CN114540466B - 基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法及试剂盒 - Google Patents

基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA‑21检测方法，包括以下步骤：合成正向切口引物、反向切口引物以及对应的向导RNA；对所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增；将等温扩增后的产物以及所述向导RNA，采用CRISPRCas12a系统进行检测，获得miRNA‑21检测结果。本发明属于生物检测技术领域，可在短时间内实现对miRNA‑21的高灵敏、高特异性检测。

Description

基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
微小RNA(miRNA)是一种内源性、非编码的RNA分子，其作为基因转录后重要的调节因子，在细胞分化、增殖、死亡及器官发育、代谢等多种生物学过程中发挥着重要作用。最近的研究表明，外周血环境中的循环miRNA可存在于微囊(外泌体和脱落囊泡)和凋亡小体中或与高浓度脂蛋白偶联，具有较高的稳定性，与蛋白质标志物、循环细胞和循环DNA相比，miRNA是液体活检领域最具应用潜力的生物标志物之一。
尽管miRNA作为生物标志物具有极大的应用前景，但miRNA检测在临床应用的广泛普及仍面临一些挑战。miRNA序列较短，一般为19-23个碱基，难以通过传统PCR技术进行检测；且miRNA表现出高度的同源性，特别是属于同一家族的成员，如Let-7家族中的Let-7a和Let-7e，二者除了第9个核苷酸有差异外，其余序列均是完全相同的。因此，需要高特异性的检测方法以对同一家族中序列相似的miRNA进行有效识别；miRNA的丰度仅占RNA总丰度的0.01％，在血液环境中的miRNA浓度在亚皮摩尔(pM)范围内，且需要从高度复杂的生物环境中进行提取。此外，不同的miRNA表达丰度差异较大。因此，miRNA检测方法除了具有足够的灵敏度外，还需要兼具至少四个数量级的动态范围。miRNA检测技术根据其检测原理可分为三类：基于杂交原理的检测技术，包括Northern印迹分析、微阵列芯片等检测方法；基于扩增原理的检测技术，主要是RT-PCR方法；基于测序的检测技术，包括扩增克隆测序法、新一代大规模测序技术。
Northern印迹杂交技术是最早应用于miRNA检测的技术，且仍是miRNA表达谱分析的金标准。该项技术可对靶标miRNA的表达特性及分子大小进行确定，并对所预测的miRNA进行验证。然而，由于成熟的miRNA分子较短，在总RNA中的表达丰度较低，导致Northern印迹分析的灵敏度较低，且这种方法耗时耗力，无法应用于实际临床中大量miRNA样本的检测。微阵列技术主要基于分子靶标与其对应的互补探针间的核酸杂交，以对大量miRNAs进行筛选，实现miRNAs的高通量检测。但该技术在miRNA检测中也面临以下挑战：长度较短的miRNAs几乎没有空间对所有miRNAs的杂交条件进行微调，且不同miRNAs的表达丰度相差较大，这显著降低了微阵列的灵敏度和特异性；微阵列技术缺乏提供定量数据的能力，信号的强度不能代表样本中miRNAs的表达水平；此外，微阵列芯片的加工制造成本昂贵，限制了其在临床中的广泛推广。实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)具有较高的灵敏度、准确性和实用性，是基因定量检测的金标准。由于miRNA的长度只有20个碱基左右，无法采用常规qRT-PCR技术对其进行检测，目前多采用特殊的茎环引物法或加尾法对模板链进行延长，以实现对miRNA的定量分析。但以上方法仍面临一些短板：如茎环引物的设计较为复杂，不同序列的引物设计会导致较大的检测性能差异，且引物通用性差，大量检测时成本较高；加尾法虽然引物设计简单，但其检测的特异性及灵敏度显著低于茎环法。以上问题均限制了基于qRT-PCR的miRNA检测方法在临床转化中的进一步应用。而测序技术凭借通量高、准确性高等特点对miRNA的检测性能显著提升，但该方法耗时长、成本高、且需要复杂的数据分析。
发明内容
本发明是提供一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法，可在短时间内实现对miRNA-21的高灵敏、高特异性检测。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法，包括以下步骤：合成正向切口引物、反向切口引物以及对应的向导RNA；对所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增；将等温扩增后的产物以及所述向导RNA，采用CRISPRCas12a系统进行检测，获得miRNA-21检测结果；所述等温扩增的温度为48℃-65℃，时间为10min-50min。
进一步地，所述等温扩增具体包括以下步骤：配制等温扩增的反应液；在配置好的反应液中加入miRNA-21靶标后，置于恒温金属浴、水浴或PCR核酸扩增仪上进行扩增；所述反应液包括正向切口引物、反向切口引物、Bst DNA聚合酶、切口酶以及dNTP混合液。
进一步地，所述等温扩增的温度为61.1℃-65℃，时间为20min-50min。本方法主要基于Bst聚合酶和切口酶介导的双重链置换扩增反应，其中温度是维持该多酶系统稳定及引物高效发挥作用的关键，过低的温度会影响Bst聚合酶及切口酶的活性，而较高的温度会破坏引物识别区与miRNA靶标的结合及固定区介导的SDA效率。为进一步降低非特异的扩增信号，节约时间成本，本发明对双重链置换扩增的反应时间进行了优化。随着时间的延长，相对荧光强度及Cas12a的切割速率会有上升，但随着时间的进一步延长，增长趋势放缓。
