CN107532193A - 确定用以评估处理样品中的微生物的多样性和存活力阈值的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是针对用于鉴别存在于水处理系统的特定部分中的特定微生物的方法和组合物。所述方法包括从所述处理获得样品，和确定成问题的生物体是否超过可接受的阈值。如果超过，那么可以远在出现任何不想要的缺陷或问题之前应用补救生物控制程序。

Description

确定用以评估处理样品中的微生物的多样性和存活力阈值的 方法
相关申请的交叉引用
本申请是要求2015年4月15日提交的美国申请第14/687,017号的权益的PCT申请，所述美国申请的公开内容全文并入。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
不可适用。
技术领域
本发明大体上涉及可用于确定多样性和存活力阈值的物质组成、装置和方法。所述阈值可以用以确定微生物是否促成了处理效率问题或产品品质问题。所述阈值还可用于鉴别特定微生物在何处进入处理流和/或特定微生物在何处增殖。
背景技术
工业处理流中不想要的微生物的存在可能会导致多种问题，例如在设备表面上沉积、机器性能受损、生产效率损失和最终产品不合格。能够准确地鉴别哪些生物体增殖和它们如何增殖可以极大地帮助解决这些问题。
举例来说，在造纸系统中，微生物生长可能相当有害并且代价很高。微生物在设备表面上的生长可能会导致形成沉积物，所述沉积物剥落并且造成纸张疵点和孔洞。被污染的喷淋水处理或处理水可能会导致微生物在毡上生长，这通常导致在毡上形成堵塞。这些堵塞又造成多种问题，最值得注意的是削弱了水从纸幅的去除。因此，微生物生长可能会导致过度并且代价高地需要对毡或其它造纸设备进行多次煮沸和清洁。这些问题在无法精确确定有哪些微生物时可能混在一起，因为这可能会导致需要侵蚀性化学处理，所述侵蚀性化学处理可能会缩短毡的使用寿命、进一步降低纸的品质、进一步影响处理设备和/或甚至可能并不控制基础微生物侵染。此外，不当地区别生物所致问题与机械或化学所致问题可能会进一步导致尝试不适当、浪费并且可能产生相反结果。
已知多种现有技术方法用于鉴别造纸系统中存在哪些微生物。然而，这些方法在应用到纸张或纸毡时缺陷尤为明显。一些现有技术方法(例如美国专利8,012,758、7,981,679和7,949,432)检测造纸系统的流体中因活的微生物生物体产生的各种影响。其它方法(例如US 5,281,537)依赖于获得活的微生物污染物的样品和使其更多地生长以便进行各种分析。然而，在纸张和纸毡的情况下，这些方法特别不适当，因为到获取毡或纸的样品时，样品不再含有充足(或任何)的供培养的活生物体或它们所产生的任何化学产物。此外，造纸系统的在加热或干燥区段下游的物料(例如纸张和纸毡)具有在微生物已经导致缺陷之后导致它们被消灭的全部缺陷。不依赖于活生物体的存在的替代性方法也往往会有缺陷，因为它们常常产生假阳性。举例来说，茚三酮(其用以检测伯胺或仲胺)和IR光谱法常常产生假阳性或阴性，因为它们检测可能具有非生物来源的材料(例如化学添加剂或污染)。
因此，显而易见的是，正确鉴别存在于工业处理流和设备上的微生物在新颖方法和组合物中有明显的效用。本章节中描述的技术并不意图表示承认本文中参考的任何专利、公开或其它信息是关于本发明的“现有技术”，除非具体说明如此。另外，本章节不应解释成意指已经进行检索或不存在如37 CFR§1.56(a)中所定义的其它相关信息。
发明内容
为了满足上述的长期存在但尚未解决的需求，本发明的至少一个实施例是针对一种预测水处理系统中的微生物所致问题的方法。所述方法包含以下步骤：在所述系统的至少一部分中测量整体微生物群体；测量微生物群体的至少一种亚群相对于所述整体微生物群体的量；确定微生物的至少一种亚群的所述量是否超过阈值，所述阈值是预定的以下量中的至少一个：所述微生物亚群的绝对量、所述微生物亚群的相对量和其任何组合；以及任选地实施生物控制程序以减除微生物的所述至少一种亚群的存在。
所述微生物亚群可以包含丝状细菌。所述微生物亚群可以包含水绵属(Spirogyra)、刚毛藻属(Cladophora)、黑孢藻属(Pithophora)、管枝藻目黑孢藻属黑孢藻属(O.Siphonocladales pithophora pithophora)、海滨石莼杆菌(Ulvibacterlitoralis)、海参崴蛋黄色杆菌(Vetellibacter vladivostokensis)、有毒威克斯氏菌(Weeksella virosa)、梭杆菌属(Fucobacter)、冰冷杆菌属(Gelidbacter)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、科汉比纳立默氏菌(Riemerella cohambina)、冷丝状黄杆菌(Flavobacterium psychrofilum)、琥珀酸噬细胞菌(Ctyophaga succinicans)、费拉迪杆菌属(Vladibacter)、鼻疽杆菌属(Pfeifferella)、水生芽孢杆菌(Bacillusaquatilllis)、海洋屈挠杆菌(Flexibacter marinus)、气味黄杆菌(Flavobacteriumodoratum)、微颤蓝细菌属(Microscilla)、柔发菌属(Flexithrix)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、整形杆菌属(Taxeobacter)、生孢噬纤维菌属(Sporocytophaga)、腐败螺旋菌属(Saprospira)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、薄层菌属(Hymenobacter)和其任何组合。所述阈值可以是，所述微生物亚群经测量为所述整体微生物群体的至少5-90％的量。
