CN111363786A - 一种大曲霉菌生物量的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大曲霉菌生物量的定量检测方法，所述方法包括采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液溶解和/或洗涤大曲样品，从上清中收集微生物沉淀并提取微生物DNA，进行荧光定量PCR检测，根据标准曲线计算霉菌生物量。本发明采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液预处理大曲样品，淀粉酶和二氧化硅珠子协同配合，实现了短时间内高效溶解大曲中的淀粉的技术效果；基于SYBR Green荧光定量PCR技术，利用根霉和毛霉的特异性引物对进行PCR扩增，实现了实时监测不同发酵时期大曲根霉生物量和毛霉生物量的变化趋势的效果。

Description

一种大曲霉菌生物量的定量检测方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，属于生物检测技术领域，涉及一种大曲霉菌生物量的定量检测方法，尤其涉及一种大曲根霉和毛霉生物量的定量检测方法。

背景技术

制曲技术是我国特有的民族遗产，丰富了人民的物质生活，代表了一个时代的进步。大曲是指以小麦为主要原料制成的形状较大并且含有多种微生物的曲块，是酿酒用的糖化剂和发酵剂。大曲中的微生物主要包括霉菌、细菌、酵母菌和放线菌。其中，霉菌是大曲中的主要菌种，在酿酒过程中发挥着重要作用，制曲的原理就是极大限度地促进有益霉菌的生长繁殖。根霉菌菌丝多核，没有被隔膜分成分支状，根霉属内主要包括无根根霉、黑根霉、米根霉和中华根霉等，其中米根霉具有较强的糖化能力，广泛应用于制曲、酿酒生产中，但是由于可以产生乳酸，对发酵不利。毛霉以孢囊孢子和接合孢子繁殖，因其分解蛋白质能力强，对大曲的品质有一定的积极影响，但是在大曲微生物中属于感染菌。因此，跟踪制曲过程中根霉和毛霉生物量的动态变化，对加强型大曲、大曲酶制剂等的研发、白酒酿造工艺的改良、白酒品质的提升具有重要意义。

在制曲过程中，曲块表面存在肉眼可见的网状菌丝体，即根霉和毛霉，但是两者不易区分和分离。霉菌生物量的测定通常采用平板菌落法，但是该方法存在一定的局限性。在霉菌生长初期，菌丝大量生长，菌落数难以真实反映霉菌的生长状况，并且平板计数耗时较长，无法及时判断大曲的质量，从而造成经济损失。同时，白酒酿造是多种微生物混合固态发酵的结果，无法采用霉菌干重称量法、测定氨基葡萄糖等细胞成分的方法表征霉菌含量。

荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或者荧光标记特异性探针，利用荧光信号累积对PCR产物进行标记跟踪，实时监测整个PCR进程，最后根据已知拷贝数模板建立的标准曲线对未知样品进行绝对定量分析，反映微生物在固态发酵过程中的生物量变化。荧光定量PCR技术具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点，已被广泛应用于环境、食品等领域，测定细菌、酵母、丝状真菌等含量。

在进行PCR之前首先需要提取生物样本的DNA，但是大曲中含有大量的淀粉，对提取霉菌的总DNA十分不利。

因此，有必要提供一种方法定量检测大曲中根霉和毛霉的生物量，在制曲技术领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种大曲霉菌生物量的定量检测方法，所述方法首先对大曲进行淀粉酶前处理，充分暴露大曲中的霉菌提取霉菌DNA，再基于实时荧光定量PCR技术定量检测大曲中根霉和毛霉的含量，实现了实时监测根霉属和毛霉属在固态发酵不同时期的生物量变化的效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种大曲样品的处理方法，所述处理方法包括采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液溶解和/或洗涤大曲样品。

本发明中，采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液预处理大曲样品，淀粉酶对大曲样品中丰富的淀粉具有分解作用，与二氧化硅珠子相互配合，可以在短时间内充分破碎大曲样品，提高了淀粉酶与淀粉的接触率，强化了淀粉酶对曲块中淀粉的溶解效果。

