CN106636310B - 前列腺癌相关microRNA检测试剂盒 - Google Patents
前列腺癌相关microRNA检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种前列腺癌相关microRNA检测试剂盒，包括有：针对每种待检测的前列腺癌相关microRNA有至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，以及捕获探针，所述前列腺癌相关microRNA的捕获探针的P1序列选自SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.19。本发明所选择的捕获探针和信号放大探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种前列腺癌相关microRNA检测试剂盒。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex,RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶miRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
前列腺癌的发病率在西方国家居于男性恶性肿瘤的首位，死亡率也仅次于肺癌二排在第二位。miRNA与前列腺癌的发生、发展和预后存在着密切的联系。有研究结果显示，miR-101、miR-449与前列腺癌的表观遗传调控相关，其中，miR-449表达下降后会使组蛋白去乙酰化酶(HDACs)表达增加从而启动下游的表观遗传学沉默。此外，miR-23、miR-34与前列腺的发生有关，其中，miR-23的靶标分子是谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶的大量生产，会使谷氨酰胺转变为谷氨酸，为肿瘤细胞提供能量并保护肿瘤细胞免受氧自由基的损伤，也有研究证实在前列腺癌中，miR-23的表达下调或缺失。另外，miRNA还与前列腺癌的侵袭、迁移有关，与之相关的miRNA主要有：miR-15a、miR-16、miR-21、miR-22、miR-222、miR-146、miR-205。
目前，针对miRNA的检测方法主要有Northern Blot、基因芯片、荧光定量探针法、基于微球的流式细胞术技术。但NorthernBlot方法敏感度低、耗时长且RNA的用量较大，不适合高通量分析；基因芯片技术能实现miRNA的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个miRNA，但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵；荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；而基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获miRNA序列，因此提高了准确性，但是由于miRNA同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。
原位杂交技术是一种定位和形态学检测保存的组织切片或细胞制备物中特异性miRNA序列的方法。然而目前现有技术中对miRNA的多重平行检测仍存在许多困难。首先，需要分别制备各靶miRNA的标记探针；其次，难以同时原位检测多种靶miRNA的表达。因此，目前报道的对多种miRNA的检测只能用不同的标记方法，然而，用不同的标记方法不能很好地控制探针与细胞中非特异性序列可能的交叉杂交。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的前列腺癌相关microRNA检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种前列腺癌相关microRNA检测试剂盒，包括有：针对每种待检测的前列腺癌相关microRNA有至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，以及捕获探针，所述前列腺癌相关microRNA选自选自:hsa-miR-375、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-200b-3p以及hsa-miR-15b-5p中的至少一种，其中：
所述捕获探针用于连接目标核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针从5’端到3’端
依次为特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列，针对不同目标基因的P2序列互不相同；
所述一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P4序列、间隔臂序列、P3序列，P3序列与P2序列互补配对；
所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；
所述P4序列含有至少一个与P5序列互补配对的碱基片段，且每个与P5序列互补配对的
碱基片段之间设有间隔臂序列；
所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端还修饰有荧光基团，针对不同目标核酸的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同；所述P6序列含有至少一个与P7序列互补配对的碱基片段，且每个与P7序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；