所述至少一个测量可以通过选自由以下组成的清单的一种方法获取：链终止测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、数字聚合酶链反应、基于DNA的分析、离子激流半导体测序、MALDI、MALDI-TOF、质谱分析、PCR分析、焦磷酸测序、qPCR分析、通过寡核苷酸连接和检测来进行测序、合成测序、与一种或多种微生物相关的抗体的测量、与一种或多种微生物相关的激素的测量、与一种或多种微生物相关的分泌物的测量、与一种或多种微生物相关的蛋白质的测量、与一种或多种微生物相关的有机分子的测量、与一种或多种微生物相关的分子的测量、荧光噬菌体、细胞分选器和其任何组合。
所述方法可以进一步包含鉴别可产生微生物群体的所述至少一种亚群的输入源。输入源可以是来自选自由以下组成的群组的一种来源的进料水、原料、纤维或染料：城市用水、自来水、池水、海水、湖水、过滤水、脱盐水、循环水、废水、蒸馏水、冷凝锅炉水、冷却水、二氧化钛、粘土、处理添加剂、聚合物、染料、光学增亮剂和其任何组合。
所述方法可以进一步包含以下步骤：鉴别所述微生物亚群所来自的水源，和仅在从所述微生物群体所来自的所述水源引入水之后并且不迟于1周实施生物控制程序以减除微生物的所述至少一种亚群的存在。
所述水处理系统可以是选自由以下组成的群组的一种事项的一个或多个阶段：造纸、冷却水、锅炉水、食品制造、饮料制造、矿石加工、氧化铝加工、生物柴油制造、蒸馏、石油化学精炼、石油化学合成、聚合物合成、塑料制造、废水处理、洗衣、器皿洗涤、水处理、固液分离和其任何组合。所述方法可以进一步包含以下步骤：将所述鉴别的生物体记录成可以存储和/或传输的格式。
所述方法可以进一步包含以下步骤：执行与减除所述鉴别的生物体相关的杀生物方案。所述方法可以进一步包含从所述处理系统的样品产品获取至少一个测量。所述样品可能如此干燥使得其上存在极少或不存在活的生物体。
其它特征和优势描述于本文中，并且根据以下具体实施方式将显而易见。
附图说明
下文具体参考图式描述了具体实施方式，其中：
图1示出了对来自不具有毡渗透问题的造纸机器的毡(PM2引纸毡)和来自具有毡渗透问题的机器的毡样品(PM1引纸毡)的qPCR分析的饼图。
图2示出了如通过qPCR测定的毡织物中的细菌随时间推移的相对丰度的饼图。饼图上的数值表示样品的总细菌负荷。
图3是示出在方案优化之前(第1月)和期间(第2-7月)机器上的毡织物寿命(以天为单位)的图。
出于本公开的目的，除非另外指示，否则图中的类似参考编号应指类似特征。图式仅是本发明的原理的范例并且不意图使本发明限于所说明的特定实施例。
具体实施方式
定义
提供以下定义以确定如何理解本申请中所用的术语，并且尤其是如何理解权利要求书。定义的组织是仅为方便起见并且并不意图将定义中的任一项限于任何特定类别。
“链终止测序”意指需要终止DNA链延伸的单链DNA模板、DNA引物、aDNA聚合酶、正常脱氧核苷三磷酸(dNTP)和修饰的核苷酸(双脱氧NTP)的方法。这些链终止核苷酸不具有在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键所需的3′-OH基，当并有ddNTP时导致DNA聚合酶停止DNA延伸。ddNTP可以经放射性或荧光标记以用于在自动化测序机器中进行检测。在一些情况下，链终止测序可以包括合成与单链模板互补的新DNA链(步骤I)。向模板DNA供应所有四种脱氧核苷酸、四种双脱氧核苷酸(各自用不同颜色荧光标签标记)和DNA聚合酶的混合物(步骤II)。因为存在所有四种脱氧核苷酸，所以链延伸继续进行，直到DNA聚合酶碰巧插入双脱氧核苷酸。结果是一组新的都具有不同长度的DNA链(步骤III)。然后使用凝胶电泳以尺寸分离各片段(步骤IV)。在每个经标记的DNA片段在凝胶的底部通过检测器时，记录颜色。然后由表示每个核苷酸序列的颜色图案重构建DNA序列(步骤V)。
“缺陷”意指与工业工艺或处理流相关的事项的不想要的属性，在造纸工艺的情况下，其包括(但不限于)毡上的一个或多个堵塞，以及纸张的例如孔洞、褪色、条痕、斑点、半透明斑点和其任何组合的属性。
“变性梯度凝胶电泳(DGGE)”意指当样品在丙烯酰胺凝胶上移动时使用化学梯度使样品变性的电泳形式。DGGE可以应用于核酸(例如DNA和RNA)，因此使得用户可评估存在于样品中的不同DNA/RNA序列的数目。代表性实例可以见于以下科学论文中：通变对编码 16S rRNA的聚合酶链反应扩增的基因进行变性梯度凝胶电泳分析对复杂微生物群体进行 图谱分析(Profiling of Complex Microbial Populations by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Genes Coding for 16S rRNA)，G.Muyzer等人，《应用与环境微生物学(Applied andEnvironmental Microbiology)》，第59卷，第3期，第695-700页，3月(1993)。
