CN113528666B - 一种多类型非编码rna检测方法及其在胃癌预警中的应用 - Google Patents

一种多类型非编码rna检测方法及其在胃癌预警中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多类型非编码RNA检测方法及其在胃癌预警中的应用。有机酸于纤维素分子表面进行酯化‑碳化反应，以构建荧光纤维素纸；通过偶联探针DNA序列赋予纤维素纸生物功能化，构建分析芯片；靶标RNA杂交触发滚环扩增(RCA)，于分析芯片表面形成大量单链DNA；通过DNA杂交，将多色量子点修饰于试制表面标记RCA扩增产物；使用智能手机对荧光试纸进行成像，借助CIE坐标颜色分析方法，实现对RNA的定量分析与癌症预警。本发明提供了一种灵敏度高、特异性好的RNA检测新方法，以及使用简单、准确度高的现场快速癌症预警新技术。

Description

一种多类型非编码RNA检测方法及其在胃癌预警中的应用
技术领域
本发明属于医学领域，具体涉及一种多类型非编码RNA检测方法及其在胃癌预警中的应用。
背景技术
小RNA(miRNA)是一类短序列(19-25个核苷酸)、非编码RNA，在多个关键的生理过程中起到调控作用，诸如细胞分化、细胞凋亡等。越来越多的相关证据表明miRNA的异常表达伴随着多种疾病的发生，如癌症、糖尿症和阿尔兹海默症等。因此，作为疾病标志物，miRNA具有重大的预警学意义，极大促进了miRNA检测技术的发展。其中，实时定量反转PCR和深度测序技术作为金标方法，被广泛用于miRNA检测。但金标方法检测耗时长、操作过程复杂且成本高昂。基于微凝胶、磁性微球、纳米颗粒等的悬浮阵列芯片或者基于二氧化硅、尼龙膜等的平面阵列芯片具有使用简单、成本低且支持多元靶标分析等优点，有望替代传统分子生物学方法在miRNA检测中取得越来越多的应用。
环状RNA(circRNA)也是一种非编码RNA，是一种特殊的内源性RNA分子。其生成阶段位于转录后期，由RNA内含子序列首尾连接闭合成环形成。因其和mRNA的同源性，circRNA具有吸附miRNA的能力，被称为miRNA“海绵”，同样参与到基因表达调控过程中。鉴于circRNA与miRNA在基因表达调控中的拮抗作用，circRNA同样可作为癌症预警的重要标志物，在前列腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌预警中受到越来越多的关注。circRNA的检测同样依赖于反转录PCR，但需将总RNA中的线状RNA降解，此过程中易产生线状RNA残留，导致出现假阳性结果。因此，开发特异性好、操作简单、低成本的circRNA检测技术同样迫在眉睫。
无论miRNA还是circRNA，单一靶标的检测都无法作为某型癌症预警的有力证据。因为基因调控网络是复杂的，一种miRNA或者circRNA的异常表达往往预示着多种癌症的发生，同时，某型癌症的发生也牵扯到多种miRNA或者circRNA的异常表达。因此，利用miRNA和circRNA在基因表达调控中的紧密联系，同时研究二者在某型癌症患者外周血中的含量变化，可极大提升癌症预警的准确率。到目前为止，还未有一种核酸分析手段可以同时检测miRNA和circRNA，相关技术亟待开发。
发明内容
解决的技术问题：针对目前存在的问题，本发明提供一种纸质荧光分析芯片用于多类型非编码RNA的同时检测，该芯片可以实现可视化、超灵敏地检测miRNA和circRNA，并可实现胃癌的精准预警。
技术方案：为了实现上述目的，本发明一种多类型非编码RNA检测的方法，包括以下步骤：
(1)取纤维素纸，于该纤维素纸表面负载有机酸；
(2)于上述负载有机酸的纤维素纸表面原位合成碳点，得到荧光纤维素纸；
(3)修饰上述荧光纤维素纸，构建纸质分析芯片；
(4)于所述纸质分析芯片上进行DNA扩增与荧光标记；
(5)根据荧光标记反应后的颜色对靶标多类型非编码RNA进行定量检测。
进一步的，所述非编码RNA为小RNA(miRNA)和/或环状RNA(circRNA)。
进一步的，步骤(1)所述纤维素纸为定性或定量滤纸，有机酸浓度不低于20w％，且有机酸为马来酸、顺丁烯二酸、苹果酸与柠檬酸中的一种或者几种，有机酸经酯化反应修饰于纤维素分子表面6号位碳原子上。
