CN108559771A - 一种白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法 - Google Patents

一种白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，该方法包括以下步骤：1)酒曲样品的前处理，将酒曲中的微生物菌种用生理盐水洗涤、并沉淀；2)DNA的提取，将得到的微生物用液氮粉碎，再用氯仿和乙醇等提取得到DNA产物，随后用TEbuffer溶解得到DNA溶解液；3)基因组DNA的扩增，以样品总DNA为模板，采用PCR进行扩增；4)基因的测序，使用llumina Miseq测序平台对DNA扩增片段进行高通量测序；5)数据的分析，将得到的高通量测序数据采用Flash软件融合处理后，与现有数据库进行比对得到菌株信息。与现有技术相比，本发明具有分辨率高、样品需求量少、稳定性好、易控制等优点，适合于各类白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测。

Description

一种白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法
技术领域
本发明设计涉及一种微生物菌落多样性的检测方法，具体是一种白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法。
技术背景
白酒是中国独特的微生物固态酿造与蒸馏的产物。白酒的主要成分是乙醇和水(占总量的98％～99％)，同时其中还含有极少量的酸、酯、醇、醛等有机化合物，这些化合物以一定的比例共存在酒体中，形成了不同香型和不同风格的白酒。在我国传统酿酒工艺中，酒曲、酒醅、酒糟等的酿造不仅孕育了丰富的微生物，而且还是生产优质白酒的重要原料。微生物的存在不仅能使高粱、稻谷、小麦等原料发生一系列复杂的生化反应，分解脂肪、淀粉等使其生成糖脂、氨基酸等物质，进而引发一系列其他的反应，从而生成白酒独特的风味前驱物。
不同的微生物对淀粉、蛋白质、脂肪等物质的分解也不尽相同，其分解得到的小分子物质最终是形成醇、醛、酮、酯等物质，进而从整体上影响白酒的风味品质。然而，由于地域的不同、环境的差异、加工环境的不同，不同企业在白酒酿制过程中使得微生物的多样性也相差许多，从而呈现了不同风味的白酒香型。
有鉴于此，研究白酒酿造过程中微生物系统的多样性及其生长规律，对于弄清微生物的生长代谢和白酒风味的机制而言显得十分重要，也是白酒企业控制产品风味的重要途径。1975年，贵州省轻工业科学研究所以风味为导向首次开始对茅台酒酿造微生物进行研究，认定了茅台酒曲是一种高温细菌酒曲，并首次鉴定出了17种芽孢杆菌。2003年，中国科学院成都生物研究所以普通酱香型白酒生产所使用的高温大曲含菌样品，经过分离获得1株嗜热芽孢杆菌，并对其生化和香气特征进行了测定。然而，当前对于白酒酿造过程中，微生物种类测定的方法尚不多见，因此本发明提供了一种可用于测定白酒酿造过程中微生物多样性的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种检测白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法,该方法具有操作简单便捷、检测极限低、灵敏度高等特点。
本发明解决其技术问题是通过以下技术方案来实现的：
取一定量的酒曲样品加入锥形瓶中，加入质量浓度为0.85％的无菌生理盐水，将锥形瓶置于温度为20-25℃、转速为200-500rpm摇床中摇晃20-40min，采用灭菌后的粗棉布过滤去除酒曲固体渣，将滤液置于12000rpm、5℃下离心10-15min，去除滤液，得到的沉淀物即为微生物。
取10-20mg上述微生物于EP管中，用液氮研磨成粉末后，加入0.3-0.5ml Dzup，超声震荡3-5min,常温静置5-10min，再加入0.3-0.5ml氯仿，超声震荡3-5min，常温静置3-5min，得到混合液1；将所述的混合液1置于10000rpm、室温下离心10-15min，得到上清液1；向所述的上清液1中加入与所述上清液1等体积的无水乙醇，置于震荡仪上震荡混合2-3min，然后于7000-9000rpm、室温下离心4-8min，去除离心液，向得到的沉淀物中加入2-3ml的70-75％乙醇，于震荡仪上震荡混合10-15min，进行漂洗，然后在12000rpm、室温下离心2-5min，去除离心液，得到DNA沉淀物；将所述的DNA沉淀物置于5-15℃真空干燥器中干燥5-10min，得到干燥后DNA产物；将所述的干燥后的DNA产物溶于TEbuffer，置于震荡仪上震荡混合3-5min，然后在12000rpm、室温下离心2-5min，得到DNA溶解液。
