CN106987636A - 一种判断浓香型白酒窖泥质量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种判断浓香型白酒窖泥质量的方法。本发明涉及生物技术领域中的菌群检测方法,尤其是基于高通量测序方法确定某属的菌群在微生物群落中组成比例的方法来判断发酵窖泥的质量。该方法包括待测样本基因组DNA的提取,16S rDNA高通量测序;序列的优化,OTU(Operational Taxonomic Unit)划分,OTU注释,以及Lactobacillus含量百分比的计算。通过对浓香型白酒窖泥未知样本进行基因组提取然后16S rDNA高通量测序从而分析其中乳酸杆菌(Lactobacillus)的组成比例,继而判断窖泥质量是优质窖泥还是普通窖泥。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中通过高通量测序对微生物群落定量的方法,尤其是菌群含量众多的复杂微生物群落,通过高通量测序手段快速处理数据得到窖泥微生物群落中乳酸杆菌(Lactobacillus)的相对含量,并把该相对含量数值作为判断窖泥质量好坏的依据的方法。
背景技术
中国传统的白酒酿造历史渊源留长,操作工艺复杂,最终产出的白酒质量受到发酵工艺、酿酒微生物群落的共同影响。在酿酒原材料和发酵工艺操作条件一样的情况下,作为酿酒核心动力的酿酒微生物群落显得尤为重要。与酿酒相关的微生物来源,包括大曲、窖泥、酒醅和酿酒过程中来自于水、空气中的微生物。在酿酒工艺中,整个厂区的大曲统一生产,统一随着酿酒原材料粮食统一混匀进行生产,然后统一分运到不同窖池进行发酵,因而客观来说,大曲的质量不会对不同窖池之间的发酵质量差异产生很大影响。其次,在同一厂区的小范围内,水质和环境变化不大,即使有所差异也不是人为可以调控的。而酒醅微生物群落实际上是由大曲和经过蒸馏前处理后的原材料混合后得到,在发酵过程中酒醅微生物群落与窖泥微生物群落之间存在互动,经过2-3个月的发酵形成最终发酵成熟的酒醅,最终对成熟酒醅经过蒸馏才产生了不同质量的酒。因此,酒醅微生物群落在发酵过程中不断变化,而且受到窖泥微生物群落的影响。
申请人通过实验发现,排除发酵过程中人为操作的失误,浓香型白酒[GB/T10781.1-2006]优质窖池与普通窖池的发酵完成后的酒醅微生物群落差异很小,而优质窖池和普通窖池的窖泥微生物群落却相差很大,尤其是其中的乳酸杆菌(Lactobacillus)的含量差异尤其大,因而窖泥中的单独乳酸杆菌这个属的含量就可以作为鉴定窖泥质量的依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于判断浓香型白酒窖泥质量的方法,本发明通过高通量测序测定窖泥中微生物群落组成并根据测序结果计算菌群中的乳酸杆菌的含量相对于原核菌群总数的比例,进而判断浓香型白酒窖泥质量。
本发明实现目的的技术方案如下:
一种通过窖泥微生物群落中乳酸杆菌的含量判断窖泥质量的方法,该方法包括以下几步:
⑴浓香型白酒窖泥样本宏基因组的提取;
⑵窖泥样本宏基因组16S rDNA高通量测序;通过一系列程序对样本中的16SrDNA序列进行高通量测序:利用通用引物PCR扩增16S rDNA序列;PCR产物上高通量测序平台进行测序;
⑶测序序列的优化,去除兼并碱基多的序列,偏短序列以及嵌合体序列;
⑷序列信息的注释:对优化所得的序列使用97%的相似度进行划分OTU,选取各OTU中含量最多的序列为该OTU的代表序列,然后对各OTU使用数据库进行序列信息的注释;
序列信息的注释是指首先对所有16S rDNA序列进行聚类,根据各序列之间的相似度划分OTU,随机抽取一个序列默认为第一个OTU,下一个序列如果与该序列相似度≥97%,即表示该序列同属于第一个OTU,如果相似度<97%则作为下一个OTU的序列,依次类推;选取出现次数最多的那条序列作为该OTU的代表序列;然后使用优化的数据库对各OTU代表序列进行注释,根据注释的信息,就可以知道该16S rDNA序列的来源菌的门,纲,目,科,属,甚至到种的信息;
⑸在属的层级上统计出各OTU中注释到乳酸杆菌Lactobacillus的序列总数占样本总菌群测序数量的比例;