进一步的，步骤(2)利用微波碳化法，以水为加热媒介，于纤维素纸表面原位合成碳点，微波碳化的具体条件为，微波功率400-700W，温度150-180℃，时间15min。
进一步的，步骤(3)所述纸质分析芯片构建过程为，将两种分别用于捕获挂锁DNA和靶标circRNA的DNA探针经过5’端氨基修饰后，进一步通过EDC/NHS反应耦联于荧光纤维素纸表面，赋予荧光纤维素纸生物活性，构建蓝色荧光纸质分析芯片，EDC活化媒介为MES缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)，EDC浓度为5mg/mL。
进一步的，步骤(4)所述两种RNA的比率荧光检测具体操作步骤为：
将预先和DNA探针杂交的挂锁DNA与miRNA杂交，形成三明治结构，
添加T4 DNA连接酶，使挂锁DNA两端连接成环，T4 DNA连接酶的浓度为0.1U/μL，孵育温度39℃，时间30min，
添加dNTPs和DNA聚合酶，使探针DNA的3’端以环化的挂锁DNA为模板进行滚环扩增，生成长的单链DNA1，DNA聚合酶浓度为0.1U/μL，四种脱氧核糖核苷酸浓度均为25μmol/L，
将circRNA与DNA探针杂交，并在DNA聚合酶的作用下，以circRNA为模板延伸探针分子，生成长的单链DNA2，
将绿色量子点标记的信号序列1与单链DNA1杂交，进行荧光标记，
红色量子点标记的信号序列2与单链DNA2杂交，进行荧光标记，
荧光标记反应结束后，所述纸质分析芯片的荧光颜色改变，由蓝色分别变为绿色和红色。
进一步的，步骤(5)所述定量检测的具体操作步骤为：通过颜色变化程度与靶标多类型非编码RNA数量呈正相关的特征，对照CIE坐标上miRNA和circRNA与颜色坐标的定量关系，计算样本中两种RNA的数量。
本发明还包括一种预警胃癌的纸质分析芯片的构建方法，通过以真实的血清样本为分析对象，将上述任一方法检测的靶标多类型非编码RNA定量结果作为癌症预警依据。
本发明还包括一种多类型非编码RNA检测方法的应用，将上述任一方法检测的靶标多类型非编码RNA定量结果用于预警胃癌。
有益效果：本发明的纸质分析芯片用于非编码RNA检测和胃癌的精确预警。以纤维素纸为基底，原位合成了蓝色荧光碳点。相比于后组装方式，原位合成荧光团技术克服了组装均一性差、稳定性低等缺陷。纸质芯片可实现多类型非编码RNA的超灵敏检测，检测限分别为：miRNA 5fmol/L；circRNA 2fmol/L；芯片可视化效果好，通过显著的颜色变化，实现了实际血样中miRNA和circRNA的同时检测，想比于单一类型的非编码RNA检测技术，该新型之纸芯片可极大提高疾病预警的准确率。
附图说明
图1A为纸质芯片的构建示意图，
图1B为miRNA检测示意图，
图1C为circRNA检测示意图，
图1D为基于颜色分析法的胃癌预警过程示意图，
图2A为纤维素的透射电子显微镜照片，
图2B为纤维素-蓝色碳点的透射电子显微镜照片，
图2C为碳点荧光光谱图，
图3A为纸质芯片荧光颜色随靶标浓度渐变的照片，
图3B为纸质芯片荧光颜色于CIE坐标上的位移示意图，
图3C为颜色位移距离对靶标浓度的定量曲线图，
图4A为用于miRNA检测的纸质芯片对miRNA与潜在干扰物的荧光响应柱状图，
图4B为用于circRNA检测的纸质芯片对circRNA与潜在干扰物的荧光响应柱状图，
图5A为纸质芯片对正常人和胃癌患者的血浆样本中miRNA检测的荧光响应结果与靶标含量柱状图，
图5B为纸质芯片对正常人和胃癌患者的血浆样本中circRNA检测的荧光响应结果与靶标含量柱状图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明一种多类型非编码RNA检测的方法，具体包括以下操作步骤：
(1)取纤维素纸，于该纤维素纸表面负载有机酸；定量的纤维素纸浸泡于有机酸溶液(浓度不低于20w％)中，在加热条件下，多元有机酸的其中一个羧基与纤维素分子6号位碳原子上的羟基发生酯化反应，从而修饰于纤维素纸表面。