“数字聚合酶链反应”或(数字PCR、DigitalPCR、dPCR或dePCR)意指可以用以直接定量和克隆地扩增核酸(包括DNA、cDNA或RNA)的常规聚合酶链反应方法改进。dPCR与传统PCR之间的关键差异在于测量核酸量的方法，前者是比PCR更精确的方法。PCR对单个样品执行一个反应。dPCR也在一样品内执行单个反应，但将样品分成许多个分区并且反应独立地在每个分区中进行。此分隔提供了对核酸量的更可靠收集和灵敏测量。代表性实例描述于美国专利6,143,496和科学论文数字PCR(Digital PCR)，B.Vogelstein等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，《遗传学(Genetics)》，第96卷，第9236-9241页，8月(1999)中。
“基于DNA的分析”意指分析DNA的方法，包括(但不限于)qPCR、PCR、数字PCR、离子半导体测序、焦磷酸测序、合成测序、通过连接测序、链终止测序和其任何组合。
“毡”意指充当材料传送者的由用于造纸工艺中的交织毛绒或任何其它纤维制成的带，其中交织纤维界定水或其它流体可以通过的多个腔。毡还可以在压辊之间提供缓冲并且还可以是用以从造纸材料去除水的介质。毡包括(但不限于)底毡、底板毡、圆筒纸巾湿毡、干燥毡、无端毡、引纸毡、真空引纸毡、Harper顶毡和顶毡。
“离子激流半导体测序”意指基于对在DNA聚合期间释放的氢离子的检测的DNA测序方法。这是“合成测序”方法，在此期间，基于模板链的序列构建互补链，其代表性实例在以下网站描述：
http：//www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/seauencing/ next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing- technology.html(在2013年12月23日访问)。
“MALDI”意指基质辅助激光解吸/电离，用以鉴别生物分子(生物聚合物，例如DNA、蛋白质、肽和糖)和大有机分子(例如聚合物、树枝状聚合物和其它大分子)的质谱分析形式，其通常包括通过针对样品脉冲激光使其烧蚀成气态离子状态，并且然后通过质谱分析来分析样品。使用MALDI鉴别生物体的代表性实例描述于以下科学论文中：
种系蛋白质组学：使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析对肠杆菌科进 行种属鉴别(Phyloproteomics：Species Identification of Enterobacteriaceae using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of Flight Mass Spectrometry)，G.C.Conway等人，《分子微生物学与生物技术杂志(J.Mol.Microbiol.Biotechnol.)》3：103-112，(2001)；
通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析实时鉴别阳性血培养培养液中的 细菌和假丝酵母属(Real-time identification of bacteria and Candida species in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization- time of flight mass spectrometry)，A.Ferroni等人，《临床微生物学杂志(J ClinMicrobiol.)》，48(5)，1542-1548，(2010年5月)；和
将MALDI-TOF MS应用于鉴别食源性细菌(Application of MALDI-TOF MS for the Identification of Food Borne Bacteria)，M.Pavlovic等人，《开放式微生物学杂志(Open Microbiol J.)》；7：135-141(2013)。
“质谱分析”或(MS)意指用以通过测量气相离子的质荷比和丰度鉴别存在于样品中的化学品的量和类型的分析化学技术，其更充分地描述于以下教科书中：质谱分析-基础 课程(Mass Spectrometry-A Foundation Course)，K.Downard，英国剑桥(Cambridge UK)：皇家化学学会(Royal Society of Chemistry)(2004)。
“微生物”意指小到足以使其自身潜入用于工业工艺或流(例如但不限于造纸工艺)中的设备内、邻接于所述设备、在所述设备顶部上或附接到所述设备的任何生物体，其包括(但不限于)小到使得它们无法在不借助显微镜的情况下被看见的那些生物体，可以由肉眼看见但包含多个太小以致无法由肉眼看见的个别生物体的此类小生物体的集合或群落，以及一种或多种可以由肉眼看见的生物体，其包括(但不限于)存在在一定程度上会损害水处理系统的任何生物体，其还包括(但不限于)以下教科书中描述的那些鉴别出的微生物：布洛克微生物生物学(Brock Biology of Microorganisms)(第14版)Hardcover，Michael T.Madigan等人，本杰明卡明斯出版社(Benjamin Cummings Publisher)，(2014)；和原核生物：第7卷：变形菌门：δ和ε亚类.深生根细菌(The Prokaryotes：Vol 7： Proteobacteria：Delta and Epsilon Subclasses.Deeply Rooting Bacteria)，Dworkin，M.，Falkow，S.施普林格科学与商业媒体(Springer Science and Business Media)，(2006)。
“纸产品或纸张”意指造纸工艺的传统地(但未必)包含纤维素纤维的任何形成的纤维结构最终产品。此类最终产品的实例包括(但不限于)面巾纸、卫生纸、餐巾纸、复印纸、打印纸、书写纸、笔记本纸、报纸、纸板、海报纸、证券纸、卡纸板等。