所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均为不存在发夹结构，各探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列；
所述待检测的前列腺癌相关miRNA的捕获探针的P1序列选自以下中的至少一种：针对hsa-miR-375的SEQ ID NO.1，针对hsa-miR-141-3p的SEQ ID NO.2，针对hsa-miR-100-5p的SEQ ID NO.3，针对hsa-miR-125b-5p的SEQ ID NO.4，针对hsa-miR-143-3p的SEQ IDNO.5，针对hsa-miR-205-5p的SEQ ID NO.6，针对hsa-miR-296-5p的SEQ ID NO.7，针对hsa-miR-96-5p的SEQ ID NO.8，针对hsa-miR-182-5p的SEQ ID NO.9，针对hsa-miR-183-5p的SEQ ID NO.10，针对hsa-miR-337-3p的SEQ ID NO.11，hsa-miR-330-3p的SEQ ID NO.12，hsa-miR-339-3p的SEQ ID NO.13，针对hsa-miR-124-3p的SEQ ID NO.14，针对hsa-miR-218-5p的SEQ ID NO.15，针对hsa-miR-10a-5p的SEQ ID NO.16，针对hsa-miR-199b-5p的SEQ ID NO.17，针对hsa-miR-200b-3p的SEQ ID NO.18，针对hsa-miR-15b-5p的SEQ IDNO.19。
在其中一个实施例中，所述P2序列选自：SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.39；所述P5序列选自：SEQ ID NO.60～SEQ ID NO.79，所述P7序列选自SEQ ID NO.100～SEQ ID NO.119；所述P4序列中的所述间隔臂序列为3—10个T；所述P6序列的所述间隔臂序列为2—10个T；P8序列为polyT。
在其中一个实施例中，所述polyT为3-10个T。
在其中一个实施例中，所述P4序列选自：SEQ ID NO.40～SEQ ID NO.59，所述P6序列选自：SEQ ID NO.80～SEQ ID NO.99。
在其中一个实施例中，所述一级信号放大探针中所述P4序列与P3序列之间的间隔臂序列选自5－20个T；二级信号放大探针中所述P5序列与P6序列之间的间隔臂序列选自5－10个T；三级信号放大探针中P7序列与P8序列之间的间隔臂序列选自3－10个T。
在其中一个实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488，且针对不同目标核酸的荧光基团互不相同。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明提供一种前列腺癌相关miRNA的检测捕获探针及根据该探针制备的检测试剂盒，所述的捕获采用的三明治结构(与靶标miRNA反向互补序列P1—间隔序列—与一级信号放大探针P3序列互补结合的P2序列)，与现有技术相比，该设计更为简单，更具有实用性。而且本技术方案所设计的捕获探针能够实现特异性强、灵敏度高的特点。本发明所选择的信号放大探针，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的。
(2)原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的原位杂交方法，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的miRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高miRNA原位杂交的检测灵敏度。
(3)本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
(4)本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1前列腺癌相关miRNA检测试剂盒
本实施例提供一种前列腺癌相关miRNA检测试剂盒，包括有捕获探针以及信号放大探针，信号放大探针包括有，一级信号放大探针、二级信号放大探针、三级信号放大探针。以上探针具有特异性强、灵敏度高的特点。
1、捕获探针
捕获探针是连接靶核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的靶核酸结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与一级信号放大探针P3序列互补配对的P2序列，针对不同目标基因的P2序列互不相同。
所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与特异性序列P1间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T。
本实施例针对hsa-miR-375、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-200b-3p以及hsa-miR-15b-5p设计捕获探针，具体如表1、表2：
表1 捕获探针的P1序列
表2 捕获探针的P2序列
| SEQ ID NO. | P2序列(5’→3’) | SEQ ID NO. | P2序列(5’→3’) |
| 20 | TGAAGACTGA | 30 | AGTCTTGAAG |
| 21 | ATTGATTGTG | 31 | TGATGAATTG |