(2)于上述负载有机酸的纤维素纸表面原位合成碳点，得到荧光纤维素纸；利用微波碳化法于纤维素纸表面原位合成碳点，微波碳化的具体条件为，微波功率400-700W，温度150-180℃，时间15min。以水为加热媒介，有机酸修饰的纤维素纸与氮源(乙二胺或尿素)经微波处理，于纤维素纸表面原位合成蓝色荧光碳点，如图1A所示。在最优化条件下，所合成碳点荧光量子产率为43％。
(3)修饰上述荧光纤维素纸，构建纸质分析芯片；将两种分别用于捕获挂锁DNA和靶标circRNA的DNA探针经过5’端氨基修饰后，进一步通过EDC/NHS反应耦联于荧光纤维素纸表面，赋予荧光纤维素纸生物活性，构建蓝色荧光纸质分析芯片。荧光纤维素纸被赋予生物功能化，具有捕获挂锁DNA用以检测miRNA的功能或者捕获并检测circRNA的功能。具体地，蓝色碳点表面的羧基经过EDC活化，活化媒介为MES缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)，EDC浓度为5mg/mL。进一步，所活化羧基与2μmol/L的DNA探针分子5’端所修饰氨基发生共价交联，使DNA探针修饰于碳点表面。最后，将荧光试纸于MES缓冲液中多次洗涤，去除未交联的DNA探针和活化试剂。
(4)于所述纸质分析芯片上进行DNA扩增与荧光标记；具体操作过程如下：
将所修饰探针DNA分子通过碱基互补杂交捕获挂锁DNA，挂锁DNA的3’端与5’端分别与靶标miRNA杂交，形成三明治DNA杂交结构，如图1B所示，在T4 DNA连接酶的作用下，挂锁DNA两端形成3,5-磷酸二酯键，闭合成环。T4 DNA连接酶的浓度为0.1U/μL，孵育温度39℃，时间30min。经冲洗去除DNA连接酶，进一步加入DNA聚合酶(浓度0.1U/μL)和四种脱氧核糖核苷酸(浓度均为25μmol/L),探针DNA分子在DNA聚合酶的作用下以环化的挂锁DNA为模板延伸生成长的单链DNA序列。利用信号DNA1与扩增产物之间的碱基互补配对，多个绿色荧光量子点被组装于之纸芯片表面，实现荧光颜色由蓝色至绿色的变化，其变化幅度与靶标浓度呈正相关关系。基于相同的原理和相似的操作过程，如图1C所示，纸质芯片被用于circRNA检测。相比miRNA的检测过程，circRNA因将靶标作为探针DNA扩增模板，因此无需加入DNA连接酶，检测过程得以简化。扩增产物的荧光标记使用红色量子点，因此circRNA的检测信号为红色荧光信号，如图1D所示。以miRNA和circRNA的浓度为横坐标，芯片荧光颜色于CIE坐标上的移动距离为纵坐标绘制标准曲线，获取RNA定量检测标准曲线。
(5)根据荧光标记反应后的颜色对靶标多类型非编码RNA进行定量检测。纸质芯片被用于分析胃癌患者外周血中的miRNA和circRNA，并将分析结果与正常人血样的分析结果做对照，实现胃癌的精确预警。待分析血样经过抗凝集、离心、试剂盒提取步骤，获取样本中的总RNA。将总RNA溶液加入以96孔板为反应容器的之纸芯片阵列中，经如步骤(4)所述的扩增、标记步骤，获取纸质芯片阵列的荧光颜色，并将其转化为CIE颜色坐标，带入标准曲线，计算血样中miRNA和circRNA浓度。最后，根据生理和病理条件下miRNA和circRNA的表达关系，实现胃癌的精确预警。
实施例
(1)本发明所述的纸质芯片通过连续的酯化-碳化法原位合成蓝色碳点制备。配制浓度为50w％的柠檬酸溶液，将纤维素纸完全浸入溶液中，静置2小时。通过水浴加热，将柠檬酸溶液温度提升至80℃，继续静置2小时。是用蒸馏水冲洗纤维素纸，去除未共价组装的柠檬酸，直至冲洗液pH达到7.0。进一步，柠檬酸修饰的纤维素纸被置于20mL纯水中，并加入2.5mL乙二胺。
(2)通过微波处理，使纤维素纸表面柠檬酸脱水碳化形成碳点，并因乙二胺的掺杂，提升碳点的荧光量子产率。优化的微波碳化条件为：功率600W；温度160℃；时间15min。此条件下，碳点荧光量子产率为53％，均匀修饰于纤维素纤维表面，图2A为纤维素的透射电子显微镜照片，图2B为纤维素-蓝色碳点的透射电子显微镜照片，图2C为碳点荧光光谱。
