CN102242206A

CN102242206A - 一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法

Info

Publication number: CN102242206A
Application number: CN2011101777199A
Authority: CN
Inventors: 熊正河; 钟其顶; 孟镇
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2011-11-16

Abstract

本发明涉及一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法，即末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术，属于微生物生态技术领域，主要步骤如下：1)以白酒发酵过程中的酒醅为样品，直接提取酒醅中总DNA；2)以总DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板，利用通用引物扩增细菌16S rDNA，其中正向引物5’端使用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记；3)PCR产物纯化后，利用限制性内切酶消化；4)DNA测序仪检测带有荧光标记的末端限制性片段，得到不同发酵时间酒醅中微生物群落T-RFLP图谱。本发明是不依赖于传统方法的分子生物学技术，具有分辨率高、方便、准确的特点，能够快速反映白酒发酵过程中微生物群落动态变化规律，为揭示酿造过程微生物群落多样性和定性定量分析提供了技术依据。

Description

一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法

技术领域

T-RFLP技术属于微生物生态学领域，在传统发酵食品中常被用于菌株鉴定、对比分析不同生态环境微生物多样性、评估复杂微生物群落多样性、发酵过程微生物动态消长等研究。

背景技术

末端限制性片段长度多样性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP)是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结构特征、菌种鉴定等多方面。

T-RFLP技术的原理是根据研究目的和微生物群落的特点，选择一段具有系统进化标记特征的DNA序列为目的片段，根据目标基因序列上的保守区设计引物，在其中一个引物的5’末端用荧光物质标记，采集样品后提取微生物的总DNA，以总DNA为模板进行PCR扩增，所得的PCR产物的一端就带有荧光标记，利用合适的限制性内切酶进行酶切，不同微生物目标DNA片段因其核苷酸序列不同导致其酶切位点存在差异，酶切后产生许多不同长度的限制性片段。将酶切产物用自动测序仪进行电泳分离和荧光检测，只有末端带荧光标记的片段(T-RFs)能被检测到，而其他没有带荧光标记的片段则检测不到。由于核苷酸序列具有多态性，即不同微生物同一基因的DNA片段在相同条件下酶切后得到长度不同的T-RFs，反映在T-RFLP检测中就是不同的荧光信号，荧光强度的大小可以确定菌种的丰度。通过对这些荧光信号以及由此生成的T-RFLP图谱的分析，根据不同长度的末端限制性片段至少代表一种微生物种类，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况，还可根据已知序列鉴定到种。

与其他分子指纹图谱技术相比，T-RFLP具有以下优势，1)操作简单，高通量，能够迅速产生大量重复、精确的数据，非常适合微生物群落时空变化研究；2)易于实现自动化，输出的数据能够进行快速分析；3)根据T-RFs的长度，与现有数据库比对，有可能直接鉴定群落图谱中的单个菌种；4)精密度和分辨率较高。

中国传统固态发酵蒸馏酒的生产是包括了环境、糖化发酵剂等中的微生物菌群相互迁徙以及在发酵过程中动态演化、交替并最终趋于稳定的动态平衡过程。白酒发酵过程微生物群落是整个白酒酿造微生物生态系统的重要组成部分，微生物群落消长变化引起发酵过程物质能量变化，同时物质能量变化又反作用于微生物群落，这种相互作用的不断交替进行是中国传统固态法白酒的典型特征风味形成的重要物质基础。

研究白酒发酵过程中微生物群落的变化规律有助于加强对白酒特征风味形成机理的认识和理解，为提高产品质量和改良酒体风格提供理论依据。由于白酒发酵过程中微生物之间作用机理非常复杂，而以往研究方法多沿用平板分离法，改变了样品中微生物群落组成，无法分析微生物与环境的相互关系，得到的只是可培养的那部分微生物信息，并且工作量大，操作繁琐。应用T-RFLP分析白酒发酵过程微生物群落结构多样性能够克服传统培养方法的局限，可以快速得到白酒发酵过程中微生物群落结构多样性信息和动态演变规律。

