CN110501320A - 一种比率型荧光分子印迹纸芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种比率型荧光分子印迹纸芯片及其制备方法和应用，属于材料科学与工程和微流控芯片技术领域，包括以下步骤：将CDs和APTES‑NBD偶联物荧光材料依次修饰在纤维素纸表面，利用表面印迹技术在纤维素纸表面形成苯醚甲环唑印迹孔穴，制得荧光分子印迹纸，将荧光分子印迹纸固定在具有三维结构的微流控基底上，即得到比率型荧光分子印迹纸芯片；本发明实现对于农药苯醚甲环唑的快速检测，发展了一种具有低毒、便携、高效、经济等特性的微流控快速检测纸芯片。

Description

一种比率型荧光分子印迹纸芯片及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于材料科学工程和微流控芯片技术领域，具体涉及一种比率型荧光分子印迹纸芯片及其制备方法和应用。
背景技术
碳量子点(CDs)是一种碳基零维材料，由极少分子或原子组成的纳米团簇，近似球型且直径＜10nm，碳量子点的结构和组成决定了它们性质的多样性，碳量子点在紫外光区有较强的吸收峰，并且在可见光区域有长拖尾，大多数吸收峰带集中在260～320nm，通常表现出荧光最大发射波长、激发波长依赖性等光学特征；具有良好水溶性的碳量子点在光照下，其自身会发出明亮的荧光，且光学稳定性很好，这也成为碳量子点应用最广泛的性质。作为新型的绿色纳米材料，碳量子点具有良好的荧光特性和量子效应，相比传统的半导体量子点，具有毒性低，绿色环保等优点，且具有上转换荧光特性、激发波长和发射波长的可调控性、较高的稳定性与抗光漂白性等优良性质。虽然碳量子点具有较好的荧光特性，但是单纯就碳量子点本身而言，作为荧光探针，其最大的缺点就是选择性较差。另外，现有技术中荧光探针一般只根据一种荧光信号变化进行检测，容易导致测量值和真实值之间存在误差的问题。
发明内容
本发明提供了一种比率型荧光分子印迹纸芯片及其制备方法和应用，解决了上述技术问题。
本发明的第一个目的是提供一种比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将CDs和APTES-NBD(3-氨丙基三乙氧基硅烷/硝基苯并-2-氧杂-1,3二唑)偶联物荧光材料依次修饰在纤维素纸表面，之后利用表面印迹技术在纤维素纸表面形成苯醚甲环唑印迹孔穴，制得荧光分子印迹纸，将荧光分子印迹纸固定在具有三维结构的微流控基底上，即得到比率型荧光分子印迹纸芯片。
优选地，所述的比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，具体包括以下步骤：
S1：采用一步水热法制备CDs，并将CDs进行氨基酸修饰，将修饰后的CDs通过酰胺键接枝于氨基化纤维素纸表面，合成镶嵌有CDs的纤维素荧光纸；
S2：将APTES-NBD偶联物修饰于S1制得的镶嵌有CDs的纤维素荧光纸上，制得纤维素荧光纸；在纤维素荧光纸上合成具有苯醚甲环唑的印迹层，完全除去模板苯醚甲环唑后形成苯醚甲环唑印迹孔穴，得到荧光分子印迹纸；
S3：将S2荧光分子印迹纸固定在具有三维结构的微流控基底上，形成比率型荧光分子印迹纸芯片。
优选地，所述S1镶嵌有CDs的纤维素荧光纸具体是通过以下步骤制得：
S11：将叶酸粉末加至水中，搅拌均匀，170-190℃下反应2-3h，自然冷却制得CDs粗品；将合成的CDs粗品经滤膜过滤和过柱纯化，制得纯品CDs溶液；所述叶酸：水用量为0.0025～0.00375g：1mL；