在PCR管中加入以下组分：模板DNA，6.0μl；引物1，1.0μl；引物2，1.0μl；dNTPs，2.0μl；PCR Buffer，10.0μl；Taq DNA聚合酶，2.0μl；双蒸水，76.0μl；
将PCR管置于PCR仪器中，并按照如下程序进行运行：93-96℃下预变性5min，90-96℃下变性40-45s，40-43℃下退火40-50s，72℃下延伸50-60s，循环30-35次，72℃延伸9-10min；得到PCR产物；取所述的PCR产物3-5μl，加入0.8-1μl的凝胶加样缓冲液混合均匀，进行1.5％琼脂糖凝胶120V恒电压电泳，检测PCR效果，获得DNA扩增片段；
使用Ⅰllumina Miseq测序平台，对得到的DNA扩增片段进行高通量测序。将得到的高通量测序数据采用Flash软件融合双末端序列，并根据barcode使数据回归样本，采用Prinseq对各样本序列做QC，去除嵌合体、两端Primer以及非靶区序列得出最终可用于分析的序列数目；将得到的序列采用RDP classifier软件对各序列进行物种分类，并与数据库进行物种对比，以序列之间的相似性97％为最低域值进行归类判别。
优选地，所述的酒曲与生理盐水的比为1g：8-15ml。
优选地，所述的超声条件为40-120KHZ。
优选地，所述的引物1为16rDNA通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和806R(5’-GGACTACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，所述的引物2为ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。
本发明较佳实施例提供的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法的有益效果是：采用灭菌后的粗棉布过滤去除酒曲固体渣，既可以避免使用纱布过滤不彻底，使部分固体渣透过纱布，又可以避免使用滤纸过滤，使菌体无法透过滤纸；使用超声波和振荡仪可以使得液体在较短的时间内得到较好的混合，避免手动混合耗时久、混合不均匀等缺点；使用较低温度的真空干燥器，既可以在较短时间内快速去除DNA表面的乙醇，又可以避免高温对DNA结构的破坏。采用高通量测序技术不仅可以突破传统微生物学的限制，而且可以对样品中的优势菌群等进行数字化的检测，该技术可以准确地检测微生物菌落的多样性，具有分辨率高、样品需求量少、稳定性好、易控制等优点，适合于各类白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测。
附图说明
图1是本方面实施例1得到的PCR电泳图片
图2是本发明实施例2得到的PCR电泳图片
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法进行具体说明。
实施例一
取2g的酒曲样品加入锥形瓶中，加入20ml质量浓度为0.85％的无菌生理盐水，将锥形瓶置于温度为20℃、转速为250rpm摇床中摇晃30min，采用灭菌后的粗棉布过滤去除酒曲固体渣，将滤液置于12000rpm、5℃下离心11min，去除滤液，得到的沉淀物即为微生物。
取10mg上述微生物于EP管中，用液氮研磨成粉末后，加入0.4ml Dzup，超声震荡3min,常温静置5min，再加入0.3ml氯仿，超声震荡5min，常温静置5min，得到混合液1；将所述的混合液1置于10000rpm、室温下离心12min，得到上清液1；向所述的上清液1中加入与所述上清液1等体积的无水乙醇，置于震荡仪上震荡混合2min，然后于7000rpm、室温下离心5min，去除离心液，向得到的沉淀物中加入2ml体积分数为70％的乙醇，于震荡仪上震荡混合15min，进行漂洗，然后在12000rpm、室温下离心3min，去除离心液，得到DNA沉淀物；将所述的DNA沉淀物置于5℃真空干燥器中干燥10min，得到干燥后DNA产物；将所述的干燥后的DNA产物溶于TEbuffer，置于震荡仪上震荡混合4min，然后在12000rpm、室温下离心3min，得到DNA溶解液。
在PCR管中加入以下组分：模板DNA，6.0μl；引物1，1.0μl；引物2，1.0μl；dNTPs，2.0μl；PCR Buffer，10.0μl；Taq DNA聚合酶，2.0μl；双蒸水，76.0μl；