| 22 | GTCTATAGTG | 32 | ATGACGATAG |
| 23 | GATTCAGTGA | 33 | TTGACGTGAA |
| 24 | TTGAGTAATG | 34 | TGTGACATGA |
| 25 | TGTAATGAGT | 35 | TGTAATTGAG |
| 26 | GATTAGTGAT | 36 | TGATGCATGT |
| 27 | GTAGATTAGT | 37 | TGAAGTGCAT |
| 28 | GATGACAGTA | 38 | TGAAGTGATT |
| 29 | AGTACTTGTG | 39 | TGTTGCAGTG |
2、信号放大探针
1)一级信号放大探针
针对每种待检测的miRNA包括一条或以上的一级信号放大探针，所述每条一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：与P2序列反向互补配对结合的P3序列、间隔臂序列、P4序列，P3序列通过与捕获探针P2序列的结合实现目标信号的级联放大。
本发明P3与P4序列之间的间隔臂序列可以选自5－20个T，本实施例使用的间隔臂为10个T。
所述P4序列含有一个或以上与二级信号放大探针的P5序列反向互补的碱基片段，优选含有2～5个与P2序列互补配对的碱基片段，本实施例中，P4含有3个与P5反向互补的碱基片段，相同碱基片段之间设有间隔臂序列，所述间隔臂序列优选为3—10个T，本实施例中为设有3个T。
表3 一级信号放大探针的P4序列
| SEQ ID NO. | P4序列(5’→3’) |
| 40 | TACTAC TTT TACTAC TTT TACTAC |
| 41 | TGATAC TTT TGATAC TTT TGATAC |
| 42 | GATCTC TTT GATCTC TTT GATCTC |
| 43 | ATATCA TTT ATATCA TTT ATATCA |
| 44 | TATCTC TTT TATCTC TTT TATCTC |
| 45 | CATCTC TTT CATCTC TTT CATCTC |
| 46 | TCACAT TTT TCACAT TTT TCACAT |
| 47 | ACTACA TTT ACTACA TTT ACTACA |
| 48 | CATCGA TTT CATCGA TTT CATCGA |
| 49 | TCAGCT TTT TCAGCT TTT TCAGCT |
| 50 | ACTCTC TTT ACTCTC TTT ACTCTC |
| 51 | ATCATC TTT ATCATC TTT ATCATC |
| 52 | ACATCC TTT ACATCC TTT ACATCC |
| 53 | TCTGCA TTT TCTGCA TTT TCTGCA |
| 54 | ACATAC TTT ACATAC TTT ACATAC |
| 55 | CATACA TTT CATACA TTT CATACA |
| 56 | TCTATC TTT TCTATC TTT TCTATC |
| 57 | CATATC TTT CATATC TTT CATATC |
| 58 | TGCTCA TTT TGCTCA TTT TGCTCA |
| 59 | CTGCTA TTT CTGCTA TTT CTGCTA |
2)二级信号放大探针
本发明含有一条或以上的二级信号放大探针，所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：与P4序列反向互补结合的P5序列、间隔臂序列、P6序列，所述P4含有一个或以上的P5序列反向互补碱基序列。
本发明P5与P6序列之间的间隔臂序列可以选自5－10个T，本实施例使用的间隔臂为6个T。
表4 二级信号放大探针的P5序列
| SEQ ID NO. | P5序列(5’→3’) | SEQ ID NO. | P5序列(5’→3’) |
| 60 | GTAGTA | 70 | GAGAGT |
| 61 | GTATCA | 71 | GATGAT |
| 62 | GAGATC | 72 | GGATGT |
| 63 | TGATAT | 73 | TGCAGA |
| 64 | GAGATA | 74 | GTATGT |
| 65 | GAGATG | 75 | TGTATG |
| 66 | ATGTGA | 76 | GATAGA |
| 67 | TGTAGT | 77 | GATATG |
| 68 | TCGATG | 78 | TGAGCA |
| 69 | AGCTGA | 79 | TAGCAG |
所述P6序列含有一个或以上与三级信号放大探针的P7序列反向互补的碱基片段，优选含有2-5个与P7序列互补配对的碱基片段，本实施例中，所述P6序列含有三个与P7序列反向互补片段，相同碱基序列之间设有间隔臂序列，间隔臂序列优选为2—10个T，本实施例中为有2个T。
表5 二级信号放大探针的P6序列
| SEQ ID NO. | P6序列(5’→3’) |
| 80 | CATAC TT CATAC TT CATAC |
| 81 | CACTC TT CACTC TT CACTC |
| 82 | CATGA TT CATGA TT CATGA |
| 83 | ACGAC TT ACGAC TT ACGAC |
| 84 | GACTC TT GACTC TT GACTC |
| 85 | CAGTT TT CAGTT TT CAGTT |
| 86 | ACACG TT ACACG TT ACACG |
| 87 | AGCAT TT AGCAT TT AGCAT |
| 88 | CTCGA TT CTCGA TT CTCGA |