进一步地，所述采用CRISPRCas12a系统进行检测，具体包括以下步骤：将向导RNA、Cas12a核酸酶、非特异性荧光报告分子混合后，加入等温扩增的产物混合液孵育；孵育完成后在荧光定量PCR仪或荧光分光光度计上进行荧光分析。
进一步地，所述正向切口引物和反向切口引物从5’至3’端至少包括链置换固定区、切口酶识别区及靶标识别区；所述链置换固定区的Tm值为50℃～55℃。若固定区的Tm值过低，则会导致引物从互补链上脱离，扩增效率显著下降；而Tm值过高，则会导致引物二级结构或非特异结合位点的增多，导致扩增效率降低或非特异扩增信号增强。
本发明还涉及一种试剂盒，包括权正向切口引物、反向切口引物、导向RNA，以及非特异性荧光报告分子、DNA/RNA聚合酶、切口酶、Cas12a核酸酶、dNTP、阴性对照、反应缓冲液；所述正向切口引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向切口引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述反应缓冲液为25～75mM醋酸钾、5～20mM醋酸镁、50～150μg/ml牛血清白蛋白和10～30mM Tris-乙酸的混合溶液；所述反应缓冲液的Ph 7.5～8.5。
进一步地，所述非特异性荧光报告分子两端分别修饰有猝灭基团及荧光基团。
进一步地，所述淬灭基团的种类为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的一种。
进一步地，所述荧光基团为Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Rhodamine Red-X、TAMRA、Texas Red-X、ROX中的一种。
本发明通过对引物进行合理的设计，并采用合适的条件对靶标进行指数级放大，最终生成的双链DNA产物可激活对应的CRISPR基因编辑检测体系，实现对miRNA的荧光检测，从而解决了现有miRNA检测技术中检测下限低、特异性差、成本较高和操作流程复杂，耗时的问题。本发明的试剂盒在大大提高检测灵敏度的同时，提升检测的特异性，并且能够简化检测流程，有望适用于多个场景的miRNA快速、高效检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中引物的结构示意图；
图2为本发明的原理示意图；
图3为本发明实施例1中不同扩增条件下的荧光强度；
图4为采用本发明实施例中测定不同浓度miRNA-21介导下的荧光变化速率；
图5为采用本发明实施例中测定不同miRNA靶标介导下的荧光变化速率。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的实质，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述。
本发提供的miRNA-21检测方法，可实现对miRNA-21的高灵敏、高特异性检测，为miRNA-21在细胞分化、增殖、死亡及器官发育、代谢等生物学过程中的研究提供检测基础
实施例1
一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法，具体包括以下步骤：
步骤一、根据待测miRNA-21靶标的序列合成一对特异性的切口引物，根据CRISPR基因编辑对应的向导RNA序列。
针对miRNA靶标设计相应的正向及反向切口引物，引物设计至少需要包含三部分区域，即从5’至3’端分别为链置换固定区、切口酶识别区及靶标识别区，如图1所示。引物固定区与互补链的稳定结合是双重链置换高效进行的基础，也是提高检测灵敏度的关键，若固定区的Tm值过低，则会导致引物从互补链上脱离，扩增效率显著下降；而Tm值过高，则会导致引物二级结构或非特异结合位点的增多，导致扩增效率降低或非特异扩增信号增强。本发明以固定区Tm值为50℃～55℃进行引物设计。
本发明中特异性切口引物、向导RNA、单碱基突变靶标、非特异性荧光报告分子以及miRNAs的具体序列如表1所示：
表1
步骤二、将切口引物与等温扩增所需物料混合，形成双重链置换等温扩增体系。
1、配制双重链置换扩增的反应液所需材料，如表2：
表2
试剂名称 终浓度
10×反应缓冲液 1×
正向引物 50nM
反向引物 50nM
dNTP混合液(10mM) 200μM
Bst DNA聚合酶 80Unit/mL
切口酶 100Unit/mL
去离子水 加至总体积为20μL
总体积 20μL
2、双重链置换扩增的反应程序：
在上述反应液中加入miRNA-21靶标，利用双重链置换扩增技术在恒温金属浴、水浴或PCR核酸扩增仪上进行扩增。扩增的温度为48℃-65℃，时间为10min-50min。
如图2所示，其中反向引物可通过靶标识别区与靶标结合，在聚合酶及切口酶介导的链置换扩增作用下，产生大量DNA单链产物I；正向引物则可通过靶标识别区与单链扩增产物I结合，同样在聚合酶及切口酶介导链置换扩增作用下，生成与靶标序列一致的DNA单链产物II，该产物可继续与反向引物结合，以实现双重链置换扩增反应的不断循环及等温条件下靶标的指数级放大。最终生成的双链DNA产物可激活对应的CRISPR基因编辑检测体系，实现对miRNA的荧光检测。
步骤三、将向导RNA序列与Cas酶及所需物料混合孵育，形成CRISPR基因编辑核酸检测体系。
配制CRISPR基因编辑核酸检测体系所需的材料如表3:
表3
试剂名称 终浓度
10×反应缓冲液 1×
Cas12a核酸酶 20nM
向导RNA 30nM
荧光报告分子(20μM) 2μM
DTT(100mM) 12.5μM
去离子水 加至总体积为20μL
总体积 20μL
步骤四、将等温扩增产物、阴性对照样本分别与CRISPR基因编辑核酸检测体系混合，混合液孵育后在荧光定量PCR仪或荧光分光光度计上进行荧光分析。
1、本发明特异的扩增效率进行评价。