优选地，所述二氧化硅珠子的粒径为1～5mm，例如可以是1mm、2mm、3mm、4mm或5mm。

本发明中，粒径为1～5mm的二氧化硅珠子与曲块的结构相匹配，可以实现对曲块的充分破碎，与淀粉酶协同作用，增加淀粉酶与曲块中淀粉的接触率，高效降解了曲块中的大量淀粉，使得从曲块中提取微生物基因组DNA不被淀粉污染。

优选地，所述二氧化硅珠子与所述淀粉酶溶液的质量比为1:(1～10)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。

本发明中，二氧化硅珠子与淀粉酶溶液的质量比需要限定在1:(1～10)的范围内，比例过低不能充分振荡粉碎曲块，比例过高对大曲样本具有污染作用。

优选地，所述淀粉酶在所述淀粉酶溶液中的浓度为5～15U/mL，例如可以是5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL、11U/mL、12U/mL、13U/mL、14U/mL或15U/mL。

本发明中，淀粉酶的浓度需要限定在5～15U/mL的范围内，淀粉酶浓度过低不利于充分溶解样品中的淀粉，浓度过高虽然可以对淀粉实现充分溶解，但是会造成基因组DNA的蛋白质污染，不利于进行PCR反应。

优选地，所述淀粉酶溶液的溶剂为PBS缓冲液。

优选地，所述大曲样品和所述淀粉酶溶液的质量体积比为1:(1～10)mg/mL，例如可以是1:1mg/mL、1:2mg/mL、1:3mg/mL、1:4mg/mL、1:5mg/mL、1:6mg/mL、1:7mg/mL、1:8mg/mL、1:9mg/mL或1:10mg/mL。

优选地，所述溶解在旋涡振荡条件下进行。

优选地，所述旋涡振荡的时间为2～10min，例如可以是2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。

作为优选技术方案，本发明提供了一种大曲样品的处理方法，所述方法包括以下步骤：

向大曲样品中加入含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液，所述大曲样品和所述淀粉酶溶液的质量体积比为1:(1～10)mg/mL，旋涡振荡2～10min，分离上清和沉淀；

将沉淀采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液洗涤，离心收集上清；

所述二氧化硅珠子的粒径为1～5mm；

所述二氧化硅珠子与所述淀粉酶溶液的质量比为1:(1～10)；

所述淀粉酶在所述淀粉酶溶液中的浓度为5～15U/mL。

第二方面，本发明提供了一种大曲霉菌生物量的定量检测方法，所述定量检测方法包括采用第一方面所述的处理方法处理大曲样品后，从上清中收集微生物沉淀并提取微生物DNA，进行荧光定量PCR检测，根据标准曲线计算霉菌生物量。

优选地，所述霉菌包括根霉和/或毛霉。

优选地，所述荧光定量PCR的引物包括如SEQ ID NO:1～4所示的核酸序列；

SEQ ID NO:1：GGTGATGGACAAGCTCGGTT；

SEQ ID NO:2：GCACGATGGCTAGGTAGTTCGTA；

SEQ ID NO:3：TTGATAAACCTTTGGATTTGC；

SEQ ID NO:4：GCACACTGGTAAAAAATTAG。

本发明中，SEQ ID NO:1～2所示的引物对为根霉特异性引物对Primer R，扩增产物长度达101bp，SEQ ID NO:3～4所示的引物对为毛霉特异性引物对Primer M，扩增产物长度达130bp。