将PCR管置于PCR仪器中，并按照如下程序进行运行：94℃下预变性5min，95℃下变性40s，40-43℃下退火45s，72℃下延伸50s，循环30次，72℃延伸9min；得到PCR产物；取所述的PCR产物4μl，加入0.9μl的凝胶加样缓冲液混合均匀，进行1.5％琼脂糖凝胶120V恒电压电泳，检测PCR效果，获得DNA扩增片段；
使用Ⅰllumina Miseq测序平台，对得到的DNA扩增片段进行高通量测序。将得到的高通量测序数据采用Flash软件融合双末端序列，并根据barcode使数据回归样本，采用Prinseq对各样本序列做QC，去除嵌合体、两端Primer以及非靶区序列得出最终可用于分析的序列数目；将得到的序列采用RDP classifier软件对各序列进行物种分类，并与数据库进行物种对比，以序列之间的相似性97％为最低域值进行归类判别。
实施例二
取1g的酒曲样品加入锥形瓶中，加入15ml质量浓度为0.85％的无菌生理盐水，将锥形瓶置于温度为25℃、转速为300rpm摇床中摇晃25min，采用灭菌后的粗棉布过滤去除酒曲固体渣，将滤液置于12000rpm、5℃下离心10min，去除滤液，得到的沉淀物即为微生物。
取10mg上述微生物于EP管中，用液氮研磨成粉末后，加入0.3ml Dzup，超声震荡3min，常温静置5min，再加入0.4ml氯仿，超声震荡5min，常温静置5min，得到混合液1；将所述的混合液1置于10000rpm、室温下离心10min，得到上清液1；向所述的上清液1中加入与所述上清液1等体积的无水乙醇，置于震荡仪上震荡混合3min，然后于8000rpm、室温下离心6min，去除离心液，向得到的沉淀物中加入2.5ml体积分数为70％的乙醇，于震荡仪上震荡混合12min，进行漂洗，然后在12000rpm、室温下离心3min，去除离心液，得到DNA沉淀物；将所述的DNA沉淀物置于10℃真空干燥器中干燥7min，得到干燥后DNA产物；将所述的干燥后的DNA产物溶于TEbuffer，置于震荡仪上震荡混合4min，然后在12000rpm、室温下离心4min，得到DNA溶解液。
在PCR管中加入以下组分：模板DNA，6.0μl；引物1，1.0μl；引物2，1.0μl；dNTPs，2.0μl；PCR Buffer，10.0μl；Taq DNA聚合酶，2.0μl；双蒸水，76.0μl；
将PCR管置于PCR仪器中，并按照如下程序进行运行：95℃下预变性5min，92℃下变性45s，43℃下退火43s，72℃下延伸50s，循环33次，72℃延伸9min；得到PCR产物；取所述的PCR产物4μl，加入1μl的凝胶加样缓冲液混合均匀，进行1.5％琼脂糖凝胶120V恒电压电泳，检测PCR效果，获得DNA扩增片段；
使用Ⅰllumina Miseq测序平台，对得到的DNA扩增片段进行高通量测序。将得到的高通量测序数据采用Flash软件融合双末端序列，并根据barcode使数据回归样本，采用Prinseq对各样本序列做QC，去除嵌合体、两端Primer以及非靶区序列得出最终可用于分析的序列数目；将得到的序列采用RDP classifier软件对各序列进行物种分类，并与数据库进行物种对比，以序列之间的相似性97％为最低域值进行归类判别。
实施例三
取2g的酒曲样品加入锥形瓶中，加入25ml质量浓度为0.85％的无菌生理盐水，将锥形瓶置于温度为25℃、转速为400rpm摇床中摇晃25min，采用灭菌后的粗棉布过滤去除酒曲固体渣，将滤液置于12000rpm、5℃下离心13min，去除滤液，得到的沉淀物即为微生物。
取15mg上述微生物于EP管中，用液氮研磨成粉末后，加入0.5ml Dzup，超声震荡5min，常温静置8min，再加入0.4ml氯仿，超声震荡5min，常温静置5min，得到混合液1；将所述的混合液1置于10000rpm、室温下离心10min，得到上清液1；向所述的上清液1中加入与所述上清液1等体积的无水乙醇，置于震荡仪上震荡混合3min，然后于9000rpm、室温下离心6min，去除离心液，向得到的沉淀物中加入3ml体积分数为75％的乙醇，于震荡仪上震荡混合12min，进行漂洗，然后在12000rpm、室温下离心3min，去除离心液，得到DNA沉淀物；将所述的DNA沉淀物置于10℃真空干燥器中干燥8min，得到干燥后DNA产物；将所述的干燥后的DNA产物溶于TEbuffer，置于震荡仪上震荡混合5min，然后在12000rpm、室温下离心3min，得到DNA溶解液。