“造纸工艺”意指由纸浆制造纸产品的方法的任何部分，其包含形成水性纤维素造纸配料、沥干配料以形成纸张和干燥纸张。形成造纸配料、沥干和干燥的步骤可以按本领域的技术人员通常已知的任何常规方式进行。造纸工艺还可以包括制浆阶段，即由木质纤维素原料制造纸浆；和漂白阶段，即化学处理纸浆以使亮度提高，其还可以包括(但不限于)例如制浆、浸煮、精炼、干燥、压延、压制、起皱、脱水和漂白的步骤中的一个或多个，造纸进一步描述于以下参考文献中：纸浆和纸技术员手册(Handbook for Pulp and Paper Technologists)，第3版，Gary A.Smook，安格斯王尔德出版公司(Angus WildePublications Inc.)，(2002)；和纳尔科水处理手册(The Nalco Water Handbook)(第3版)，Daniel Flynn，麦格劳希尔(McGraw Hill)(2009)通常并且尤其在第32.1-32.44页。
“PCR分析”意指聚合酶链反应分析。
“填塞”意指定位于毡的腔内的固体、半固体、粘性和/或其它材料沉积物。堵塞可能会抑制材料流过腔，和/或可能会削弱毡的任何其它功能。
“引物”意指已知与DNA的特定部分互补并且充当合成邻接于DNA的特定部分与DNA互补的核苷酸链的起始点的物质组成，通常是短核苷酸链。
“探针”意指经构建和布置以结合到DNA的靶向部分并且当如此结合时可以容易被检测到并且因而用以指示存在或不存在DNA的靶向部分的物质组成。
“焦磷酸测序”意指基于“合成测序”原理的DNA测序方法(确定DNA中的核苷酸的顺序)。其与桑格测序(Sanger sequencing)不同之处在于，其依赖于检测核苷酸并入时的焦磷酸释放，而非用双脱氧核苷酸使链终止。所要DNA序列能够通过在并入下一互补核苷酸时发射的光测定，因为四种可能的A/T/C/G核苷酸在一次仅一种核苷酸添加并且可用，使得仅一个字母可以并入于单链模板(其是待测定的序列)上。代表性实例可以见于以下论文中：焦磷酸测序阐明了DNA测序(Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing)，MostafaRonaghi，基因组研究(Genome Research)，11：3-11(2001)，其可以见于http：// genome.cshlp.org/content/11/1/3.full.html#ref-list-1(在2013年12月23日访问)。
“qPCR分析”意指定量和/或定性聚合酶链反应分析。
“通过寡核苷酸连接和检测来进行测序”意指一次生成数亿到数十亿个小序列读数的方式。这通过以下方式实现：将未知序列的小片段连接到磁珠，然后使磁珠经历浸渍PCR。代表性实例可以见于以下网站：http：//gtc.soe.ucsc.edu/content/solid- technology-overview(在2013年12月23日访问)。和销售手册：看到差异探索品质基因组 (See the Difference Discover the Quality Genome)生命技术公司(LifeTechnologies Corporation)(2010)。
“合成测序”意指用以确定DNA中的碱基对的序列的技术，也称为DNA测序。此测序方法是基于可逆染料终止子，所述终止子在它们被引入到DNA链中时实现对单个碱基的鉴别。代表性实例可以见于以下网站：http：//nxseq.bitesizebio.com/articles/ sequencing-by-synthesis-explaining-the-illumina-sequencing-technology/和http：//www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn(在2013年12月23日访问)。
在以上定义或在本申请中其它地方陈述的说明与词典中常用或以引用方式并入本申请中的来源中所陈述的含义(明示或暗示)不一致的情况下，申请和权利要求书术语具体理解为根据本申请中的定义或说明来解释，并且不根据常见定义、词典定义或以引用方式并入的定义来解释。根据上述内容，在术语仅在其由词典解释时方可以被理解的情况下，如果所述术语是由《柯克-奥思默化学技术百科全书(Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology)》，第5版，(2005)(由约翰威利父子公司(Wiley，John&Sons，Inc.)出版)定义，那么这一定义应控制所述术语在权利要求书中应如何被定义。所有示出的化学结构还包括所有可能的立体异构体替代方案。
本发明的至少一个实施例是针对一种确定阈值的方法，在所述阈值下多样性指数的变化证明了水处理系统的生物控制的变化。如例如美国专利申请13/374,949、13/550,748和14/138,526中所描述，多样性指数是测定微生物所致缺陷或问题的潜在性的有用工具。此外，鉴别特定微生物侵染可以帮助指示可能会导致哪些类型的缺陷或问题。多样性指数依赖于鉴别指数的变化的阈值，其是此类缺陷或问题的前体。因此，确定阈值的方法存在极大效用和价值，在所述阈值下微生物被视为问题的主要原因。
在至少一个实施例中，确定多样性指数的变化是否指示潜在未来或现存问题或缺陷的方法包含：测定存在于水处理系统中的微生物多样性；测定一种/一些/每种检测的微生物相对于总群体的丰度；确定总群体的丰度是否指示微生物很可能造成缺陷或问题；确定任一种或一些微生物的相对或绝对丰度是否超过预定阈值；和任选地实施生物控制方案或程序以消除/解决微生物。