S12：将L-半胱氨酸加入S11合成的纯品CDs溶液中，避光条件下，36-38℃恒温反应35-45min，制得氨基酸修饰CDs溶液；所述L-半胱氨酸：纯品CDs溶液用量比为0.3564～0.7128g：1L；
S13：将纤维素纸浸入质量分数为0.2％的盐酸酸化，并置于质量分数为50％的乙醇和APTES构成的混合液中，振荡2-3h，洗净，制得氨基化纤维素纸；乙醇和APTES用量比为1mL：10μL；
S14：将EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)质量浓度为20mg/mL的EDC/MES溶液加至S12制得的氨基酸修饰CDs溶液中，混合均匀，制得混合溶液；将S13制得的氨基化纤维素纸浸入混合溶液中，并加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)质量浓度为20mg/mL的NHS/MES溶液，静置0.5-1.5h后，避光振荡12-14h，制得镶嵌有CDs的纤维素荧光纸；氨基酸修饰CDs溶液：EDC/MES溶液：NHS/MES溶液体积比为1.3-1.5:1:1。
优选地，所述S2中荧光印迹纸具体是通过以下步骤制得：
S21：将NBD加入质量分数为50％的乙醇，并加入APTES，搅拌条件下反应9-11h，制得APTES-NBD偶联物；NBD：乙醇用量比为1g：10L,乙醇：APTES用量比为1mL：3.68-4.5μL；
S22：将S1制得的镶嵌有CDs的纤维素荧光纸浸入质量分数为50％的乙醇和TEOS(正硅酸乙酯)构成的混合物中，避光振荡3-5h，加入S21制得的APTES-NBD偶联物和苯醚甲环唑，避光振荡25-35min后，加入氨水和第二批TEOS，避光振荡4-6h，洗脱、清洗后，制得荧光印迹纸；
混合物中乙醇：TEOS用量比为1mL：2.4-2.67μL，乙醇：APTES-NBD偶联物体积比为：18.78-20.83:1，苯醚甲环唑和APTES-NBD偶联物用量比为7.88-11.79g：1L，乙醇和氨水用量比为1mL：4.4-6μL；氨水和第二批TEOS体积比为2:1。
优选地，所述S3中具有三维结构的微流控基底为纤维素纸折叠得到的三层微流控纸芯片。
本发明的第二个目的是提供一种由上述制备方法制得的比率型荧光分子印迹纸芯片。
本发明的第三个目的是提供上述比率型荧光分子印迹纸芯片在农药苯醚甲环唑检测方面的应用。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果:
(1)本发明结合量子点技术、表面分子印迹技术和纸芯片技术，制备了比率型荧光分子印迹纸芯片，经过上述方法提高了CDs的选择性，可用于苯醚甲环唑的高效识别与快速检测；另外，不同于其它纸芯片产品，该产品接枝有两种不同颜色的荧光材料，分别为蓝色CDs和绿色APTES-NBD偶联物，通过在一种波长的激发下，同时测定两个发射峰的荧光强度，根据两个荧光信号的比值来检测目标分子，解决只根据一种荧光信号变化进行检测时易出现测量值和真实值之间存在误差的问题，实现内在的自我校正，从而降低甚至消除一些难以控制的其他因素的影响，从而得到更精确的结果；
(2)纸芯片上接枝的两种荧光材料中，其中一种为碳量子点，经过试验证明碳量子点不同于CdSe及CdTe等量子点，CDs对细胞几乎没有毒性，本发明发展了一种低毒性、环境友好型的纸芯片；
(3)除此之外，微流控纸芯片具有便携、高效和经济等特性，实现对苯醚甲环唑的快速检测，极大地符合了当前食品安全领域快速检测的需要。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的比率型荧光分子印迹纸芯片制备过程；