根据步骤⑸的注释信息,就知道样本中有哪些OTU的注释信息为乳酸杆菌,又知道每个OTU含有多少条序列,就可以统计出总共多少条序列注释到乳酸杆菌,然后用注释到乳酸杆菌的总数除以该样本测序所得优化后的16S rDNA序列总数,即得到乳酸杆菌的比例;
⑹根据⑸中所得到的乳酸杆菌的比例大小判断样本来源的窖泥质量为优质窖泥还是普通窖泥;其中,乳酸杆菌的含量百分比<10%即为优质窖泥;如果含量百分比>20%,即为普通窖泥。
而且,所述16S rDNA序列为某个可变区区,或者全长。
而且,所述高通量测序序列优化处理,去掉序列长度明显低于目标序列长度的序列,去掉兼并碱基数量太多的序列,去掉嵌合体序列。
而且,优化的数据库包括RDP,SILVA,GreenGenes。
本发明的优点和有益效果是:
1、窖泥样本中微生物种类繁多复杂,研究功能微生物群落的功能需要首先了解其基本的微生物组成,以及重点的探究其中几种核心功能微生物的含量。本发明正是对窖泥微生物群落分析中的质量判断问题提出一套解决方案,得以实现对窖泥质量的判断。
2、本发明的实施需要进行16S rDNA可变区高通量测序,现在测序成本已经很低,而且将来会越来越低,本发明的实用性随着测序的容易程度提高会越来越广泛。
附图说明
图1为实施例1中窖泥取样的“九点取样法”。
图2为实施例中计算的各样本中乳酸杆菌的含量百分比。
具体实施方式
以下为在某浓香型白酒生产厂区内采取12个窖泥样本,并通过高通量测序的方法判断其中乳酸杆菌(Lactobacillus)含量百分比,并根据该百分比判定窖泥样本质量的优劣。本专利以此为例对本发明做详述,但不限于实施例。
一种用于判断浓香型白酒发酵窖泥质量的方法,包括以下步骤:
⑴窖泥样本中的全基因组提取及其16S rDNA高通量测序;
首先使用合适的土壤基因组提取试剂盒提取待测窖泥样本中的宏基因组(天然微生物群落中往往含有成百上千种不同的微生物,它们的基因组混合在一起的基因组样本称之为宏基因组)。以宏基因组为模板,使用16S rDNA通用引物(本专利要求测序任何一个16SrDNA的可变区的通用引物都可以,扩增目标序列越长越好)进行扩增(退火58℃,35个循环以内),然后将PCR产物加接头(接头与选择的高通量测序的方式有关),进行高通量测序。
将通过高通量测序得到并进行比对优化,删掉太短的序列(小于目标测定序列长度的80%)(可能来自于断裂的PCR产物片段),删掉兼并碱基太多的序列,查询其中的嵌合体序列(比如使用DECIPHER网站http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimeras.html查询),删掉嵌合体序列。
⑵高通量测序序列的分析及注释;
将⑴中优化得到的所有的核糖体rRNA基因序列进行聚类,根据各序列之间的97%的相似度划分OTU,随机抽取一个序列默认为第一个OTU,下一个序列如果与该序列相似度≥97%,即表示该序列同属于第一个OTU,如果相似度<97%则作为下一个OTU的序列,依次类推;每个OTU中选择出现次数最多的那条序列作为该OTU的代表序列。使用数据库(RDP,SILVA,GreenGenes等.各个数据库网站如下:RDP[rdp.cme.msu.edu],GreenGenes[greengenes.secondgenome.com],SILVA[http://www.arb-silva.de])对每个OTU进行注释,对序列注释到门,纲,目,科,属,甚至到种。不过受16S rDNA序列的保守性影响,很可能绝大多数序列只能注释到属及以下分类等级。上述几个数据库因为历史的原因,所收集的核糖体rRNA基因序列在数量上和质量上都有所不同,一般在遇到注释困难或有歧义的序列时需要同时使用几个数据库以便得到最佳结果。
⑶16S rDNA高通量测序中乳酸杆菌(Lactobacillus)的代表性序列(使用第四个可变区的通用引物520F和802R扩增得到):
AGCGCAGGCGGAAAGATAAGTCAGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAATAGCATCGGAAACTGTCTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTAGTA
⑷窖泥样本中乳酸杆菌(Lactobacillus)的含量百分比计算;