在至少一个实施例中，使用历史微生物和处理效率和品质数据鉴别出阈值，所述数据关联与生产问题相关的丰度水平和不仅仅分析的可变性。此值可以从一种处理应用到另一种处理应用变化，因为一些系统可能能够耐受较高的微生物污染水平，直到微生物对效率或产品品质造成负面影响。在至少一个实施例中，使用后续分析来证实，处理已经将群体减少到低于预定阈值，以提供与微生物生长相关的生产或品质问题不再出现的保证。
在至少一个实施例中，为了实现以上方法步骤中的一个或多个，使用来自以下参考文献中任一篇、一些或全部的一种或多种方法、组合物和装置：美国专利申请：13/289,547、13/374,949、13/550,748、14/138,526，美国专利：8,613,837、7,018,793、6,849,395、6,054,267，美国公开的专利申请：2002/0031771、2013/0186582，以及国际专利文件：WO2008/061193 A2、WO 2007/024295 A2、WO 2004/046375 A2和WO 2004/042082 A1。
在至少一个实施例中，所述方法包括以下步骤：测量丝状细菌/微生物相对于整体微生物群体的量的多达5％与多达90％或更大之间的升高。在至少一个实施例中，所述方法包括以下步骤：测量至少一种选自由以下组成的清单的生物体相对于整体微生物群体的量的在5-90％之间的升高：水绵属、刚毛藻属、黑孢藻属、管枝藻目黑孢藻属黑孢藻属、海滨石莼杆菌、海参崴蛋黄色杆菌、有毒威克斯氏菌、梭杆菌属、冰冷杆菌属、鼻气管鸟杆菌、科汉比纳立默氏菌、冷丝状黄杆菌、琥珀酸噬细胞菌、费拉迪杆菌属、鼻疽杆菌属、水生芽孢杆菌、海洋屈挠杆菌、气味黄杆菌、微颤蓝细菌属、柔发菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、整形杆菌属、生孢噬纤维菌属、腐败螺旋菌属、金黄杆菌属、薄层菌属和其任何组合。在至少一个实施例中，所述方法包括以下步骤：测量至少一种生物体相对于整体微生物群体的量的在5-90％之间的升高，所述生物体是以下教科书中描述或提及的生物体之一：原核生物：第7卷： 变形菌门：δ和ε亚类.深生根细菌，Dworkin，M.，Falkow，S.施普林格科学与商业媒体，(2006)。
在至少一个实施例中，多样性指数的变化用以鉴别哪些工艺输入是问题或缺陷的潜在或实际原因。此类工艺输入包括(但不限于)水源、材料源和特定设备部件。举例来说，处理水系统包括可以包括(但不限于)以下中的一种或多种的多个新的和/或循环的水源：池水、海水、湖水、过滤水、脱盐水、循环水、废水、蒸馏水、冷凝水、冷凝锅炉水、冷却水和其任何组合。另外，处理系统可以在其中引入有一种或多种原料或经部分处理的材料。此外有时，一个或多个设备部件或管线/流线用于或不用于既定操作，或其特定表面与处理对象接触或不接触。如果特定问题是来自那些工艺输入中的仅一种或一些的生物体的结果，那么当那些工艺输入正被使用时仅使用生物控制过程、或向被污染的输入靶向处理和/或添加额外处理将是高效的。此外，相较于等到如此多的问题生物体积聚/繁殖以致实际上造成缺陷或问题，在超过阈值时实施生物控制更为高效。
在至少一个实施例中，使用数据测量多样性指数中的一些或全部的方法使用以下方法中的一种或多种：链终止测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、数字聚合酶链反应、基于DNA的分析、离子激流半导体测序、MALDI、MALDI-TOF、质谱分析、PCR分析、焦磷酸测序、qPCR分析、通过寡核苷酸连接和检测来进行测序、合成测序、与一种或多种微生物相关的抗体的测量、与一种或多种微生物相关的激素的测量、与一种或多种微生物相关的分泌物的测量、与一种或多种微生物相关的蛋白质的测量、与一种或多种微生物相关的有机分子的测量、与一种或多种微生物相关的分子的测量、荧光噬菌体、细胞分选器和其任何组合。
在至少一个实施例中，处理水系统可以是(但不限于)以下事项中的一种或多种的一个或多个处理阶段：造纸、冷却水、锅炉水、食品制造、饮料制造、矿石加工、氧化铝加工、生物柴油制造、蒸馏、石油化学精炼、石油化学合成、聚合物合成、塑料制造、废水处理、洗衣、器皿洗涤、水处理、固液分离和其任何组合。
在至少一个实施例中，所述方法可以应用于检测从制造系统获取的多种样品中的微生物。这些样品包括设备表面上的沉积物、水或流体样品、和/或工艺的中间或最终阶段产品的整个片件或部分片段。其可以分析产品样品中的缺陷或产品样品整体。
在至少一个实施例中，提供了一种针对位于制造工艺的中间或最终产品中的微生物的高度灵敏并且快速的检测方法。所述方法包括分析存在于样品提取物中的材料。这些样品可以经充分干燥并且可以含有极少或不含有活的污染性微生物样品。一些利用DNA分析的现有技术方法包括WO 2005/042082，其描述了利用探针确定存在或不存在微生物的原位方法。然而，原位方法不适用于纸张或纸毡，因为它们在被取样时干透了。此外，原位方法包括在微生物的细胞分裂期间应用探针，这对于上面有极少或没有活生物体的纸张或纸毡是不可能的。在至少一个实施例中，基于DNA的分析包括使用探针。
在至少一个实施例中，基于DNA的分析包括使用PCR引物检测存在或不存在微生物。美国专利5,928,875描述了使用PCR引物检测存在或不存在孢子形成细菌。在至少一个实施例中，引物靶向DNA链的在一组生物体之中高度保守的一部分。因此，侦测存在DNA的所述特定部分是存在特定生物体的确定证据。PCR分析在分析样品时特别有用，因为所述样品不具有用于传统平板接种方法或ATP测量的存活生物体，所以难以正确鉴别其污染性微生物。