取2μL新鲜配制的CRISPR基因编辑核酸检测工作液，加入至等温扩增产物中进行孵育。阴性对照样本为灭菌的去RNA酶水(DEPC-H2O)利用荧光定量PCR仪或荧光分光光度计，对其荧光信号进行记录。
荧光定量PCR仪或荧光分光光度计中以固定时间5sec-60sec为一个循环采集一次荧光信号，通过分析miRNA扩增样本及阴性对照样本(同体积的DEPC-H2O代替miRNA)的相对荧光强度(RFU＝miRNA扩增样本荧光值-阴性对照样本荧光值)，计算线性增长期的荧光变化速率(Rate＝RFU/循环数)，以对特异的扩增效率进行评价。
具体为：使用QIAGEN公司的Rotor-Gene Q仪器，检测程序：37℃×30sec，40循环。每个循环结束时对HEX荧光通道进行信号采集。计算每个循环下miRNA-21扩增样本及阴性对照样本(同体积的DEPC-H2O代替miRNA)的相对荧光强度(RFU＝miRNA-21荧光值-阴性对照样本荧光值)，并以此重新绘制荧光变化曲线，计算线性增长期的荧光变化速率(Rate＝RFU/循环数)，以对特异的扩增效率进行评价。
结果如图3所示，在扩增的温度为48℃～65℃，扩增时间为10min～50min的条件下，其扩增产物均可有效激活对应的CRISPR基因编辑检测体系。其中，最优温度范围为61.1℃～65℃，反应时间为20～50min。
2、本发明线性检测范围及最低检测限分析：
将确定浓度的miRNA-21稀释至10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、100aM，并分别加入到上述新鲜配制的双重链置换扩增反应体系中，至总体积为20μL，65℃条件下孵育20分钟。95℃灭活后，加入2μL新鲜配制的CRISPR基因编辑核酸检测工作液，利用荧光定量PCR仪对其荧光信号进行记录，通过计算不同浓度miRNA-21介导下的荧光变化速率，以评价该方法的线性检测范围。在1fM至10pM的浓度范围内，miRNA-21浓度与荧光变化速率呈良好的线性关系如图4所示，由线性方程计算可得最低检测限(LOD)约为450aM(3σ)。
将本发明的方法与现有技术中基于等温扩增的miRNA检测方法进行比较，结果如表4所示：本发明的miRNA检测方法，在检测灵敏度方面优于多数荧光检测方法，可与比色法、化学发光法及电化学等可借助纳米材料实现信号放大的平台相媲美；且在扩增时间上具有明显的优势。
表4
3、本发明检测特异性评价。
将不同种类的miRNAs(miRNA-21、miRNA-122、miRNA-141、miRNA-200a、miRNA-15a、Let-7a、miRNA-21M1及miRNA-21M2)加入到上述扩增体系中(终浓度为1pM)，至总体积为20μL，65℃条件下孵育20分钟。95℃灭活后，加入2μL新鲜配制的CRISPR基因编辑核酸检测工作液，利用荧光定量PCR仪，对其荧光信号进行记录，计算不同miRNA靶标介导下的荧光变化速率，以评价该方法的检测特异性。
如图5所示，只有加入miRNA-21的反应产物可显著激活CRISPR基因编辑核酸检测系统，且荧光变化速率约为干扰miRNA(miRNA-122、miRNA-141、miRNA-200a、miRNA-15a、Let-7a)变化速率的18倍；为进一步评价该方法对miRNA单碱基突变的识别能力，我们分别在miRNA-21第21个碱基位点(miRNA-21M1)及第13个碱基位点(miRNA-21M2)引入突变，当靶标发生单碱基突变后，扩增效率显著降低，且该方法对miRNA-21M2的分辨能力明显优于miRNA-21M1，分析其原因为M1中的突变位点位于反向引物识别区的第2个碱基位置，对聚合酶活性的影响较小；而M2中的突变位点位于反向引物3’端末位碱基，对聚合酶介导的DNA扩增具有显著干扰，证明该方法对靶标单碱基突变具有一定的识别能力，且检出效率与突变位置密切相关。
实施例2
一种试剂盒包括：按实施例1的方法合成的引物、导向RNA、非特异性荧光报告分子、DNA/RNA聚合酶、切口酶、Cas12a核酸酶、dNTP、阴性对照DEPC-H2O以及反应缓冲液。所述反应缓冲液为醋酸钾(25-75mM)、醋酸镁(5-20mM)、牛血清白蛋白(50-150μg/ml)、Tris-乙酸(10-30mM)的混合溶液。混合溶液的Ph为7.5-8.5。
其中非特异性荧光报告分子两端分别修饰有猝灭基团及荧光基团。淬灭基团的种类为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一种，荧光基团为Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Rhodamine Red-X、TAMRA、Texas Red-X、ROX中的任意一种。
以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在申请待批的本发明的权利要求范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>
<120>
<130>
<160> 12
<170>
<210> 1
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
(HEX)-TTATT-(BHQ1)
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
TAGCTTATCAGACTGATGTTGAATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400>3
GGGCGGGCGGCATTGCTAGCTTATCA
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
GGGCGGGCGGCATTGCTCAACATCAG