优选地，所述标准曲线的建立方法包括：

构建含有根霉基因或毛霉基因的阳性质粒；

将已知浓度的阳性质粒进行梯度稀释，进行荧光定量PCR，以阈值循环数Ct值为横坐标，以阳性质粒拷贝数的对数为纵坐标，建立标准曲线。

优选地，所述阳性质粒的构建方法为将根霉基因或毛霉基因插入T载体中，转化感受态细胞，筛选阳性克隆后扩大培养，提取质粒得到所述含有根霉基因或毛霉基因的阳性质粒。

作为优选技术方案，本发明提供了一种大曲霉菌生物量的定量检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向大曲样品中加入含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液，所述大曲样品和所述淀粉酶溶液的质量体积比为1:(1～10)mg/mL，旋涡振荡2～10min，分离上清和沉淀；将沉淀采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液洗涤，离心收集上清；

所述二氧化硅珠子的粒径为1～5mm；

所述二氧化硅珠子与所述淀粉酶溶液的质量比为1:(1～10)；

所述淀粉酶在所述淀粉酶溶液中的浓度为5～15U/mL；

(2)将上清在5000～10000g下离心1～10min，收集微生物沉淀，并提取微生物DNA；

(3)采用如SEQ ID NO:1～4所示的核酸序列扩增根霉基因或毛霉基因；

(4)根据标准曲线计算霉菌生物量。

第三方面，本发明提供了一种第一方面所述的处理方法和/或第二方面所述的定量检测方法在制备大曲中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液预处理大曲样品，淀粉酶和二氧化硅珠子协同配合，实现了短时间内高效溶解大曲中的淀粉的技术效果，显著提高了大曲中总DNA的提取效率；

(2)本发明基于SYBR Green荧光定量PCR技术，利用根霉和毛霉的特异性引物对进行PCR扩增，实现了实时监测不同发酵时期大曲中根霉生物量和毛霉生物量的变化趋势的效果，检测效率高，检测时间短；

(3)本发明的荧光定量PCR法与传统的霉菌计数法相比，具有操作简便、准确度高和灵敏度高等特点，能够及时指导生产，为大曲中霉菌菌群动态变化和白酒风味物质形成机理提供了技术支持，为酒厂稳定运行提供了有力保障。

附图说明

图1为采用根霉引物进行荧光定量PCR的熔解曲线；

图2为采用毛霉引物进行荧光定量PCR的熔解曲线；

图3为采用根霉引物进行荧光定量PCR的标准曲线；

图4为采用毛霉引物进行荧光定量PCR的标准曲线。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1大曲样品预处理

称取7.5g大曲样品，加入30mL 0.1M PBS缓冲液配制的10U/mL淀粉酶溶液，淀粉酶溶液中含有150mg二氧化硅珠子(粒径为1mm)，旋涡振荡5min，200g离心5min，分离上清和沉淀；

将沉淀用添加有二氧化硅珠子和10U/mL淀粉酶的PBS缓冲液重复洗涤3次，离心后收集全部上清；

将收集的所有上清在9000g下离心3min，收集微生物沉淀，并用5mL添加有二氧化硅珠子和10U/mL淀粉酶的PBS缓冲液重复洗涤3次，重悬于0.2mL PBS缓冲液中，-20℃保存。

对比例1

与实施例1相比，对比例1采用30mL 0.1M PBS缓冲液替代淀粉酶溶液进行大曲样品预处理，其他条件与实施例1相同。

对比例2

与实施例1相比，对比例2采用30mL 0.1M PBS缓冲液配制的10U/mL淀粉酶溶液进行大曲样品预处理，淀粉酶溶液中未加入二氧化硅珠子，其他条件与实施例1相同。