| 89 | ACGTG TT ACGTG TT ACGTG |
| 90 | GACGA TT GACGA TT GACGA |
| 91 | GCTGA TT GCTGA TT GCTGA |
| 92 | TCGAG TT TCGAGTT TCGAG |
| 93 | GTGAC TT GTGAC TT GTGAC |
| 94 | TCGAC TT TCGAC TT TCGAC |
| 95 | GTCGA TT GTCGA TT GTCGA |
| 96 | CTCGT TT CTCGT TT CTCGT |
| 97 | TCTAG TT TCTAG TT TCTAG |
| 98 | CGTAC TT CGTAC TT CGTAC |
| 99 | CTGGA TT CTGGATT CTGGA |
3)三级信号放大探针
本发明所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P6序列含有一个或以上与P7序列反向互补的碱基片段；所述P8序列5’端还修饰有荧光基团。
本发明P7与P8序列之间的间隔臂序列可以选自3－10个T，本实施例使用的间隔臂为5个T。
表6 三级信号放大探针的P7序列
| SEQ ID NO. | P7序列(5’→3’) | SEQ ID NO. | P7序列(5’→3’) |
| 100 | GTATG | 110 | TCGTC |
| 101 | GAGTG | 111 | TCAGC |
| 102 | TCATG | 112 | CTCGA |
| 103 | GTCGT | 113 | GTCAC |
| 104 | GAGTC | 114 | GTCGA |
| 105 | AACTG | 115 | TCGAC |
| 106 | CGTGT | 116 | ACGAG |
| 107 | ATGCT | 117 | CTAGA |
| 108 | TCGAG | 118 | GTACG |
| 109 | CACGT | 119 | TCCAG |
本发明所述P8序列为polyT，优选为3-10个T。本实施例中，P8序列为5个碱基的polyT序列，其5’端带有荧光基团标记，荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488，针对不同目标核酸的荧光基团互不相同，即所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标核酸。
本发明所设计的信号放大探针，除上述条件限定的特定探针反向互补完全匹配的情况以外，所述P3、P4、P5、P6、P7、P8序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列。
实施例2一种检测前列腺相关miRNA试剂盒
本发明提供了一种前列腺相关miRNA检测试剂盒，该试剂盒能够检测靶标miRNAhsa-miR-375、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-200b-3p以及hsa-miR-15b-5p中的一种或者多种任意组合的表达水平，在实际检测中，能根据具体的需要，使用相应的P1～P8序列，组成检测试剂盒，即可实现检测。本实施例所述前列腺相关miRNA检测试剂盒在以下检测中随机分成5组进行检测。
本实施例检测试剂盒的组分包括有：捕获探针、信号放大探针和荧光基团，具体探针组分见表7所示。
表7 针对具体目标基因的检测试剂盒(表格数字为SEQ ID NO.)
实施例3运用实施例2中的试剂盒对样品进行检测
本实施例将使用实施例2的试剂盒，对前列腺癌细胞进行检测。
前列腺癌细胞来源为：前列腺癌细胞株PC3，本领域技术人员，根据细胞株名称，即可在现有产品中获得相关的细胞株。
所述各种溶液的配方如下：
本实施例中的信号放大探针混合液均使用实施例2相应列表中的全部探针。
一、样本预处理，将CTCs过滤至滤膜上
1.在样本保存管中使用保存液保存血液样本，600×g水平离心5min，弃上清。
2.加入4mL PBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。
3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mL PBS，洗涤管壁后抽滤液体。
4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μL 4％甲醛溶液，室温固定1h。
5.去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤三次，每次浸泡2min。
二、透化处理
1.在新的24孔板中每孔加入50μL透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。
2.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
三、消化细胞，暴露miRNA，使其与探针杂交
1.配制相应浓度的消化酶工作液：
| 试剂组分 | 每个样本用量 |
| 消化酶 | 1.25μL |
| PBS | 48.75μL |
| 总体积 | 50μL |
2.消化酶工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。
4.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。
四、探针杂交，探针特异性序列与目标miRNA序列结合
1.捕获探针混合液、探针缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制捕获探针工作液：
| 试剂组分 | 每个样本用量 |