<210> 5
<211> 22
<212>RNA
<213> 人工合成
<400>5
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 6
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUCA
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 7
UAGCUUAUCAGAGUGAUGUUGA
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 8
UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 9
UAACACUGUCUGGUAACGAUGU
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 10
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
<210> 11
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 11
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 12
UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

Claims (10)

1.一种非诊断目的基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
合成正向切口引物、反向切口引物以及对应的向导RNA；
对所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增，所述正向切口引物和反向切口引物从5’至3’端至少包括链置换固定区、切口酶识别区及靶标识别区；
将等温扩增后的产物以及所述向导RNA，采用CRISPRCas12a系统进行检测，获得miRNA-21检测结果；所述等温扩增后的产物为DNA单链产物I与DNA单链产物II形成的双链DNA；
所述等温扩增的温度为48℃-65℃，时间为10 min-50 min；
所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增具体步骤如下：所述反向切口引物通过靶标识别区与靶标结合，在链置换扩增作用下，产生DNA单链产物I；正向切口引物则通过靶标识别区与所述DNA单链扩增产物I结合，同样在链置换扩增作用下，生成与靶标序列一致的DNA单链产物II，所述DNA单链产物II继续与反向切口引物结合，形成双重链置换扩增。
2.根据权利要求1所述非诊断目的基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法，其特征在于，所述等温扩增具体包括以下步骤：
配制等温扩增的反应液；
在配置好的反应液中加入miRNA-21靶标后，置于恒温金属浴、水浴或PCR核酸扩增仪上进行扩增；
所述反应液包括正向切口引物、反向切口引物、Bst DNA聚合酶、切口酶以及dNTP混合液。
3.根据权利要求1所述非诊断目的基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法，其特征在于：所述等温扩增的温度为61.1℃-65℃，时间为20 min-50 min。
4.根据权利要求1所述非诊断目的基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法，其特征在于：所述采用CRISPRCas12a系统进行检测，具体包括以下步骤：
将向导RNA、Cas12a核酸酶、非特异性荧光报告分子混合后，
加入等温扩增的产物混合液孵育；
孵育完成后在荧光定量PCR仪或荧光分光光度计上进行荧光分析。
5.根据权利要求1所述非诊断目的基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法，其特征在于：所述链置换固定区的Tm值为50℃~55℃。
6.一种试剂盒，其特征在于：包括正向切口引物、反向切口引物、导向RNA，以及非特异性荧光报告分子、DNA/RNA聚合酶、切口酶、Cas12a核酸酶、dNTP、阴性对照、反应缓冲液；
所述正向切口引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向切口引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液为25~75 mM醋酸钾、5~20mM醋酸镁、50~150μg/ml牛血清白蛋白和10~30 mM Tris-乙酸的混合溶液；所述反应缓冲液的Ph 7.5~8.5。
8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于：所述非特异性荧光报告分子两端分别修饰有淬灭基团及荧光基团。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述淬灭基团的种类为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的一种。
10.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为Pacific Blue、OregonGreen、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、RhodamineRed-X、TAMRA、Texas Red-X、ROX中的一种。
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