在PCR管中加入以下组分：
模板DNA，6.0μl；引物1，1.0μl；引物2，1.0μl；dNTPs，2.0μl；PCR Buffer，10.0μl；Taq DNA聚合酶，2.0μl；双蒸水，76.0μl；
将PCR管置于PCR仪器中，并按照如下程序进行运行：95℃下预变性5min，92℃下变性45s，43℃下退火43s，72℃下延伸50s，循环30次，72℃延伸9min；得到PCR产物；取所述的PCR产物4μl，加入1μl的凝胶加样缓冲液混合均匀，进行1.5％琼脂糖凝胶120V恒电压电泳，检测PCR效果，获得DNA扩增片段；
使用Ⅰllumina Miseq测序平台，对得到的DNA扩增片段进行高通量测序。将得到的高通量测序数据采用Flash软件融合双末端序列，并根据barcode使数据回归样本，采用Prinseq对各样本序列做QC，去除嵌合体、两端Primer以及非靶区序列得出最终可用于分析的序列数目；将得到的序列采用RDP classifier软件对各序列进行物种分类，并与数据库进行物种对比，以序列之间的相似性97％为最低域值进行归类判别。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表
DNA人工序列1：
TCTTGAAGTGATCGGTGATACTGATAAGACCGGAACGATTACGCACTTCGTTCCGGATCCGGAAATTTTCAAAGAAACAACCGAATACGACTATGACCTGCTTTCAAACCATCCGGCGGTCTTCACGGTGTAGGGGCGTCTGTCGTAAACGCCTTGTCGACCACTCTTGACGTTACGGTTCATCGTGACGGAAGTGTCCGGGAATTGGCCTTCCTGACAAAAG
DNA人工序列2：
GTGTAAACATCACGATTGAAGACAAACGTGAAGGACAAGAACGGAAAAACGAGTACCACTACGAAGGCGGAATCAAAAGCTATGTTGAGTACTTAAACCGTTCCAAAGAAGTCGTTCATGAAGAGCCGATTTATATCGAAGGCGAGAAAGACGGCATAACGGTTGAAGTTGCATTGCAATACAACGACAGCTATACAAGCAATATTTATT
DNA人工序列3：
AGCTTTCACAAATAATATCAACACATACGAAGGCGGCACGCACGAAGCCGGATTTAAAACCGGTCTGACCCGTGTTATAAACGACTATGCAAGAAGAAAAGGGATTTTCAAAGAAAATGATCCGAATTTAAGCGGGGATGAT
DNA人工序列4：
AGTCACGCAGGTGAGGGAAGGGCTGACTGCCATTATTTCAATTAAGCACCCTGATCCGCAATTCGAAGGGCAGACGAAAACGAAGCTCGGCAACTCCGAAGCGAGAACGATCACTGATACGCTGTTTTCTTCTGCGCTGGAAACATTCCTCAGGTCA
DNA人工序列5：
TCTTGAAAATCCGGACTCAGCCCGCAAAATCGTTGAAAAAGGTTTAATGGCCGCAAGAGCGCGGATGGCAGCGAAAAAAGCGCGGGAATTGACCCGCCGCAAAAGTGCGCTTGAGATTTCCAATCTGCCGGGCAAACTGGCGGACTGTTCTTCTAAAGATCCGAGCATTTCCGAGCTGTATATCGTAGAGGGTGACTCTGCGGGCGGACGGGACCGTCATTTCCAAGCCATTCTGCCGCTGCGCGGTAAGATTCTGAACGTTGAG
序列表是由实施例1测得的白酒酿造过程中酒曲中微生物DNA序列，通过RDPclassifier软件对各序列进行物种分类，并与数据库进行物种对比，得到以下菌株信息：
表1样品中微生物的种类及含量
DNA人工序列 微生物 比例(％)
1 曲霉菌 14.12
2 醋酸杆菌 17.98
3 乳酸杆菌 19.55
4 假丝酵母菌 4.68
5 木拉克酵母菌 5.66

Claims (9)

1.一种白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)酒曲样品的前处理；2)DNA的提取及分析；3)基因组DNA的扩增；4)基因的测序；5)数据的分析。