在至少一个实施例中，PCR分析包括利用以下论文中所描述的方法中的一种或多种：用热稳定DNA聚合酶使DNA进行引物定向的酶扩增(Primer Directed EnzymaticAmplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase)，Randall Saiki等人，《科学(Science)》，第239卷，第487-491页(1988)。在至少一个实施例中，PCR分析包括利用以下论文中所描述的方法中的一种或多种：在体外经由聚合酶催化的链反应的特异性DNA合成(Specific Synthesis of DNA in Vitro via a Polymerase-Catalyzed ChainReaction)，Kary Mullis等人，《酶学方法(Methods In Enzymology)》，第155卷，第335-350页(1987)。
在至少一个实施例中，PCR分析是如贸易手册qPCR指南(Trade Brochure qPCRguide)，Jo Vandesompele作序(在2012年1月19日从网站http：//www.eurogentec.com/file-browser.html下载)中所描述的qPCR分析。在至少一个实施例中，所述方法是定量qPCR分析。在至少一个实施例中，所述方法是定性qPCR分析。
如至少一个实施例中所说明，在使用可商购的任何DNA提取试剂盒从样品提取DNA后，可以使用PCR方法(例如定量PCR方法)对其进行实时分析。定量PCR利用与PCR相同的方法，但其包括实时定量组分。在此技术中，基于生物体的身份或特定基因的功能，使用引物靶向所关注的DNA序列。可以使用某一形式的检测(例如荧光)检测所得DNA或‘DNA扩增子’。荧光的变化与靶DNA的数量的变化成正比。将达到预定荧光阈值所需的循环数与对应于特异性DNA标靶的标准相比较。标准通常是纯的并且在间隔若干数量级(log)的浓度下具有已知数量的靶基因。使用标准曲线计算存在于样品中的靶DNA的拷贝数。然后将每一样品的拷贝数用以确定每一样品的细胞数目。
在至少一个实施例中，使用利用保守方法靶向来自细菌的DNA序列以定量总细菌的引物集。在至少一个实施例中，使用靶向原生生物膜形成细菌(包括亚栖热菌属(Meiothermus)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)和异常球菌属(Deinococcus))的引物集。在至少一个实施例中，使用引物集靶向属于鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceafamily)细菌的适应性生物膜形成剂。在至少一个实施例中，与其它生物膜和浮游微生物相比，适应性生物膜形成剂对基于氧化剂的生物控制方案展现出更高的耐受性。在至少一个实施例中，使用引物来区别真菌与细菌侵染。
在至少一个实施例中，处理系统包括进出含有各种微生物的喷淋流和液体盆的材料，可以容易从所述材料获得活样品。然而，处理系统有时是动态环境，包括(但不限于)例如在干湿条件之间转变的变化，使空气和液体快速通过，并且在pH、温度、盐度、光、流变性、粘度、疏水性、亲水性和形状/定向(例如弯曲、挠曲、卷起等)方面具有急剧变化，和其任何组合。因此，在处理流中的既定点栖息于样品的生物体群体可能不同于存在于水源或应用装置(例如喷淋流和液体盆)内的生物体。因此，典型的对喷淋流和液体盆的分析将无法正确鉴别什么微生物存在于样品内。然而，对考虑了已知能够栖息于那些环境的生物体类型的样品的分析使得可对样品污染真正进行准确分析。
在至少一个实施例中，所述方法包括在类别等级(例如域等级)下区别微生物。可以根据以下三种域之一对生物生命分类：古细菌、细菌和真核生物。类似地，所述方法包括在生物界等级的类别下区别微生物。可以根据以下五种界对生物生命分类：原核生物、原生生物、植物、动物和真菌。这些不同类别中的生物体具有非常不同的DNA，并且聚焦于在那些区别之一下鉴别生物体DNA的方案比更具体的测定要简单得多。因为对于样品，来自各类别的生物体常常不同地经最佳处理，所以此类简单形式的鉴别可以用以准确地鉴别最佳靶向特定污染物的特定方案。
在至少一个实施例中，使用多于一种引物鉴别具有多于一种可独特地识别的核苷酸序列的生物体。在至少一个实施例中，使用PCR分析检测与对于特定生物体唯一或几乎唯一的酶相关的基因组序列。
在至少一个实施例中，所述方法包括检测缺陷，并且然后利用PCR分析正确地关联缺陷的来源。在至少一个实施例中，所述方法确定缺陷是完全基于生物的、完全基于非生物化学品的还是由基于非生物化学品、机械和生物的来源的组合产生。
在至少一个实施例中，样品中的缺陷是以下中的一种或多种：孔洞；孔洞并且在孔洞的至少一部分周围有褪色晕圈；褪色条痕；斑点；半透明斑点；和其任何组合。
在至少一个实施例中，阈值水平是用以酌减假阳性的方法。PCR分析有时检测虽然存在但不造成特定缺陷的痕量生物体。在至少一个实施例中，所述方法包括酌减以低于对于一种或多种特定生物体所已知的预定水平的浓度检测到的任何生物体的存在。在至少一个实施例中，所述方法包括酌减以低于104个细胞/克(缺陷)的水平检测到的任何生物体的存在。在至少一个实施例中，所述方法包括酌减以低于104个细胞/ml的水平检测到的任何生物体的存在。
在至少一个实施例中，使用分析结果，通过确定一种或多种杀生物组合物添加到水处理系统内的一个或多个位置这一行动的程度、种类和频率，强化生物控制方案。