根据⑵注释信息,就可以知道样本中有哪些OTU的注释信息为乳酸杆菌,又根据每个OTU中的序列数,统计出样本中注释到乳酸杆菌的序列总数,然后用注释到乳酸杆菌的总数除以该样本测序所得优化后的16S rDNA序列总数,即得到乳酸杆菌的比例。
⑸窖泥质量的判断;
根据⑶中得到的比例判断窖泥质量的优劣。如果样本中乳酸杆菌的含量百分比<10%即为优质窖泥;如果含量百分比>20%,即为普通窖泥;如果含量百分比居于两者中间则表示窖泥为中间状态。
实施例1
窖泥样本中的全基因组提取及其16S rDNA高通量测序:
⑴取样。在某酿酒公司厂区范围内选取12个窖池按照图1的九点取样法进行取样。每个位点取大小为2cm×2cm×2cm的窖泥,然后将9块窖泥混合均匀后的窖泥块作为该窖泥的一个样本。
⑵基因组提取。根据试剂盒要求,称取窖泥样本样品200毫克,采用Solarbio土壤基因组试剂盒或上海生工EZUP柱式土壤基因组抽提试剂盒方法提取基因组,最后洗脱体积为100μL。基因组模板样品(10-50ng/ul)-80℃冷藏备用。剩余窖泥样本可以塑料袋密封在-80℃冰箱保存1-2年。
⑶高通量测序。以⑵中所提取的基因组为模板进行16S rDNA扩增,其扩增引物为16S rDNA通用引物(16S rDNA可变区的通用引物都可以,比如:16S rDNA全长序列的引物为27F 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和1492R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3’;第四可变区V4区的引物为:520F 5’-GCA CCT AAY TGG GYD TAA AGN G-3’和802R 5’-TACNVG GGT ATC TAA TCC-3’),然后对16S rDNA的PCR扩增产物进行纯化,然后上高通量测序平台完成测序。(此步一般委托拥有大型高通量测序平台的生物技术公司完成)
实施例2
高通量测序序列的分析及注释
⑴高通量测序序列的优化。经过高通量测序得到的序列不能直接进行数据分析,需要去接头,删掉长度太长(大于目标测定序列长度的110%)(可能是非目标扩增产物)或者太短(小于目标测定序列长度的80%)(可能来自于断裂的PCR产物片段)的序列,删掉兼并碱基数量超过2%的序列(测序质量不高的序列),删掉嵌合体序列(以断裂的PCR产物为引物扩增形成的嵌合体序列,可以使用查询工具确定哪些序列是嵌合体,比如可以使用Mothur软件中的UCHIME,或者通过DECIPHER网站http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimeras.html查询)。
⑵优化后的序列进行注释。将⑴中优化得到的所有的核糖体rRNA基因序列进行97%相似度(UCLUST)聚类划分OTU,其原则为随机抽取一个序列默认为第一个OTU,下一个序列如果与该序列相似度≥97%,即表示该序列同属于第一个OTU,如果相似度<97%则作为下一个OTU的序列,依次类推;每个OTU中选择出现次数最多的那条序列作为该OTU的代表序列。使用数据库(RDP,SILVA,GreenGenes等)对每个OTU进行注释,对序列注释到门,纲,目,科,属,甚至到种。
实施例3
窖泥样本中乳酸杆菌(Lactobacillus)的含量百分比计算
根据高通量测序中得到的注释信息,统计出样本所有注释为乳酸杆菌(Lactobacillus)的OTU,把所有这些OTU的序列累加,统计出样本中注释到乳酸杆菌的序列总数,然后用注释到乳酸杆菌的总数除以该样本测序所得优化后的16S rDNA序列总数,即得到乳酸杆菌的比例。如图2所示为各样本中乳酸杆菌的含量百分比。从图来看,乳酸杆菌含量大的超过60%,低的接近2%,差异非常大。
实施例4
窖泥样本中乳酸杆菌(Lactobacillus)的含量百分比计算
通过实际大量窖池的质量数据建立本专利判定优劣窖泥的标准:乳酸杆菌的含量百分比<10%即为优质窖泥;如果含量百分比>20%,即为普通窖泥;如果含量百分比居于两者中间则表示窖泥为中间状态。结合图2的示例窖池信息可以判断:NA2~NB2五个窖泥样本为优质窖泥;除去NC3之外的五个NC窖泥样本为普通窖泥;窖泥样本NA1和NC3的质量介于好与差之间。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨工业大学(威海)