图2为本发明实施例1提供的不同浓度的CDs对HMC细胞的MTT毒性作用；
图3为本发明实施例1提供的不同浓度的CDs-Cys对HMC细胞的MTT毒性作用；
图4为本发明实施例1提供的含有荧光材料的细胞数量检测；A：PBS对照组；B：CDs组；C：PBS对照组；D：CDs-Cys；
图5为本发明实施例1提供的红外光谱；其中a：普通纤维素纸；b：纤维素荧光纸；c：荧光分子印迹纸；d：NIP；
图6为本发明实施例1提供的比率型荧光分子印迹纸芯片制备过程中的SEM图；其中A：普通纤维素纸；B：CDs荧光纸；C：CDs和NBD-APTESC荧光纸：D：荧光分子印迹纸；
图7是本发明实施例1提供的不同浓度的苯醚甲环唑作用下的比率型荧光分子印迹纸芯片的荧光强度变化。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一种比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
a.CDs的合成：称取0.15g叶酸粉末将其加入到50mL二次水中，充分搅拌，然后将溶液转移至反应釜中180℃下持续反应2h，反应完成后自然冷却。将合成的CDs通过0.22μm水系滤膜，再将其通过G-25葡聚糖凝胶柱进行纯化，得到的纯品CDs用锡箔纸避光处理并置于黑暗处，以备后用；
b.CDs的修饰：取7.128mgL-半胱氨酸加入18mL步骤a所述合成的CDs溶液中，在避光条件下，37℃恒温培育40min后置于黑暗出备用；
c.镶嵌有CDs的纤维素荧光纸的合成：首先，在培养皿中放入裁剪好且尺寸合适的纤维素纸，加入40mL 0.2％稀盐酸进行酸化，振荡20min后用去离子水冲洗三次以去除多余的稀盐酸，然后加入40mL 50％的乙醇和400μL APTES,混合后振荡2.5h，洗净，取18mL步骤b所述得到的CDs和L-半胱氨酸的混合液加入12mL溶解有MES缓冲液(pH＝5.2，0.1mM)的EDC(20mg/mL)中，覆盖锡箔纸混合振荡10min，然后将其倒入放有纸芯片的培养皿中，加入12mLNHS，静置1h后，避光振荡12h；
d.APTES-NBD偶联物的合成：称取0.97mg NBD，加入9.7mL的乙醇以及40μL APTES,然后在磁力搅拌器作用下反应10h；
e.荧光分子印迹纸的合成：在培养皿中放入3张步骤c所述的荧光纸芯片后，加入20mL乙醇和50μL TEOS，避光振荡4h，然后在培养皿中加入1mL步骤d所述的APTES-NBD偶联物混合液，以及9.445mg苯醚甲环唑，避光振荡30min。最后分别加入100μL氨水和50μLTEOS，避光振荡5h。反应完成后使用甲醇和乙酸的混合液(甲醇：乙酸＝8:2)进行洗脱，每次1h，洗脱2次，最后用去离子水冲洗3次。
非印迹聚合物(NIP)制备：按照上述操作规程，除了不加模板分子苯醚甲环唑之外，其他步骤同上；
f.将荧光分子印迹纸固定在制备好的具有三维结构的微流控基底上，形成比率型荧光分子印迹纸芯片。
实施例2
一种比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
a.CDs的合成：称取0.15g叶酸粉末将其加入到40mL二次水中，充分搅拌，然后将溶液转移至反应釜中170℃下持续反应2h，反应完成后自然冷却。将合成的CDs通过0.22μm水系滤膜，再将其通过G-25葡聚糖凝胶柱进行纯化，得到的纯品CDs用锡箔纸避光处理并置于黑暗处，以备后用；
