物序列1
以Staphylococcus aureus subsp.aureus JH9(NC_009487)16SrRNA基因序列(1562bp)为参考.
表2ITS通用引物序列1
1：White，T.J.，T.Bruns，S.Lee，and J.Taylor.1990.Amplification and directsequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics，p.315-322.In M.Innis，D.Gelfand，J.Sninsky，and T.White(ed.)，PCR protocols：a guide tomethods and application.Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.
表3检测15种病原微生物的寡核苷酸探针
实施例2病原微生物的检测
(1)提取细菌DNA
采用CTAB/NaCl法分别提取表4中的病原微生物DNA作为模板。
表4
1：ATCC：美国典型培养物保藏中心
2：CCTCC：中国国家典型培养物保藏中心
(2)目的DNA扩增
采用表1和2的4对引物进行PCR反应，扩增得到目的DNA。多重PCR反应液由10×buffer(Biostar)，10μmol/L的各条引物，10mmol/L dNTPs(罗氏公司)，2U Taq DNA聚合酶(Biostar)，Cy3-dCTP(GE)和无菌水组成。PCR反应条件为：
50μl体系(多重PCR)：
Taq buffer(10×) 5μl
dNTPs(10mM) 0.8μl
srr-rl 1.5μl
srr-dg 1.5μl
srr-ra 1.5μl
srr-pg 1.5μl
srr-gd 1.5μl
srr-ak 1.5μl
Taq(2U/μl) 1μl
dCTP 0.2μl
ddH2O 31μl
DNA 3μl
25μl体系(ITS)：
Taq buffer(10×) 2.5μl
dNTPs(10mM) 0.4μl
ITS1 1μl
ITS4 1μl
Taq(2U/μl) 0.5μl
dCTP 0.1μl
ddH2O 16.5μl
DNA 3μl
具体扩增条件为：
注：扩增srr引物时，X为46℃；扩增ITS引物时，X为60℃
(3)PCR产物96℃变性10分钟，-20℃骤冷。
(4)42℃预杂交2小时，封闭芯片表面非特异性结合位点，将已变性的PCR产物与预热的杂交液1∶10混匀，加入反应舱中42℃杂交6小时。
(5)杂交完成后，室温(25℃)下以2×SSC-0.1％SDS溶液洗涤，5min×2次；0.5×SSC-0.1％SDS溶液洗涤，15min×1次；甩片机甩干后，应用博奥基因芯片扫描仪扫描芯片得到荧光信号。
(6)结果判读
按照上述步骤1～5，分别对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、志贺菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、土曲霉、黄曲霉、米根霉进行检测，结果表明，阴性对照均未显色，阳性对照均显示为绿色荧光信号，针对每个菌种进行检测时，仅该菌种的相应得检测点出现绿色荧光信号(该菌种的相应得检测点均显示)。
针对所设计探针的特异性还进行了非检测菌杂交，分别用备检的15种病原微生物交互检测，并用阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌作为目的菌，利用所设计的芯片进行杂交检测。检测结果显示，非芯片探针指向的微生物作为模板杂交后，芯片非通用探针未见绿色荧光信号阳性点，由此可见芯片特异性良好。
实施例3病原微生物的检测
本例按照实施例2的方法，对15株经培养生化鉴定为金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、志贺菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、土曲霉、黄曲霉和米根霉临床分离(武汉大学中南医院检验科，湖北武汉)病原微生物进行检测。结果表明，检测结果与培养和生化鉴定结果完全一致。
序列表
<110> 武汉大学
广州阳普医疗科技股份有限公司
<120> 一种检测15种临床常见病原微生物的基因芯片
<130>
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtaggtggc aagcgttatc 20
<210> 4
<211> 20
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<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ttattaacct taacgccttc ctccc 25
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtaacgtcaa tcgccaaggt tatta 25
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctgccagttt cgaatgcagt t 21
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctagaaagtt cattggatgt caagg 25
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcacctgtct caatgttccc 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgcccaccat tacgtgctg 19
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acctggaatt ctacccccct c 21
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cgcacctgag cgtcagtct 19
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gtcaaatcat catgcccctt a 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gtcaagtcat catggccctt a 21
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tttttttttt ttttttttt 19
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gcttgcggcg gtaacgtcca cca 23
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
cccaccgcca aagcaag 17
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tttcttttag tagaaaacaa ct 22
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cagtatgtgg gacacgagcg c 21
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aagtcgctta aaataagttt ccacg 25
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gtggcgggag caatccta 18
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
aagttatgaa ataaattgtg gtggc 25
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tttggtaggc cttctatatg g 21
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ctatatgggg cctgccaga 19
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