| 捕获探针混合液 | 8μL |
| 探针缓冲液(40℃预热) | 42μL |
| 总体积 | 50.0μL |
涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml RI洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
五、目标mRNA序列信号放大
1.探针缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制探针工作液：
| 试剂组分 | 每个样本用量 |
| 信号放大探针混合液 | 8μL |
| 探针缓冲液(40℃预热) | 42μL |
| 总体积 | 50.0μL |
涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
六、显色，荧光标记目标信号
1.显色缓冲液(40℃预热)避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色缓冲液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
七、荧光显微镜观察CTCs
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μL抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。
2.通过20倍物镜计数CTC异性核数量。
3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。
5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。显微镜使用通道如下：
表8 荧光基团的激发波长和发射波长
八、检测结果判断及分析
1.阳性前列腺癌细胞鉴定标准
在滤膜上，富集有前列腺癌细胞，前列腺癌细胞阳性的判定标准为：
1)具有相应靶标miRNA特异性标识物，在本试剂盒中表现为在相应的荧光通道下显示荧光信号点。
2)细胞核DAPI染色阳性。
3)前列腺癌细胞核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。
白细胞大小与滤膜孔大小相近。
2.使用上述检测方法，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个前列腺癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：
表9 样本检测结果(荧光信号点数)
实施例4试剂盒的稳定性
1、试剂盒稳定性检测
本发明提供一种miRNA检测的试剂盒，所述的试剂盒针对不同的目标检测miRNA，选取不同数量的捕获探针，组成相应的探针混合液，从而实现不同数量miRNA的并行检测。
本实施例将使用实施例2的探针组Group1组成的试剂盒，对三组不同细胞株来源的15种样本(每种细胞株5个样本)中的hsa-miR-375、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-125b-5p表达情况进行检测，从而评估本发明试剂盒的稳定性。
2、关于检测样本来源
本实施例使用前列腺癌的3种不同的细胞株来源的前列腺癌细胞作为检测对象，从而验证其有效性和稳定性(可重复性)，具体细胞株和样本如表10所示，本领域技术人员，根据细胞株名称，即可在现有产品中获得相关的细胞株。本实施例所述探针选自实施例1～2，实验步骤参考实施例3。
表10 细胞株和检测样本
| 样本号 | 前列腺癌细胞株 | 实验组 |
| 样本26～样本30 | PC3 | Group6 |
| 样本31～样本35 | DU145 | Group7 |
| 样本36～样本40 | LNCap | Group8 |
3、检测结果
使用上述试剂盒，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个前列腺癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：
表11 样本检测结果(荧光信号点数)
从上述检测结果可见，一方面，不同细胞株来源的样本，其检测结果不同，因此，本发明是能够实现不同miRNA表达水平检测的，是有效的；另一方面，相同细胞株来源的5个样本，其hsa-miR-375、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-125b-5p等4中miRNA的荧光点数检测结果相近(±3)，具体见Group6(样本26～30)、Group7(样本31～35)或Group8(样本36～40)，因此，本试剂盒重复性好；由此可见，本发明试剂盒是有效的，稳定性可靠的，其它针对不同miRNA种类的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例5靶标miRNA数量选择
1、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
本发明提供一种靶标miRNA检测的试剂盒，所述的试剂盒针对不同的目标检测miRNA，选取不同数量的捕获探针，组成相应的探针混合液，从而实现不同数量miRNA的并行检测。
本实施例分别针对1种、3种、5种、7种miRNA，选用捕获探针，信号放大探针选择一级信号方法探针、二级放大探针以及三级信号放大探针，组成检测试剂盒，对同一细胞株PC3来源的样本进行检测，对比其检测效果，具体组成如表12，所述探针选自实施例1～2，实验步骤参考实施例3。
表12 选择不同数量靶标miRNA的捕获探针(表格数字为SEQ ID NO.)