对比例3

与实施例1相比，对比例3采用30mL 0.1M PBS缓冲液替代淀粉酶溶液进行大曲样品预处理，PBS缓冲液中含有150mg二氧化硅珠子，其他条件与实施例1相同。

对比例4

与实施例1相比，淀粉酶溶液中的二氧化硅珠子的粒径为10mm，其他条件与实施例1相同。

对比例5

与实施例1相比，淀粉酶溶液中的淀粉酶的浓度为20U/mL，其他条件与实施例1相同。

实施例2微生物基因组DNA的提取

向实施例1和对比例1-5的预处理样品中加入1mL Buffer Z(0.01M Tris，0.15MNaCl，HCl调至pH＝8.0)，混匀后，转移到添加有0.3g石英砂(直径0.1mm)的螺帽管中，加入150μL苯酚，细胞破碎仪以最大速度击打240s，每处理80s将螺帽管冰浴1min；破碎结束后加入110μL 10％SDS，轻轻混匀，冰浴10min，第5min轻轻颠倒摇匀，冰浴结束后1500g离心10min，收集上清液；加入1/10体积3M NaAc和等体积的氯仿异戊醇(24:1)，混匀后15000g离心10min，收集上清；再加入1/2体积提取酚，1/2体积氯仿，轻轻混匀，15000g离心10min，收集上清；再加入等体积氯仿异戊醇(24:1)，混匀后15000g离心5min，取上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀过夜，15000g离心15min，弃上清，沉淀经真空冷冻干燥后加入30μLddH₂O，得到微生物基因组DNA提取液。

使用NanoDrop ND-2000C测定基因组DNA的浓度，结果如表1所示，可以看出，实施例1采用0.1M PBS缓冲液配制的含有150mg二氧化硅珠子(粒径为1mm)的10U/mL淀粉酶溶液预处理大曲样品，可以在较短的时间内充分溶解大曲中的淀粉，使大曲中的微生物释放到上清液中，提取的微生物基因组DNA的纯度高；

对比例1未采用淀粉酶溶液处理大曲样品，曲块中的淀粉影响了基因组DNA的提取，提取的DNA淀粉污染严重，A260/A230仅0.40；对比例2采用的淀粉酶溶液中未添加二氧化硅珠子，不利于淀粉酶在短时间内分解掉曲块中的淀粉，一定程度降低了DNA的纯度；对比例3虽然采用含有二氧化硅珠子的PBS缓冲液预处理大曲样品，但是由于不含有淀粉酶溶液，无法分解曲块中的淀粉，提取的DNA淀粉污染严重，纯度低；对比例4采用的二氧化硅珠子的粒径过大，旋涡振荡不能充分粉碎大曲样品，使得淀粉酶对曲块中淀粉的分解作用下降；对比例5的淀粉酶浓度过高，虽然可以充分分解样品中的淀粉，但是造成了DNA样本的蛋白质污染。

表1

编号	A260/A280	A260/A230
			实施例1	1.95	2.18
对比例1	1.67	0.40
			对比例2	1.78	1.56
对比例3	1.73	0.72
			对比例4	1.79	1.88
对比例5	1.21	2.06

实施例3引物特异性验证

根据GenBank中已报道的根霉和毛霉ITS基因序列，使用Oligo软件设计特异性引物，并对大曲中筛选出的31种常见霉菌DNA进行特异性扩增。

PCR扩增体系的总体积为20μL，包括10μL Roch SYBR Green I Master，0.5μM正反向引物对(SEQ ID NO:1～2或SEQ ID NO:3～4)，1μL模板，8μL ddH₂O；普通PCR程序为95℃5min；进入30个循环，95℃15s，60℃35s；PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，电压为120V，时间为50min。

如表2和表3所示，+为阳性PCR扩增，即模板能与引物结合，-为阴性PCR扩增，即模板不能与引物结合；可以看出，其他霉菌DNA片段均不能与根霉引物Primer R(SEQ ID NO:1～2)和毛霉引物Primer M(SEQ ID NO:3～4)结合，引物特异性强，与大曲中其他常见霉菌无交叉反应。

利用根霉引物Primer R和毛霉引物Primer M对提取的大曲基因组DNA进行荧光定量PCR，PCR扩增体系的总体积为20μL，包括10μL Roch SYBR Green I Master，0.5μM正反向引物对(SEQ ID NO:1～2或SEQ ID NO:3～4)，1μL模板，8μL ddH₂O；荧光定量PCR程序为95℃5min；进入40个循环，95℃15s，60℃35s，60℃处检测荧光信号；PCR循环结束后，在60～95℃区间通过荧光信号检测绘制熔解曲线，检测间隔为0.3℃。