b.CDs的修饰：取7.128mgL-半胱氨酸加入18mL步骤a所述合成的CDs溶液中，在避光条件下，36℃恒温培育35min后置于黑暗出备用；
c.镶嵌有CDs的纤维素荧光纸的合成：首先，在培养皿中放入裁剪好且尺寸合适的纤维素纸，加入35mL 0.2％稀盐酸进行酸化，振荡15min后用去离子水冲洗三次以去除多余的稀盐酸。然后加入35mL 50％的乙醇和350μL APTES,混合后振荡2h，洗净。取15mL步骤b所述得到的CDs和L-半胱氨酸的混合液加入10mL溶解有MES缓冲液(pH＝5.2，0.1mM)的EDC(20mg/mL)中，覆盖锡箔纸混合振荡10min，然后将其倒入放有纸芯片的培养皿中，加入10mLNHS，静置0.5h后，避光振荡12h；
d.APTES-NBD偶联物的合成：称取0.95mg NBD，加入9.5mL的乙醇以及35μL APTES,然后在磁力搅拌器作用下反应9h；
e.荧光分子印迹纸的合成：在培养皿中放入3张步骤c所述的荧光纸芯片后，加入15mL乙醇和40μL TEOS，避光振荡3h。然后在培养皿中加入0.8mL步骤d所述的APTES-NBD偶联物混合液，以及9.430mg苯醚甲环唑，避光振荡25min。最后分别加入90μL氨水和45μLTEOS，避光振荡4h。反应完成后使用甲醇和乙酸的混合液(甲醇：乙酸＝8:2)进行洗脱，每次1h，洗脱2次，最后用去离子水冲洗2次；
非印迹聚合物(NIP)制备：按照上述操作规程，除了不加模板分子苯醚甲环唑之外，其他步骤同上；
f.将荧光分子印迹纸固定在制备好的具有三维结构的微流控基底上，形成比率型荧光分子印迹纸芯片。
实施例3
一种比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
a.CDs的合成：称取0.15g叶酸粉末将其加入到60mL二次水中，充分搅拌，然后将溶液转移至反应釜中190℃下持续反应3h，反应完成后自然冷却。将合成的CDs通过0.22μm水系滤膜，再将其通过G-25葡聚糖凝胶柱进行纯化，得到的纯品CDs用锡箔纸避光处理并置于黑暗处，以备后用；
b.CDs的修饰：取7.128mgL-半胱氨酸加入20mL步骤a所述合成的CDs溶液中，在避光条件下，38℃恒温培育45min后置于黑暗出备用；
c.镶嵌有CDs的纤维素荧光纸的合成：首先，在培养皿中放入裁剪好且尺寸合适的纤维素纸，加入45mL 0.2％稀盐酸进行酸化，振荡25min后用去离子水冲洗三次以去除多余的稀盐酸。然后加入45mL 50％的乙醇和450μL APTES,混合后振荡3h，洗净。取20mL步骤b所述得到的CDs和L-半胱氨酸的混合液加入15mL溶解有MES缓冲液(pH＝5.2，0.1mM)的EDC(20mg/mL)中，覆盖锡箔纸混合振荡15min，然后将其倒入放有纸芯片的培养皿中，加入15mLNHS，静置1.5h后，避光振荡14h；
d.APTES-NBD偶联物的合成：称取1.00mg NBD，加入10.0mL的乙醇以及45μLAPTES,然后在磁力搅拌器作用下反应11h；
e.荧光分子印迹纸的合成：在培养皿中放入3张步骤c所述的荧光纸芯片后，加入25mL乙醇和60μL TEOS，避光振荡5h。然后在培养皿中加入1.2mL步骤d所述的APTES-NBD偶联物混合液，以及9.460mg苯醚甲环唑，避光振荡35min。最后分别加入110μL氨水和55μLTEOS，避光振荡6h。反应完成后使用甲醇和乙酸的混合液(甲醇：乙酸＝8:2)进行洗脱，每次1.5h，洗脱4次，最后用去离子水冲洗4次；
非印迹聚合物(NIP)制备：按照上述操作规程，除了不加模板分子苯醚甲环唑之外，其他步骤同上；