安徽瑞思威尔科技有限公司
<120> 一种判断浓香型白酒窖泥质量的方法
<130> 2017-04-07
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 225
<212> DNA
<213> 16S rDNA高通量测序中乳酸杆菌(Lactobacillus)的代表性序列
<400> 1
agcgcaggcg gaaagataag tcagatgtga aagccctcgg cttaaccgag gaatagcatc 60
ggaaactgtc tttcttgagt gcagaagagg agagtggaac tccatgtgta gcggtggaat 120
gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctc tctggtctgt aactgacgct 180
gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga ttagataccc tagta 225
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物为27F
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 1492R
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (6)
1.一种通过窖泥微生物群落中乳酸杆菌的含量判断窖泥质量的方法,其特征在于:该方法包括以下几步:
⑴浓香型白酒窖泥样本宏基因组的提取;
⑵窖泥样本宏基因组16S rDNA高通量测序;通过一系列程序对样本中的16S rDNA序列进行高通量测序:利用通用引物PCR扩增16S rDNA序列;PCR产物上高通量测序平台进行测序;
⑶测序序列的优化,去除兼并碱基多的序列,长度太长序列、偏短序列以及嵌合体序列;
⑷序列信息的注释:对优化所得的序列使用97%的相似度进行划分OTU,选取各OTU中含量最多的序列为该OTU的代表序列,然后对各OTU使用数据库进行序列信息的注释;
序列信息的注释是指首先对所有16S rDNA序列进行聚类,根据各序列之间的相似度划分OTU,随机抽取一个序列默认为第一个OTU,下一个序列如果与该序列相似度≥97%,即表示该序列同属于第一个OTU,如果相似度<97%则作为下一个OTU的序列,依次类推;选取出现次数最多的那条序列作为该OTU的代表序列;然后使用优化的数据库对各OTU代表序列进行注释,根据注释的信息,就可以知道该16S rDNA序列的来源菌的门,纲,目,科,属,甚至到种的信息;
⑸在属的层级上统计出各OTU中注释到乳酸杆菌Lactobacillus的序列总数占样本总菌群测序数量的比例;
根据步骤⑸的注释信息,就知道样本中有哪些OTU的注释信息为乳酸杆菌,又知道每个OTU含有多少条序列,就可以统计出总共多少条序列注释到乳酸杆菌,然后用注释到乳酸杆菌的总数除以该样本测序所得优化后的16S rDNA序列总数,即得到乳酸杆菌的比例;
⑹根据⑸中所得到的乳酸杆菌的比例大小判断样本来源的窖泥质量为优质窖泥还是普通窖泥;其中,乳酸杆菌的含量百分比<10%即为优质窖泥;如果含量百分比>20%,即为普通窖泥。
2.根据权利要求1所述的通过窖泥微生物群落中乳酸杆菌的含量判断窖泥质量的方法,其特征在于:所述16S rDNA序列为某个可变区区,或者全长。
3.根据权利要求1所述的通过窖泥微生物群落中乳酸杆菌的含量判断窖泥质量的方法,其特征在于:所述高通量测序序列优化处理,去掉序列长度明显低于目标序列长度的序列,去掉兼并碱基数量太多的序列,去掉嵌合体序列。
4.根据权利要求1所述的通过窖泥微生物群落中乳酸杆菌的含量判断窖泥质量的方法,其特征在于:优化的数据库包括RDP,SILVA,GreenGenes。
5.根据权利要求1所述的通过窖泥微生物群落中乳酸杆菌的含量判断窖泥质量的方法,其特征在于:所述长度太长为大于目标测定序列长度的110%。
6.根据权利要求1所述的通过窖泥微生物群落中乳酸杆菌的含量判断窖泥质量的方法,其特征在于:偏短序列为小于目标测定序列长度的80%。
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