由图1和图2可知，大曲样品DNA的熔解曲线呈单一熔解峰，无其他杂峰，表明根霉引物Primer R和毛霉引物Primer M的特异性强。

表2根霉引物Primer R特异性验证

表3毛霉引物M1特异性验证

实施例4标准曲线的建立

利用实施例2的方法从大曲样品中提取微生物基因组DNA，采用根霉引物Primer R和毛霉引物Primer M进行普通PCR扩增，扩增程序为95℃5min；进入35个循环，95℃40s，55℃35s，72℃30s；75℃10min；10℃∞；PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，电压为120V，时间为50min；

电泳完毕后，在紫外灯下快速切下含有目的片段的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，上海生工生物工程公司，中国)进行纯化回收，操作按照说明书进行；

将纯化的目的基因片段与pMD19-T质粒进行连接(pMD^TM 19-T Vector CloningKit，TaKaRa，Japan)，操作按照说明书进行；将连接好的载体导入感受态细胞(E.coli DH5αElectro-Cells，TaKaRa，Japan)，冰浴30min，42℃孵育90s，冰浴5min；将转化液涂布于添加有抗生素的LB固体培养基上(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％NaCl)，其中氨苄青霉素的终浓度为1‰，并于37℃培养10～15h；挑取大肠杆菌单菌落进行PCR验证，含有目的片段的菌落进行液体扩培(37℃，8～12h)，并用质粒小提试剂盒进行质粒提取和纯化(SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，上海生工生物工程公司，中国)；

使用NanoDrop ND-2000C测定阳性质粒浓度，根据以下公式计算DNA拷贝数，式中：N表示质粒的拷贝数，c表示质粒的质量浓度，6.02×10²³为阿伏伽德罗常数，660指1个碱基对的道尔顿数，M为1拷贝DNA分子的碱基数；

将纯化的阳性质粒进行10倍浓度稀释，作为荧光定量PCR的标准品，利用荧光定量PCR测定不同浓度阳性质粒的Ct值，并以循环数Ct为横坐标，以阳性质粒拷贝数的对数为纵坐标绘制标准曲线，如图3和图4所示；

荧光定量PCR扩增体系的总体积为20μL，包括10μL Roch SYBR Green I Master，0.5μM正反向引物对(SEQ ID NO:1～2或SEQ ID NO:3～4)，1μL模板，8μL ddH₂O；荧光定量PCR程序为95℃5min；进入40个循环，95℃15s，60℃35s，60℃处检测荧光信号；PCR循环结束后，在60～95℃区间通过荧光信号检测绘制熔解曲线，检测间隔为0.3℃。

实施例5大曲中根霉和毛霉的定量分析

将大曲原料经酒精表面消毒，无菌水清洗5遍，121℃高温灭菌20min后，分别接入根霉和毛霉，放置培养箱中培养72h，每12h进行一次取样；

提取不同发酵时期的大曲样品DNA，利用根霉引物Primer R(SEQ ID NO:1～2)和毛霉引物Primer M(SEQ ID NO:3～4)进行荧光定量PCR，根据根霉标准曲线(y＝-0.3374x+14.785)和毛霉标准曲线(y＝-0.3229x+13.746)，计算不同发酵时期大曲中根霉生物量和毛霉生物量的变化趋势，结果如表4和表5所示。

表4荧光定量PCR和涂布平板法定量检测大曲中的根霉生物量

表5荧光定量PCR和涂布平板法定量检测大曲中的毛霉生物量

综上所述，本发明采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液预处理大曲样品，淀粉酶和二氧化硅珠子协同配合，实现了短时间内高效溶解大曲中的淀粉的技术效果，显著提高了大曲中总DNA的提取效率；基于SYBR Green荧光定量PCR技术，利用根霉和毛霉的特异性引物对进行PCR扩增，实现了实时监测不同发酵时期大曲中根霉生物量和毛霉生物量的变化趋势的效果，为大曲中霉菌菌群动态变化和白酒风味物质形成机理提供了技术支持。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏今世缘酒业股份有限公司