在至少一个实施例中，所述方法能够检测通过现有技术方法另外无法检测到的微生物。举例来说，在污垢物由厌氧或硫酸盐还原性生物体侵染造成的情况下，例如ORP检测的方法将无法正确地将污垢物来源鉴别为生物的并且因此将不当地建议应用化学品而非抗生物方法。然而，利用DNA方法将始终正确指示生物侵染，因为所有生命都含有DNA。
在至少一个实施例中，使用评估微生物多样性的方法。所述方法可以基于对样品提取物中的核酸的分析。更具体来说，其利用PCR(例如但不限于qPCR)检测总生物体，例如细菌；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)；赤杆菌属(Erythrobacter)；假单胞菌属(Pseudomonas)；伯克霍尔德菌属(Burkholderia)；束缚杆菌属(Haliscomenobacter)；腐败螺旋菌属；施莱格尔氏菌属(Schlegelella)；纤毛菌属(Leptothrix)；球衣菌属(Sphaerotilus)；芽孢杆菌属(Bacillus)；厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)；噬细胞菌属-黄杆菌属-拟杆菌属门(Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides phylum)的成员；绿色非硫细菌，包括滑柱菌属(Herpetosiphon)，异常球菌属-栖热菌属门(Deinococcus-Thermusphylum)的成员，包括亚栖热菌属；产过氧化氢酶的细菌、产淀粉酶的细菌、产尿素酶的细菌、真菌等。这些技术利用允许检测和定量基于保守序列的靶生物体的引物和标准配对。引物靶向微生物基因组中的通过演化而高度保守的区，而特定门或属的引物靶向基因组的更多可变区。
能够准确地定量存在于样品中的所关注生物体使得有可能以样品中总细菌负荷的百分比表达所述生物体。考虑到可以检测到许多生物体，可以确定样品中的微生物群体的多样性的快照。此快照称为多样性指数。多样性指数还可以定量地表达为若干靶生物体的相对丰度。可以在机器或工艺良好运行时测量工艺的任何部分的多样性指数，因此产生基线。然后可以将在机器或工艺性能不良时测量的多样性指数与基线相比较，以寻找微生物群体的波动和确定哪些细菌群造成了工艺中的问题。还可以对多样性指数进行定量，以便于使用Shannon多样性指数计算的比较以比较各样品位置之中的监测数据或相对于基线进行比较。然后可以相应地改变处理策略和进料点以对抗所述问题。
基于DNA定量的多样性指数测量了工艺中生物体的存在和多样性，不依赖于其存活力。核糖核酸(RNA)、尤其信使RNA(mRNA)是仅由活生物体产生的分子，并且其性质使得取决于标靶对于细菌的特定门或属是唯一的。通过使对于以上列出的生物体唯一的mRNA序列扩增，变得可能确定哪些细菌以其存活形式存在。然后可以使用对存活生物体的准确检测作为评估对处理水进行的处理策略的功效的工具。这可以通过比较多样性指数与存活力指数而实现。
此方法将定量存在于处理样品中的活细菌的量和类型。可以应用定量(实时)聚合酶链反应方法检测信使核糖体核酸(mRNA)。mRNA是传送到核糖体以在被称为翻译的过程中充当蛋白质合成的蓝图的转录DNA。mRNA仅由活细胞产生。可以使用可商购的试剂盒分离来自活细胞的RNA。mRNA检测在定量聚合酶链反应中需要一额外步骤。添加反转录酶到反应混合物中以使mRNA转录成其互补DNA(cDNA)。此实验需要两组引物。第一组靶向特异性mRNA，而第二组用以使通过反转录酶反应产生的所得cDNA扩增。
实例
可以通过参考以下实例更好地理解前述内容，所述实例是出于说明目的而呈现并且不意图限制本发明的范围。具体来说，所述实例展现了本发明固有的原理的代表性实例，并且这些原理并不严格地限于这些实例中所叙述的特定状况。因此，应理解，本发明涵盖对本文所描述的实例进行的各种改变和修改，并且此类改变和修改可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下并且在不消除其预期优势的情况下作出。因此，预期此类改变和修改由所附权利要求书涵盖。
阈值确定实例
未经涂布的不含机械木浆的纸(freesheet)工厂在其一个造纸机器上遭受毡渗透问题。毡织物在工厂的一个机器上的渗透比在其它两个机器上以显著更大的速率降低。用尽了解决此问题的所有化学手段，并且工厂开始将微生物污染视为潜在问题。然而，察觉到工厂的生物控制方案良好运行，因为细菌计数低、ATP测量值低并且在机器表面上不具有粘泥沉积。
为了解决此问题，使用qPCR将来自未受影响的机器的毡样品与来自受影响机器的毡样品相比较(图1)。虽然两个毡含有相同量的总细菌(约107个细胞/g)，但立即看出来：有问题的毡的细菌群体主要是单组生物体：适应性生物膜形成剂。这些细菌少量存在于另一毡上。
在发现生长于毡中的主要细菌群体之后，改变毡清洁化学品。在后续停工期期间重新分析织物。观察到，适应性生物膜形成剂群体减少到总群体的25％，整体细菌负荷保持未改变(图2)。
基于这些数据，添加据展示针对适应性生物膜形成剂具有良好功效的第二化学品到毡洗涤方案中。在此第二化学过程调节之后，在停工期期间重新分析毡。DNA结果显示，总细菌负荷保持未改变，而适应性生物膜形成剂减少到总群体的约10％(图2)。在接下来的四个月使新化学过程组合在机器上运行。经过这些月，适应性生物膜形成剂群体在此机器上从毡织物消除。这组细菌的消除导致毡的脱水效率提高，并且使织物的寿命延长4天(图3)。