f.将荧光分子印迹纸固定在制备好的具有三维结构的微流控基底上，形成比率型荧光分子印迹纸芯片。
上述实施例1～3制备的比率型荧光分子印迹纸芯片性能近似，下面仅以实施例1为例，进行性能分析。
将冻存的HMC细胞株(由西安交通大学医学院、癌症研究所所赠)从液氮罐里取出后，放入37℃水浴锅中加热使之溶解，然后迅速离心1000r/min，5min，去除冻存液后加入1mL细胞培养液吹散后将其加入细胞培养瓶中，再加入4mL细胞培养液，轻轻摇晃使之混合均匀后放入CO2培养箱。
铺板：将生长好的细胞用PBS清洗3遍，加入1mL胰蛋白酶消化80-100s，用枪头轻轻吹散后进行离心(1800r/min，10min)，将离心后的上清液去除，加入1mL细胞培养液吹散后进行铺板(我们采用96孔板进行铺板，从C3开始，为了防止培养时间过长导致细胞培养液蒸发，我们在周围两圈加入200μL的PBS)，每孔加入100μL细胞液，再加入100μL的培养液，放入CO2培养箱培养12h。
加药：去除细胞培养液，用PBS冲洗三遍，实验组：100μL培养液+50μL的L-半胱氨酸修饰的碳量子点(CDs-Cys)溶液，对照组：100μL培养液+50μL的碳量子点溶液，阴性对照组：100μL培养液+50μL PBS，分别反应12h。
MTT检测：将培养好的细胞内加入10μL的MTT染液，在培养箱内反应4h，再加入100μL甲瓒溶解液，放入培养箱反应15min，用酶标仪检测570nm处其吸光度。
结果如图2和图3所示，由图2和图3可得，未经修饰的CDs溶液作用于HMC 12h后，细胞存活率在原始浓度作用下为81.12％、稀释6倍的CDs作用下为95.95％，证明CDs对细胞几乎没有毒性，安全性高；而经过L-半胱氨酸修饰后的CDs，作用于HMC细胞12h后，细胞存活率在原始浓度作用下为89.03％、稀释6倍的CDs作用下为细胞存活率为99.24％，证明CDs-Cys安全性很高，几乎没有毒性作用；通过两组数据的对比可知，细胞经L-半胱氨酸修饰后的CDs作用后，存活率由81.12％增加为89.03％，作用物在稀释6倍后由95.95％增加为99.24％，因此可以看出，L-半胱氨酸修饰CDs可降低量子点的毒性，为以后量子点的安全性修饰提供了基础性研究。
将冻存的HMC细胞株从液氮罐里取出后，放入37℃水浴锅中加热使之溶解，然后迅速离心1000转/min，5min，去除冻存液后加入1mL细胞培养液吹散后将其加入细胞培养瓶中，再加入4mL细胞培养液，轻轻摇晃使之混合均匀后放入CO2培养箱。将培养好的细胞用PBS清洗3遍，加入1mL的胰蛋白酶进行消化80-100s，用枪头轻轻吹散后进行离心(2000r/min，10min)，除去上清液，加入1mL培养液吹散后进行铺板(这里采用6孔板)，每孔加入500μL的细胞液、1.5mL细胞培养液后放入培养箱中12h。
将生长好的细胞除去细胞培养液，用PBS清洗3遍，分别加入200μL的CDs溶液及CDs-Cys溶液，孵育12h，将作用后的细胞从6孔板上消解下来后离心，均加入1mL PBS吹散后进行流式检测；其中阳性对照组为加入细胞液及CDs，阴性对照组为加入细胞液及50μL的PBS。
结果如图4所示，由CDs及CDs-Cys处理过的细胞内几乎没有蓝色荧光增强；CDs及CDs-Cys作用于细胞12h后，分别从1.88％，1.39％的细胞中检测到蓝色荧光，因此碳量子点及经L-半胱氨酸修饰后的碳量子点有很高的的安全性，几乎不对HMC细胞造成损伤。通过两组数据的对比可知，含有经L-半胱氨酸修饰后的蓝色碳量子点的细胞较含有蓝色碳量子点的细胞从1.88％降低到了1.39％，L-半胱氨酸的修饰使得可检测到的发蓝色荧光的细胞数量减少，L-半胱氨酸的修饰可能降低了含有碳量子点的细胞数量，在一定程度上起到了安全性修饰的作用。
