CN110093405A - 女性阴道分泌物白色念珠菌检测用引物组和检测方法 - Google Patents

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沈丽娟
徐炜新
于修文
时建英
姚娟
史俊峰
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

一种女性阴道分泌物白色念珠菌检测用引物组，由外引物对F3/B3和内引物对FIP/BIP组成；还涉及利用上述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的方法；还涉及利用上述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的快速定量检测试剂盒。本发明具有在短时内提供结果的优点，比通过基于培养的方法检测和鉴定真菌所需的时间快得多。

Description

女性阴道分泌物白色念珠菌检测用引物组和检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体地涉及一种女性阴道分泌物白色念珠菌DNA快速定量检测用引物组。
本发明还涉及利用上述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的检测方法。
本发明还涉及利用上述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的快速定量检测试剂盒。
背景技术
白色念珠菌(Monilia albican或canidia Albicans)是一种真菌，环境中真菌生长可能导致过敏，霉菌毒性或严重的真菌病环境空气中的真菌孢子与急性哮喘和感染有关。然而，目前通过基于培养的方法检测和鉴定真菌耗时，存在生物危害风险，并且支持真菌菌株生长的能力取决于培养基。
PCR分析需要具有昂贵仪器的分子生物学实验室，其以热循环仪的形式提供PCR所需的温度曲线。此外，qPCR获得的数据必须使用复杂的计算机软件进行分析，并由经过培训的人员进行解释。
发明内容
本发明的目的是提供一种女性阴道分泌物白色念珠菌检测用引物组。
本发明的又一目的是提供一种利用上述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的方法。
本发明的再一目的是提供种利用上述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的快速定量检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供的女性阴道分泌物白色念珠菌检测用引物组，由外引物对F3/B3和内引物对FIP/BIP组成，F3、B3、FIP、BIP具体如下：
本发明提供的利用上述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：F3、B3、FIP、BIP；
3)以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，63摄氏度扩增1小时，将反应管置于80摄氏度水浴5分钟终止反应。肉眼观察浊度，或用实时浊度仪实时监测核酸扩增反应过程，以直观的图文形式来显示整个反应过程中各个反应的速率和时间。
所述的方法，其中，LAMP检测反应体系为：
dNTPs 1.4mM，Tris-HCl pH＝8.8，20mM，(NH4)2SO4 10mM，KCl 10mM，MgSO4 8mM，甜菜碱0.8M，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶0.5U，荧光染料SYBR green I 1μl，白色念珠菌RNA 2μl。
所述的方法，其中，F3、B3的浓度是10pmol，FIP、BIP的浓度是80pmol。
本发明提供的利用上述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的快速定量检测试剂盒，所述试剂盒至少包括含有上述的引物或LAMP检测反应体系。
所述的快速定量检测试剂盒，其中，LAMP检测反应体系为：
dNTPs 1.4mM，Tris-HCl pH＝8.8，20mM，(NH4)2SO4 10mM，KCl 10mM，MgSO4 8mM，甜菜碱0.8M，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶0.5U，荧光染料SYBR green I 1μl，白色念珠菌DNA 2μl。
本发明具有在短时间(1-2小时)内提供结果的优点，比通过基于培养的方法检测和鉴定真菌所需的时间快得多。
具体实施方式
以下对本发明作进一步的描述。
本发明的操作步骤是：
1、提取DNA；
使用GeneJET DNA/RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)，按说明从女性阴道分泌物中提取DNA。
2、引物序列：
3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，LAMP检测反应体系总反应体积为25μl。
4、LAMP检测反应体系为：
dNTPs(1.4mM)，Tris-HCl(pH＝8.8,20mM)，(NH4)2SO4(10mM)，KCl(10mM)，MgSO4(8mM)，甜菜碱(0.8M)，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶(8U)，AMV逆转录酶(0.5U)，荧光染料(SYBR green I 1μl)，白色念珠菌RNA(2μl)。63摄氏度扩增1h，将反应管置于80摄氏度水浴5min终止反应。肉眼观察浊度，或利用实时浊度仪实时监测核酸扩增反应过程，以直观的图文形式来显示整个反应过程中各个反应的速率和时间。
本发明采用的LAMP方法的检出率虽然低于培养方法，但是使用本发明的引物组的LAMP方法具有在1-2小时内提供结果的优点，这比通过基于培养的方法检测和鉴定真菌所需的时间快得多。
本发明中使用的DNA提取试剂盒易于处理，除冰冻冷冻外不需要任何特殊设备。其有利的是因为比许多常规的真菌DNA提取技术简单。因此，它不仅可以减少所需的时间，而且可以减少DNA提取过程中的步骤数，从而降低交叉污染的风险。此外，通过向LAMP产物的单链环区添加两个含有互补序列的寡核苷酸，即所谓的引物，可以缩短LAMP反应时间。

Claims (6)

1.一种女性阴道分泌物白色念珠菌检测用引物组，由外引物对F3/B3和内引物对FIP/BIP组成，F3、B3、FIP、BIP具体如下：
2.利用权利要求1所述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：F3、B3、FIP、BIP；
3)以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，63摄氏度扩增1小时，将反应管置于80摄氏度水浴5分钟终止反应。肉眼观察浊度，或用实时浊度仪实时监测核酸扩增反应过程，以直观的图文形式来显示整个反应过程中各个反应的速率和时间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，LAMP检测反应体系为：
dNTPs 1.4mM，Tris-HCl pH＝8.8，20mM，(NH4)2SO4 10mM，KCl 10mM，MgSO4 8mM，甜菜碱0.8M，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶0.5U，荧光染料SYBR green I 1μl，白色念珠菌RNA 2μl。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，F3、B3的浓度是10pmol，FIP、BIP的浓度是80pmol。
5.利用权利要求1所述的引物组检测女性阴道分泌物白色念珠菌的快速定量检测试剂盒，所述试剂盒至少包括含有权利要求1所述的引物组或权利要求2所述LAMP检测反应体系。
6.根据权利要求5所述的快速定量检测试剂盒，其中，LAMP检测反应体系为：
dNTPs 1.4mM，Tris-HCl pH＝8.8，20mM，(NH4)2SO4 10mM，KCl 10mM，MgSO4 8mM，甜菜碱0.8M，0.1％Tween 20，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶0.5U，荧光染料SYBR green I 1μl，白色念珠菌DNA 2μl。
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