发明内容

本发明的目的是针对白酒发酵过程微生物群落结构多样性现有研究方法存在的问题，为解决部分微生物由于不可分离性造成难以直接研究的技术难题以及快速认识和了解白酒发酵过程中微生物动态变化规律，而提供的一种研究白酒发酵过程中微生物群落结构多样性的方法。

本发明的具体方案如下：

a)从某固态法白酒厂分别在发酵第1、3、7、10、15、21、28d时取酒醅样，酒醅取样后分别放置无菌离心管中，-20℃保存；

b)取0.5～2.0g酒醅样品加2～6.0mL 1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L NaH₂PO₄·7H₂O，1.4mmol/LKH₂PO₄)缓冲液，10000rpm，4℃离心10min，收集沉淀，加入DNA提取液提取总DNA；

c)以步骤b)中提取的总DNA为模板，采用通用引物扩增细菌16S rDNA。正向引物为27F，反向引物为1492R，其序列分别为：27F：(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R：(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，正向引物27F的5’-端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记；

d)PCR反应体系为50μL，包括10×PCR buffer 5μL，dNTPs(each 0.25mmol/L)4μL，引物(10μmol/L)各1.0μL，DNA模板30ng，Tap酶(5U)0.3μL。PCR反应条件采用降落策略：预变性94℃10min，前20个循环为94℃1min、65℃～55℃1min和72℃1.5min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，后10个循环为94℃1min、55℃1min和72℃3min，最后在72℃下延伸7min；

e)将步骤d)中得到的PCR产物用纯化试剂盒(OMEGA)按照使用说明进行纯化，纯化后进行电泳检测；

f)将步骤e)中得到的纯化后的产物利用限制性内切酶Msp I和Rsa I消化，20μL中反应体系包括10×buffer 2μL，10μL PCR产物，Msp I或RsaI各10U(1μL)，加入灭菌双蒸水至20μL。37℃消化2h后65℃温育10min；

g)酶切产物进行T-RFLP分析，得到酒醅发酵过程T-RFLP图谱，经数据处理，获知白酒发酵过程中微生物动态变化和消长规律。

本发明的优点是直接以酒醅DNA为研究对象，不改变酒醅样品中微生物组成，能够反映出酒醅在发酵过程中微生物组成原始面貌，具有快速、操作简单、准确的特点。

本发明的有益效果是为研究和揭示白酒发酵过程中微生物群落的变化规律提供了一种简便、快捷、准确的方法。

附图说明：

附图：实例中固态发酵池在发酵周期内不同发酵天数的微生物群落变化。

具体实施方式：

为更好的理解本发明，下面结合实例进一步阐述本发明。

从某固态法白酒厂发酵池中分别在发酵第3、7、10、21、28d时取酒醅样品，每次取样时都从上下层取样并混合均匀，取样后放置无菌离心管中，-20℃保存；取1g酒醅样品加6mL 1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L NaH₂PO₄·7H₂O，1.4mmol/L KH₂PO₄)缓冲液。8000g，4℃离心10min，收集沉淀，在沉淀中加入DNA提取液提取总DNA；以提取的总DNA为模板，采用通用引物扩增细菌16S rDNA。正向引物为27F，反向引物为1492R，其序列分别为：27F：(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R：(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，其中正向引物5’-端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记；PCR反应体系采用50μL体系，包括10×PCR buffer 5μL，dNTPs(each 0.25mmol/L)4μL，引物(10μmol/L)各1.0μL，DNA模板30ng，Tap酶(5U)0.3μL。PCR反应条件采用降落策略：预变性94℃10min，前20个循环为94℃1min、65℃～55℃1min和72℃1.5min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，后10个循环为94℃1min、55℃1min和72℃3min，最后在72℃下延伸7min。