(3)探针DNA、挂锁DNA、靶标RNA、和信号DNA序列设计，本实施例中，针对两种类型的非编码RNA检测，设计了两种探针DNA序列(pDNA1和pDNA2)，一种挂锁DNA(padlock DNA)，两种靶标RNA序列(miRNA-21和circRNA-HIAT1)，以及两种信号DNA(sDNA1和sDNA2)。如表1所示，pDNA1的5’端氨基使其可被修饰于荧光纤维素纸表面；其3’端可与挂锁DNA杂交(加粗显示)。pDNA2的5’端同样经过氨基修饰，3’端与circRNA的闭合剪接位点杂交。miRNA的序列与挂锁DNA两端完全互补(下划线)，从而具有与挂锁DNA杂交的能力。sDNA1和sDNA2的序列因分别与挂锁DNA及circRNA的反义序列互补(斜体显示)，因此具有与滚环扩增产物杂交的能力，其5’端所修饰氨基用于与绿色或红色量子点表面羧基交联。
表1探针DNA、挂锁DNA、靶标RNA和信号DNA序列
注：*表示circRNA-HIAT1的闭合剪接位点。
(4)标准样品中miRNA-21和circRNA-HIAT1的检测，所使用标准样品为含有不同浓度的miRNA-21和circRNA-HIAT1的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 7.5，含20mM MgCl2)。荧光纤维素纸被裁剪成直径6mm的圆形纸片并放置于96孔板底部。通过在两行荧光纤维素纸表面分别耦联pDNA1和pDNA2构建试纸芯片阵列，用于检测miRNA-21和circRNA-HIAT1。经多次洗涤去除未耦联的pDNA1或pDNA2后，每孔加入20μL的Tris-HCl冲液。将10μL含有miRNA-21或circRNA-HIAT1的标准样品分别加入到孔板中，RNA浓度为0-2nM，其中，miRNA-21的样品中均含有2nM的padlock DNA。室温静置30min后，洗涤去除未杂交的padlock DNA或RNA分子。进一步，在T4 DNA连接酶的作用下，padlock DNA闭合成环。在DNA聚合酶的催化作用下，pDNA1和pDNA2序列延长。最后，分别往孔板中加入20μL绿色或红色量子点标记的sDNA1或sDNA2，浓度均为1μM。经洗涤，去除未杂交的sDNA1或sDNA2，在暗室中，以波长为365nm的紫外灯为激发光源，采集纸质芯片阵列的荧光照片(图3A)，并通过软件分析，获取各孔中芯片荧光颜色坐标，将其绘制于CIE坐标中(图3B)，并依据颜色位移量与靶标浓度的关系，绘制标准曲线(图3C)，获取回归方程。通过计算，该纸质芯片对miRNA-21和circRNA-HIAT1的检测限分别为5fmol/L和2fmol/L，线性检测范围均为4个数量级。
(5)纸质芯片用于RNA检测的特异性，如图4A所示，所使用待分析物浓度均为1nM。纸质芯片对miRNA-21具有最显著的荧光颜色响应，芯片呈现明亮的绿色。而随着分析物与靶标之间序列的差异逐渐增大，从单碱基不匹配(1BM)，三碱基不匹配(3BM)，到完全不匹配的其他miRNA分子(miRNA-141)，芯片从蓝色到绿色转变的程度逐渐降低。经计算，试纸颜色于CIE坐标中的移动距离分别为：miRNA-21，0.348；1BM，0.119；3BM，0.057；miRNA-141，0.007。当试纸用于circRNA-HIAT1检测，同样表现出良好的特异性，如图4B所示，试纸仅对靶标具有最明显的颜色响应，色坐标移动距离为0.423。而对于其他潜在干扰物，其荧光颜色位移幅度均不超过0.158。因此，本发明中的纸质芯片表现出优良的靶标特异性，适用于真实样品中的RNA检测。
纸质芯片用于实际样品中的RNA含量分析与胃癌预警
本实施例中，待分析样本分别来自于五位正常人和五位胃癌患者。血浆中总RNA的提取使用GenElute血浆RNA纯化试剂盒(购买自Sigma-Aldrich)，根据试剂盒使用说明书所描述的操作过程，提取正常人和胃癌患者血浆中总RNA，溶解于含有RNA酶抑制剂(1U/μL)的纯水中。蓝色碳点负载的纤维素纸的制备方法同实施例1中所述，血浆中miRNA-21和circRNA-HIAT1的检测过程同实施例3所述。如图5A所示，相比于正常人，胃癌患者的血浆样本可导致检测miRMA-21的纸质芯片呈现更明显的颜色响应，如图5B所示，而正常人的血液样本则引起检测circRNA-HIAT1的纸质芯片更剧烈的颜色变化。证明与正常人相比，胃癌患者体内miRNA-21的表达量是上调的，而circRNA-HIAT1的表达量则是下调的。根据相对颜色变化与靶标浓度之间的定量关系(实施例3中所得)，计算得到正常人血浆中miRNA-21和circRNA-HIAT1的平均浓度分别为0.36amol/μL和0.13amol/μL，癌症患者血浆中miRNA-21和circRNA-HIAT1的平均浓度分别为0.55amol/μL和0.08amol/μL。