<120> 一种大曲霉菌生物量的定量检测方法

<130> 20200327

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggtgatggac aagctcggtt 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gcacgatggc taggtagttc gta 23

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<212> DNA

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ttgataaacc tttggatttg c 21

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 4

gcacactggt aaaaaattag 20

Claims (10)

1.一种大曲样品的处理方法，其特征在于，所述处理方法包括采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液溶解和/或洗涤大曲样品。

2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述二氧化硅珠子的粒径为1～5mm；

优选地，所述二氧化硅珠子与所述淀粉酶溶液的质量比为1:(1～10)；

优选地，所述淀粉酶在所述淀粉酶溶液中的浓度为5～15U/mL；

优选地，所述淀粉酶溶液的溶剂为PBS缓冲液。

3.根据权利要求1或2所述的处理方法，其特征在于，所述大曲样品和所述淀粉酶溶液的质量体积比为1:(1～10)mg/mL；

优选地，所述溶解在旋涡振荡条件下进行；

优选地，所述旋涡振荡的时间为2～10min。

4.根据权利要求3所述的处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

向大曲样品中加入含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液，所述大曲样品和所述淀粉酶溶液的质量体积比为1:(1～10)mg/mL，旋涡振荡2～10min，分离上清和沉淀；

将沉淀采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液洗涤，离心收集上清；

所述二氧化硅珠子的粒径为1～5mm；

所述二氧化硅珠子与所述淀粉酶溶液的质量比为1:(1～10)；

所述淀粉酶在所述淀粉酶溶液中的浓度为5～15U/mL。

5.一种大曲霉菌生物量的定量检测方法，其特征在于，所述定量检测方法包括采用权利要求1-4任一项所述的处理方法处理大曲样品后，从上清中收集微生物沉淀并提取微生物DNA，进行荧光定量PCR检测，根据标准曲线计算霉菌生物量。

6.根据权利要求5所述的定量检测方法，其特征在于，所述霉菌包括根霉和/或毛霉；

优选地，所述荧光定量PCR的引物包括如SEQ ID NO:1～4所示的核酸序列。

7.根据权利要求5或6所述的定量检测方法，其特征在于，所述标准曲线的建立方法包括：

构建含有根霉基因或毛霉基因的阳性质粒；

将已知浓度的阳性质粒进行梯度稀释，进行荧光定量PCR，以阈值循环数Ct值为横坐标，以阳性质粒拷贝数的对数为纵坐标，建立标准曲线。

8.根据权利要求7所述的定量检测方法，其特征在于，所述阳性质粒的构建方法为将根霉基因或毛霉基因插入T载体中，转化感受态细胞，筛选阳性克隆后扩大培养，提取质粒得到所述含有根霉基因或毛霉基因的阳性质粒。

9.根据权利要求5-8任一项所述的定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)向大曲样品中加入含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液，所述大曲样品和所述淀粉酶溶液的质量体积比为1:(1～10)mg/mL，旋涡振荡2～10min，分离上清和沉淀；将沉淀采用含有二氧化硅珠子的淀粉酶溶液洗涤，离心收集上清；

所述二氧化硅珠子的粒径为1～5mm；

所述二氧化硅珠子与所述淀粉酶溶液的质量比为1:(1～10)；

所述淀粉酶在所述淀粉酶溶液中的浓度为5～15U/mL；

(2)将上清在5000～10000g下离心1～10min，收集微生物沉淀，并提取微生物DNA；

(3)采用如SEQ ID NO:1～4所示的核酸序列扩增根霉基因或毛霉基因；

(4)根据标准曲线计算霉菌生物量。

10.一种权利要求1-4任一项所述的处理方法和/或权利要求5-9任一项所述的定量检测方法在制备大曲中的应用。

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