2、使用上述试剂盒，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个前列腺癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：
表13 样本检测结果(荧光信号点数)
通过上述4组实验对比可知，本试剂盒可以针对不同数量的靶标miRNA进行检测，使用1条、3条和5条、7条的针对不同miRNA捕获探针均可完成检测，特异性和稳定性都很好。
其它针对标志基因的使用不同数量捕获探针的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例6标记探针的选择
1、试剂盒制备的设计(信号放大探针组合的选择)
本发明提供一种前列腺癌相关miRNA检测的试剂盒，所述的试剂盒针对不同的目标检测miRNA，选取不同信号探针组合，组成相应的探针混合液，从而实现miRNA的并行检测。
本实施例将使用实施例1的所提供的各级信号放大探针组成的试剂盒，对同一细胞株(PC3)来源的5个样本中的hsa-miR-375、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-125b-5p表达情况进行检测，从而评估本发明所提供的P2，P3，P4，P5，P6，P7信号放大探针的适用性。具体的试剂盒组成如下：
表14 不同信号放大探针组合(表格数字为SEQ ID NO.)
2、使用上述试剂盒，对每个样本进行检测(应用实施例3所述检测方法)和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个前列腺癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：
表15 不同信号放大探针组合的检测结果
通过上述3组实验对比可知，使用不同信号探针组合组成的试剂盒对miRNA进行检测，其检测结果相一致，除了本实施例检测的miRNA以及其放大探针组合外，本发明所提供的其他miRNA以及其他信号放大探针的组合，同样能实现本实施例的检测效果，具体试验结果省略。由此可知，本发明提供的信号放大探针可以根据实际操作需要进行任意搭配，并且能实现本发明所述的miRNA检测，其检测结果一致，说明本发明所提供的信号放大探针对于前列腺癌相关miRNA检测具有良好的适用性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种前列腺癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，包括有：针对每种待检测的前列腺癌相关microRNA有一级信号放大探针、二级信号放大探针、和三级信号放大探针，以及捕获探针，所述前列腺癌相关microRNA包括:hsa-miR-375、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-200b-3p以及hsa-miR-15b-5p，其中：所述捕获探针用于连接目标核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针从5’端到3’端依次为特异性P1序列、
间隔臂序列、P2序列，针对不同目标基因的P2序列互不相同；
所述一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P4序列、间隔臂序列、P3序列，P3序列与P2序列互补配对；
所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；
所述P4序列含有至少一个与P5序列互补配对的碱基片段，且每个与P5序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；
所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P8序列5’端还修饰有荧光基团，针对不同目标核酸的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同；所述P6序列含有至少一个与P7序列互补配对的碱基片段，且每个与P7序列互补配对的碱基片段之间设有间隔臂序列；
所述P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列、P8序列均为不存在发夹结构，各探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列；
所述待检测的前列腺癌相关miRNA的捕获探针的P1序列包括：针对hsa-miR-375的SEQID NO.1，针对hsa-miR-141-3p的SEQ ID NO.2，针对hsa-miR-100-5p的SEQ ID NO.3，针对hsa-miR-125b-5p的SEQ ID NO.4，针对hsa-miR-143-3p的SEQ ID NO.5，针对hsa-miR-205-5p的SEQ ID NO.6，针对hsa-miR-296-5p的SEQ ID NO.7，针对hsa-miR-96-5p的SEQ IDNO.8，针对hsa-miR-182-5p的SEQ ID NO.9，针对hsa-miR-183-5p的SEQ ID NO.10，针对hsa-miR-337-3p的SEQ ID NO.11，hsa-miR-330-3p的SEQ ID NO.12，hsa-miR-339-3p的SEQID NO.13，针对hsa-miR-124-3p的SEQ ID NO.14，针对hsa-miR-218-5p的SEQ ID NO.15，针对hsa-miR-10a-5p的SEQ ID NO.16，针对hsa-miR-199b-5p的SEQ ID NO.17，针对hsa-miR-200b-3p的SEQ ID NO.18，针对hsa-miR-15b-5p的SEQ ID NO.19；所述P8序列为polyT；所述P2序列包括：SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.39；所述P5序列包括：SEQ ID NO.60～SEQ IDNO.79，所述P7序列包括SEQ ID NO.100～SEQ ID NO.119；所述P4序列中的所述间隔臂序列为3—10个T；所述P6序列的间隔臂序列为2—10个T；所述P4序列包括：SEQ ID NO.40～SEQID NO.59，所述P6序列包括：SEQ ID NO.80～SEQ ID NO.99。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述polyT为3-10个T。