PCR产物用纯化试剂盒(OMEGA)按照试剂盒使用说明进行纯化，纯化后进行电泳检测；将纯化后的产物分别利用限制性内切酶Msp I和Rsa I消化，消化体系采用20μL反应体系，包括10×buffer 2μL，10μL PCR产物，Msp I或RsaI各10U(1μL)，加入灭菌双蒸水至20μL。在恒温水浴37℃消化2h后65℃温育10min；利用DNA测序仪对酶切产物进行T-RFLP分析，得到酒醅发酵过程T-RFLP图谱，经数据处理，获知白酒发酵过程中微生物群落动态变化和消长规律。

总DNA提取方法：取1g酒醅样品加6mL 1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L NaH₂PO₄·7H₂O，1.4mmol/L KH₂PO₄)缓冲液。8000g，4℃离心10min，收集沉淀，在沉淀中加入4ml DNA提取液[0.1mol/L磷酸盐(pH 8.0)，0.1mol/LEDTA，0.1mol/LTris base(pH 8.0)，1.5mol/L NaCl，1.0％CTAB]，200μL溶菌酶(10mg/ml)，100μL溶壁酶(500U/ml)，37℃水浴1h，每15min轻轻摇晃一次。加60μL蛋白酶K(20mg/ml)，摇匀后，37℃水浴1h，每15min轻轻摇晃一次。加250μL的20％SDS溶液，65℃水浴1h，每15min轻轻摇晃一次。6000r/min离心10min，转移上清至新的5ml离心管中。加等体积氯仿∶异戊醇(V∶V，24∶1)，摇匀，9000r/min离心8min，转移上清至新的5ml离心管中，重复一次此步骤。转移上清至新的离心管中，加0.6倍体积异丙醇，室温沉淀过夜。12000r/min室温离心30min，弃去上清。在沉淀中加入预冷的70％乙醇，洗涤2次，13000r/min 4℃离心15min，加50μL无菌双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims

1.一种研究白酒发酵过程微生物群落多样性的方法，其特征在于包含以下步骤：

a)以某固态法白酒厂窖池发酵不同天数的酒醅为样品，取样后分别放置无菌离心管中，-20℃保存；

b)取0.5～2.0g酒醅样品加2.0～6.0mL 1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/L NaH₂PO₄·7H₂O，1.4mmol/LKH₂PO₄)缓冲液，10000rpm，4℃离心10min，收集沉淀，加入DNA提取液提取总DNA；

c)以步骤b)中提取的总DNA为模板，利用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，以获得细菌16S rDNA。其中正向引物27F的5’-端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记；

d)将步骤c)中得到PCR产物用纯化试剂盒按照使用说明进行纯化，纯化后利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；

e)将步骤d)中得到的纯化后的产物分别利用限制性内切酶Msp I和Rsa I消化，20μL中反应体系包括10×buffer 2μL，10μL PCR产物，Msp I或RsaI各10U(1μL)，加入灭菌双蒸水至20μL。37℃消化2h后65℃温育10min；

f)酶切产物进行T-RFLP分析，得到酒醅发酵过程T-RFLP图谱，经数据处理，获知白酒发酵过程中微生物动态变化和消长规律。

2.权利要求1的所述方法，其特征在于步骤a)中选择的样品是发酵不同天数的酒醅。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述酒醅取样量0.5～2.0g，缓冲液用量2.0～6.0mL。

4.权利要求2所述的方法，其特征在于所述取样量优选1.0g，缓冲液用量优选6.0mL。

5.权利要求1的方法，其特征在于步骤c)中正向引物27F的5’端使用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)中PCR扩增采用降落PCR(TOUCHDOWN)策略：预变性条件为94℃10min，前20个循环为94℃1min、65℃～55℃1min和72℃1.5min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，后10个循环为94℃1min、55℃1min和72℃3min，最后在72℃下延伸7min。