通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)获得IR光谱(Tensor 27，Bruker)以确定合成过程中化学基团的变化，得到图5。对每步合成的纸芯片进行了红外光谱扫描，我们对各个红外吸收峰进行了归属；在图5a中，在1609cm-1和3439cm-1位置的峰较强，这分别是C-H和O-H引起的伸缩振动峰，这两个峰都是纤维素纸本身的特征峰；图5b与图5a相比，出现了位于3114cm-1和2956cm-1的峰，这是分别是归属于C＝C-H和C-C-H的伸缩振动峰。这两个峰是由于碳点引入，从而出现特征峰，证实了碳量子点被成功的接枝在了纸芯片上。438cm-1和667cm-1附近的振动峰是由Si-O的伸缩振动产生的，而1077cm-1附近宽且强的吸收峰是Si-O-Si的振动所产生的，证明了硅烷化试剂作为印迹材料成功引入到材料中间。位于1363cm-1的峰为C＝C的弯曲振动峰，位于1278cm-1左右的峰为C-C的弯曲振动峰。位于1116cm-1的峰为C-H的弯曲振动峰。位于1430cm-1附近的振动吸收峰是通过羧基和氨基形成酰胺键产生的。我们可以发现，纸芯片中含有羧基和氨基等含氮或含氧的官能团，这些丰富的官能团是碳量子点能大量且稳定接枝在纸芯片上的关键。
用扫描电镜对原始纤维素裸纸的正面、接枝了蓝色碳量子点的纤维素纸以及同时接枝蓝色碳量子点和绿色NBD的纤维素纸经过喷金处理后，用环境扫描电镜观察其形态，如图6所示；图6A显示了普通纤维素纸的SEM图，从图中可以观察到明显的纤维束状物，纤维束表面光滑并且无杂质；图6B和图6C显示了荧光纸芯片的SEM图，可以观察到纤维束表面有部分的小球，说明接枝CDs后，许多CDs及硅烷化材料被涂覆在纤维束表面，当纤维之间嵌入微小的CDs时，这种紧密镶嵌结构的形成表明量子点可以通过酰胺键稳定地接枝到纤维表面上，并且这种结合对量子点的荧光没有什么影响，图中宏观可观测到的接枝物应为硅烷化材料的修饰；图6D显示了荧光分子印迹纸的SEM图，可以看到纤维表面有许多大量的絮状物，纤维束变得十分粗糙，说明通过反应将印迹材料涂敷在纤维束表面。在聚合过程之后，接枝纸仍保持良好的多孔结构，这有利于进一步的分析应用。
通过激光共聚焦显微镜观察不同浓度的苯醚甲环唑作用下的比率型分子印迹纸芯片的荧光强度的变化情况。如图7所示，激光共聚焦显微镜可以进一步验证相应的荧光变化，检测时为了突出荧光强度的变化，将碳量子点的颜色由绿色代替，NBD的荧光由红色代替。从图中可以看出，在纤维素纸的表面出现了大量的红色荧光和绿色荧光，随着苯醚甲环唑浓度的增加，纤维素纸上的红色荧光开始逐渐加强。当模板分子不存在时，印迹纸芯片显示为黄绿色，是由于两种荧光强度相对等的情况下产生的。激光共聚焦显微镜可以直观的展示出印迹纸芯片随着模板分子浓度增加而发生的荧光强度的变化，也进一步在显示了CDs和NBD-APTES之间的荧光共振转移(FRET)过程。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将CDs和APTES-NBD偶联物依次修饰在纤维素纸表面，之后利用表面印迹技术在纤维素纸表面形成苯醚甲环唑印迹孔穴，制得荧光分子印迹纸，将荧光分子印迹纸固定在具有三维结构的微流控基底上，即得到比率型荧光分子印迹纸芯片。