3.根据权利要求1或2所述的前列腺癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述一级信号放大探针中所述P4序列与P3序列之间的间隔臂序列选自5－20个T；二级信号放大探针中所述P5序列与P6序列之间的间隔臂序列选自5－10个T；三级信号放大探针中P7序列与P8序列之间的间隔臂序列选自3－10个T。
4.根据权利要求1或2所述的前列腺癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488。
5.根据权利要求1-4任一项所述的前列腺癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述P2序列为：针对hsa-miR-375的SEQ ID NO.20，针对hsa-miR-141-3p的SEQ ID NO.21，针对hsa-miR-100-5p的SEQ ID NO.22，针对hsa-miR-125b-5p的SEQ ID NO.23，针对hsa-miR-143-3p的SEQ ID NO.24，针对hsa-miR-205-5p的SEQ ID NO.25，针对hsa-miR-296-5p的SEQID NO.26，针对hsa-miR-96-5p的SEQ ID NO.27，针对hsa-miR-182-5p的SEQ ID NO.28，针对hsa-miR-183-5p的SEQ ID NO.29，针对hsa-miR-337-3p的SEQ ID NO.30，hsa-miR-330-3p的SEQ ID NO.31，hsa-miR-339-3p的SEQ ID NO.32，针对hsa-miR-124-3p的SEQ IDNO.33，针对hsa-miR-218-5p的SEQ ID NO.34，针对hsa-miR-10a-5p的SEQ ID NO.35，针对hsa-miR-199b-5p的SEQ ID NO.36，针对hsa-miR-200b-3p的SEQ ID NO.37，针对hsa-miR-15b-5p的SEQ ID NO.38。
6.根据权利要求1-4任一项所述的前列腺癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述P5序列为：针对hsa-miR-375的SEQ ID NO.60，针对hsa-miR-141-3p的SEQ ID NO.61，针对hsa-miR-100-5p的SEQ ID NO.62，针对hsa-miR-125b-5p的SEQ ID NO.63，针对hsa-miR-143-3p的SEQ ID NO.64，针对hsa-miR-205-5p的SEQ ID NO.65，针对hsa-miR-296-5p的SEQID NO.66，针对hsa-miR-96-5p的SEQ ID NO.67，针对hsa-miR-182-5p的SEQ ID NO.68，针对hsa-miR-183-5p的SEQ ID NO.69，针对hsa-miR-337-3p的SEQ ID NO.70，hsa-miR-330-3p的SEQ ID NO.71，hsa-miR-339-3p的SEQ ID NO.72，针对hsa-miR-124-3p的SEQ IDNO.73，针对hsa-miR-218-5p的SEQ ID NO.74，针对hsa-miR-10a-5p的SEQ ID NO.75，针对hsa-miR-199b-5p的SEQ ID NO.76，针对hsa-miR-200b-3p的SEQ ID NO.77，针对hsa-miR-15b-5p的SEQ ID NO.78。
7.根据权利要求1-4任一项所述的肺癌相关microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述P7序列为：针对hsa-miR-375的SEQ ID NO.100，针对hsa-miR-141-3p的SEQ ID NO.101，针对hsa-miR-100-5p的SEQ ID NO.102，针对hsa-miR-125b-5p的SEQ ID NO.103，针对hsa-miR-143-3p的SEQ ID NO.104，针对hsa-miR-205-5p的SEQ ID NO.105，针对hsa-miR-296-5p的SEQ ID NO.106，针对hsa-miR-96-5p的SEQ ID NO.107，针对hsa-miR-182-5p的SEQ IDNO.108，针对hsa-miR-183-5p的SEQ ID NO.109，针对hsa-miR-337-3p的SEQ ID NO.110，hsa-miR-330-3p的SEQ ID NO.111，hsa-miR-339-3p的SEQ ID NO.112，针对hsa-miR-124-3p的SEQ ID NO.113，针对hsa-miR-218-5p的SEQ ID NO.114，针对hsa-miR-10a-5p的SEQID NO.115，针对hsa-miR-199b-5p的SEQ ID NO.116，针对hsa-miR-200b-3p的SEQ IDNO.117，针对hsa-miR-15b-5p的SEQ ID NO.118。
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