结论：上述实施例证明了本发明纸质芯片可成功用于胃癌的高精度预警。

Claims (5)

1.一种非疾病诊断目的的多类型非编码RNA检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 取纤维素纸，于该纤维素纸表面负载有机酸；
(2)于上述负载有机酸的纤维素纸表面原位合成碳点，得到荧光纤维素纸；
(3)修饰上述荧光纤维素纸，构建纸质分析芯片，所述纸质分析芯片构建过程为，将两种分别用于捕获挂锁DNA和靶标circRNA的DNA探针经过5’端氨基修饰后，进一步通过EDC/NHS反应耦联于荧光纤维素纸表面，赋予荧光纤维素纸生物活性，构建蓝色荧光纸质分析芯片，EDC活化媒介为MES缓冲液，MES缓冲液浓度100mmol/L，pH 6.0，EDC浓度为5mg/mL；
(4) 于所述纸质分析芯片上进行DNA扩增与荧光标记；所述两种RNA的比率荧光检测具体操作步骤为：
将预先和DNA探针杂交的挂锁DNA与miRNA杂交，形成三明治结构，
添加T4 DNA连接酶，使挂锁DNA两端连接成环，T4 DNA连接酶的浓度为0.1U/μL，孵育温度39℃，时间30min，
添加dNTPs和DNA聚合酶，使探针DNA的3’端以环化的挂锁DNA为模板进行滚环扩增，生成长的单链DNA1，DNA聚合酶浓度为0.1U/μL，四种脱氧核糖核苷酸浓度均为25μmol/L，
将circRNA与DNA探针杂交，并在DNA聚合酶的作用下，以circRNA为模板延伸探针分子，生成长的单链DNA2，
将绿色量子点标记的信号序列1与单链DNA1杂交，进行荧光标记，
红色量子点标记的信号序列2与单链DNA2杂交，进行荧光标记，
荧光标记反应结束后，所述纸质分析芯片的荧光颜色改变，由蓝色分别变为绿色和红色；
(5) 根据荧光标记反应后的颜色对靶标多类型非编码RNA进行定量检测。
2. 根据权利要求1所述的多类型非编码RNA检测的方法，其特征在于，所述非编码RNA为小RNA (miRNA)和／或环状RNA (circRNA)。
3.根据权利要求1所述的多类型非编码RNA检测的方法，其特征在于，步骤(1)所述纤维素纸为定性或定量滤纸，有机酸浓度不低于20w%，且有机酸为马来酸、顺丁烯二酸、苹果酸与柠檬酸中的一种或者几种，有机酸经酯化反应修饰于纤维素分子表面6号位碳原子上。
4. 根据权利要求1所述的多类型非编码RNA检测的方法，其特征在于，步骤(2) 利用微波碳化法，以水为加热媒介，于纤维素纸表面原位合成碳点，微波碳化的具体条件为，微波功率400-700W，温度150-180 ℃，时间15min。
5.根据权利要求1所述的多类型非编码RNA检测的方法，其特征在于，步骤(５)所述定量检测的具体操作步骤为：通过颜色变化程度与靶标多类型非编码RNA数量呈正相关的特征，对照CIE坐标上miRNA和circRNA与颜色坐标的定量关系，计算样本中两种RNA的数量。
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CN109477133A (zh) * 2016-06-09 2019-03-15 加利福尼亚大学董事会 用于纸基免疫测定的生物标志物浓缩和信号放大以及用于提取、浓缩和扩增dna的单一平台
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A Review of Carbon Dots Produced from Biomass Wastes;Chao Kang 等;Nanomaterials;第10卷(第11期);2316 *

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