2.根据权利要求1所述的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，所述的酒曲样品的前处理步骤包括：取一定量的酒曲样品加入锥形瓶中，加入质量浓度为0.8-0.9％的无菌生理盐水，将锥形瓶置于温度为20-25℃、转速为200-500rpm摇床中摇晃20-40min，采用灭菌后的粗棉布过滤去除酒曲固体渣，将滤液置于12000rpm、5℃下离心10-15min，去除滤液，得到的沉淀物即为微生物。
3.根据权利要求2所述的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，所述的DNA的提取步骤包括：
(1)取10-20mg上述微生物于EP管中，用液氮研磨成粉末后，加入0.3-0.5ml Dzup，超声震荡3-5min,常温静置5-10min，再加入0.3-0.5ml氯仿，超声震荡3-5min，常温静置3-5min，得到混合液1；(2)将所述的混合液1置于10000rpm、室温下离心10-15min，得到上清液1；(3)向所述的上清液1中加入与所述上清液1等体积的无水乙醇，置于震荡仪上震荡混合2-3min，然后于7000-9000rpm、室温下离心4-8min，去除离心液，向得到的沉淀物中加入2-3ml的70-75％乙醇，于震荡仪上震荡混合10-15min，进行漂洗，然后在12000rpm、室温下离心2-5min，去除离心液，得到DNA沉淀物；(4)将所述的DNA沉淀物置于5-15℃真空干燥器中干燥5-10min，得到干燥后DNA产物；(5)将所述的干燥后的DNA产物溶于TEbuffer，置于震荡仪上震荡混合3-5min，然后在12000rpm、室温下离心2-5min，得到1-2ng/μl的DNA溶解液。
4.根据权利要求1所述的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，所述的基因组DNA的扩增步骤包括：(1)在PCR管中加入以下组分：所述的DNA溶解液，6.0μl；引物1，1.0μl；引物2，1.0μl；dNTPs，2.0μl；PCR Buffer，10.0μl；Taq DNA聚合酶，2.0μl；双蒸水，76.0μl；
(2)将PCR管置于PCR仪器中，并按照如下程序进行运行：93-96℃下预变性5min，90-96℃下变性40-45s，40-43℃下退火40-50s，72℃下延伸50-60s，循环30-35次，72℃延伸9-10min；得到PCR产物；
(3)取所述的PCR产物3-5μl，加入0.8-1μl的凝胶加样缓冲液混合均匀，进行1-1.5％琼脂糖凝胶120V恒电压电泳，检测PCR效果，获得DNA扩增片段。
5.根据权利要求1所述的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，所述的基因的测序步骤包括：使用Ⅰllumina Miseq测序平台对所述的DNA扩增片段进行高通量测序。
6.根据权利要求1所述的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，所述的数据的分析步骤包括：(1)将得到的高通量测序数据采用Flash软件融合双末端序列，并根据barcode使数据回归样本，采用Prinseq对各样本序列做QC，去除嵌合体、两端Primer以及非靶区序列得出最终可用于分析的序列数目；(2)将得到的序列采用RDPclassifier软件对各序列进行物种分类，并与数据库进行物种对比，以序列之间的相似性97％为最低域值进行归类判别。
7.根据权利要求2所述的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，所述的酒曲与生理盐水的比为1g：8-15ml。
8.根据权利要求3所述的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，所述的超声条件为40-120KHZ。
9.根据权利要求4所述的白酒酿造过程中微生物菌落多样性的检测方法，其特征在于，所述的引物1为16rDNA通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和806R(5’-GGACTACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，所述的引物2为ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。
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