2.根据权利要求1所述的比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1：采用一步水热法制备CDs，并将CDs进行氨基酸修饰，将修饰后的CDs通过酰胺键接枝于氨基化纤维素纸表面，合成镶嵌有CDs的纤维素荧光纸；
S2：将APTES-NBD偶联物修饰于S1制得的镶嵌有CDs的纤维素荧光纸上，制得纤维素荧光纸；在纤维素荧光纸上合成具有苯醚甲环唑的印迹层，完全除去模板苯醚甲环唑后形成苯醚甲环唑印迹孔穴，得到荧光分子印迹纸；
S3：将S2荧光分子印迹纸固定在具有三维结构的微流控基底上，形成比率型荧光分子印迹纸芯片。
3.根据权利要求2所述的比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，其特征在于，所述S1镶嵌有CDs的纤维素荧光纸具体是通过以下步骤制得：
S11：将叶酸粉末加至水中，搅拌均匀，170-190℃下反应2-3h，自然冷却制得CDs粗品；将合成的CDs粗品经滤膜过滤和过柱纯化，制得纯品CDs溶液；所述叶酸和水用量比为0.0025～0.00375g：1mL；
S12：将L-半胱氨酸加入S11合成的纯品CDs溶液中，避光条件下，36-38℃恒温反应35-45min，制得氨基酸修饰CDs溶液；所述L-半胱氨酸和纯品CDs溶液用量比为0.3564～0.7128g：1L；
S13：将纤维素纸浸入质量分数为0.2％的盐酸中酸化，之后置于质量分数为50％的乙醇和APTES构成的混合液中，振荡2-3h，洗净，制得氨基化纤维素纸；乙醇和APTES用量比为1mL：10μL；
S14：将EDC质量浓度为20mg/mL的EDC/MES溶液加至S12制得的氨基酸修饰CDs溶液中，混合均匀，制得混合溶液；将S13制得的氨基化纤维素纸浸入混合溶液中，并加入NHS质量浓度为20mg/mL的NHS/MES溶液，静置0.5-1.5h后，避光振荡12-14h，制得镶嵌有CDs的纤维素荧光纸；氨基酸修饰CDs溶液：EDC/MES溶液：NHS/MES溶液体积比为1.3-1.5:1:1。
4.根据权利要求2所述的比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，其特征在于，所述S2中荧光印迹纸具体是通过以下步骤制得：
S21：将NBD加入质量分数为50％的乙醇，并加入APTES，室温搅拌条件下反应9-11h，制得APTES-NBD偶联物；NBD：乙醇用量比为1g：10L,乙醇：APTES用量比为1mL：3.68-4.5μL；
S22：将S1制得的镶嵌有CDs的纤维素荧光纸浸入质量分数为50％的乙醇和TEOS构成的混合物中，避光振荡3-5h，加入S21制得的APTES-NBD偶联物和苯醚甲环唑，避光振荡25-35min后，加入氨水和第二批TEOS，避光振荡4-6h，洗脱、清洗后，制得荧光印迹纸；
混合物中乙醇：TEOS用量比为1mL：2.4-2.67μL，乙醇：APTES-NBD偶联物体积比为18.78-20.83:1，苯醚甲环唑和APTES-NBD偶联物用量比为7.88-11.79g：1L，乙醇和氨水用量比为1mL：4.4-6μL；氨水和第二批TEOS体积比为2:1。
5.根据权利要求2所述的比率型荧光分子印迹纸芯片的制备方法，其特征在于，所述S3中具有三维结构的微流控基底为纤维素纸折叠得到的三层微流控纸芯片。
6.一种根据权利要求1～5任一项制备方法制得的比率型荧光分子印迹纸芯片。
7.根据权利要求6所述的比率型荧光分子印迹纸芯片在农药苯醚甲环唑检测方面的应用。
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