aattttattt aatgtcaacc ga 22
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
attgcaaaga atcacactca 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
aaaaacaagt tgcaaataaa tg 22
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ctttcagaac agggttcatg ttg 23
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
tacaatcaac tcagacttca ctaga 25
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
aaaaagattg atttgcgttc gg 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
cagagttcgt ggtgtctccg 20
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tttctaggtt tattatgaag ggtgc 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
aatgttatgt gtgggtttgt gatga 25
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gcgatgcgac ccattacca 19
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
aactttcaac aatggatctc tt 22
Claims (6)
1.一种检测15种临床常见病原微生物的基因芯片，其包括固定在固相载体上的下述检测探针：
1）用于检测金黄色葡萄球菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
ACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC，
AGTGCTAAGTGTTAGGGGGT，以及
TAACCTTTTAGGAGCTAGCC；
2）用于检测铜绿假单胞菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
CCAAAACTACTGAGCTAGAG，
GTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGG，以及
CTAATCCCATAAAACCGATCGTAGT；
3）用于检测肺炎克雷伯菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
CTGGCAGGCTAGAGTCTTGT，以及
GACCTCATAAAGTATGTCGTAGT；
4）用于检测大肠杆菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
ACTCGTCAGCAAATCAGCAAGC，以及
AGCAAAGGTATTAACTTTACTCCCT；
5）用于检测奇异变形杆菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TCTGAAACTGGTTGGCTAG，以及
CAGCGAATCCTTTAGAGATAG；
6）用于检测产气肠杆菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TTATTAACCTTAACGCCTTCCTCCC,
GTAACGTCAATCGCCAAGGTTATTA,以及
CTGCCAGTTTCGAATGCAGTT；
7）用于检测荧光假单胞菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
CTAGAAAGTTCATTGGATGTCAAGG，
GCACCTGTCTCAATGTTCCC，以及
TGCCCACCATTACGTGCTG；
8）用于检测宋内志贺菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
ACCTGGAATTCTACCCCCCTC，以及
CGCACCTGAGCGTCAGTCT；
9）用于检测白假丝酵母菌的探针，选自以下序列中的一种或几种：
GCTTGCGGCGGTAACGTCCACCA，以及
CCCACCGCCAAAGCAAG;
10）用于检测光滑假丝酵母菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TTTCTTTTAGTAGAAAACAACT，以及
CAGTATGTGGGACACGAGCGC
；
11）用于检测热带假丝酵母菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
AAGTCGCTTAAAATAAGTTTCCACG，
AAGTTATGAAATAAATTGTGGTGGC，以及
GTGGCGGGAGCAATCCTA；
12）用于检测近平滑假丝酵母菌的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TTTGGTAGGCCTTCTATATGG，
CTATATGGGGCCTGCCAGA，以及
AATTTTATTTAATGTCAACCGA；
13）用于检测土曲霉的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
ATTGCAAAGAATCACAC TCA，
AAAAACAAGTTGCAAATAAATG，以及
CTTTCAGAACAGGGTTCATGTTG；
14）用于检测黄曲霉的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TACAATCAACTCAGACTTCACTAGA，
AAAAAGATTGATTTGCGTTCGG，以及
CAGAGTTCGTGGTGTCTCCG；
15）用于检测黄曲霉的探针，其选自以下序列中的一种或几种：
TTTCTAGGTTTATTATGAAGGGTGC，
AATGTTATGTGTGGGTTTGTGATGA，以及
GCGATGCGACCCATTACCA。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其还包括固定在固相载体上的下述探针中的一种或多种：
GTCAAATCATCATGCCCCTTA，
GTCAAGTCATCATGGCCCTTA
Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT，以及
AACTTTCAACAATGGATCTCTT。
3.如权利要求1或2所述的基因芯片，其还包括阴性对照点，该阴性对照点上不含有任何杂交探针。
4.如权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于，所述固相载体为经过醛基修饰的玻璃。
5.含有权利要求1～4任一项所述基因芯片的检测试剂盒。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其还包括下述引物中的一对或多对：
引物1：
srr-rl AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，
srr-dg GACTACCAGGGTATCTAATCC；
引物2：
srr-ra CGTAGGTGGCAAGCGTTATC，
srr-pg TGTGCGGGTCCCCGTCAATT；
引物3：
srr-gd GAATTGACGGGGACCCGCACAAGC，
srr-ak TACGGCTACCTTGTTACGACTT；
引物4：
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG，以及
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATG。
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