虽然本发明可以用多种不同形式实施，但本文中详细描述了本发明的特定优选实施例。本公开是本发明的原理的范例并且不意图使本发明限于所说明的特定实施例。本文中提及的所有专利、专利申请、科学论文和任何其它参考的材料都以全文引用的方式并入。此外，本发明涵盖本文中提及、本文中描述和/或本文中并入的各种实施例中的一些或全部的任何可能组合。另外，本发明涵盖还具体排除了本文中提及、本文中描述和/或本文中并入的各种实施例中的一些或全部的任何可能组合。
以上公开内容意图是说明性并且不是穷尽性的。本说明书将使本领域一般技术人员能想到多种变型和替代方案。所有这些替代方案和变型都意图包括在权利要求书的范围内，其中术语“包含”意指“包括(但不限于)”。熟悉本领域的人员可以认识到本文所描述的特定实施例的其它等效物，所述等效物也意图由与权利要求书涵盖。
本文中公开的所有范围和参数应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围，以及端点之间的每个数字。举例来说，所陈述的范围“1到10”应视为包括最小值1与最大值10之间的任何和所有子范围(并且包括最小值1和最大值10)；也就是说，所有子范围从最小值1或更大的值开始(例如1到6.1)，并且以最大值10或更小的值结束(例如2.3到9.4、3到8、4到7)，并且每个数值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10包含在所述范围内。除非另外规定，否则本文中的所有百分比、比率和比例是按重量计。
这完成了对本发明的优选和替代性实施例的说明。本领域的技术人员可以认识到本文所描述的特定实施例的其它等效物，所述等效物意图由随附的权利要求书涵盖。

Claims (15)

1.一种预测水处理系统中的微生物所致问题的方法，所述方法包含：
在所述系统的至少一部分中测量整体微生物群体；
测量微生物群体的至少一种亚群相对于所述整体微生物群体的量；
确定微生物的至少一种亚群的所述量是否超过阈值，所述阈值是预定的以下量中的至少一个：所述微生物亚群的绝对量、所述微生物亚群的相对量和其任何组合；以及
任选地实施生物控制程序以减除微生物的所述至少一种亚群的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物亚群包含丝状细菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物亚群包含水绵属(Spirogyra)、刚毛藻属(Cladophora)、黑孢藻属(Pithophora)、管枝藻目黑孢藻属黑孢藻属(O.Siphonocladales pithophora pithophora)、海滨石莼杆菌(Ulvibacter litoralis)、海参崴蛋黄色杆菌(Vetellibacter vladivostokensis)、有毒威克斯氏菌(Weeksellavirosa)、梭杆菌属(Fucobacter)、冰冷杆菌属(Gelidbacter)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、科汉比纳立默氏菌(Riemerella cohambina)、冷丝状黄杆菌(Flavobacterium psychrofilum)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、束缚杆菌属(Haliscomenobacter)、球衣菌属(Sphaerotilus)、琥珀酸噬细胞菌(Ctyophagasuccinicans)、费拉迪杆菌属(Vladibacter)、鼻疽杆菌属(Pfeifferella)、水生芽孢杆菌(Bacillus aquatilllis)、海洋屈挠杆菌(Flexibacter marinus)、气味黄杆菌(Flavobacterium odoratum)、微颤蓝细菌属(Microscilla)、柔发菌属(Flexithrix)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、整形杆菌属(Taxeobacter)、生孢噬纤维菌属(Sporocytophaga)、腐败螺旋菌属(Saprospira)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、薄层菌属(Hymenobacter)和其任何组合。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述阈值是所述整体微生物群体的至少5-90％的量的所述微生物亚群。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中至少一个测量通过选自由以下组成的清单的一种方法获取：链终止测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、数字聚合酶链反应、基于DNA的分析、离子激流半导体测序、MALDI、MALDI-TOF、质谱分析、PCR分析、焦磷酸测序、qPCR分析、通过寡核苷酸连接和检测来进行测序、合成测序、与一种或多种微生物相关的抗体的测量、与一种或多种微生物相关的激素的测量、与一种或多种微生物相关的分泌物的测量、与一种或多种微生物相关的蛋白质的测量、与一种或多种微生物相关的有机分子的测量、与一种或多种微生物相关的分子的测量、荧光噬菌体、细胞分选器和其任何组合。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含鉴别可产生微生物群体的所述至少一种亚群的输入源。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述水处理系统包含来自选自由以下组成的群组的一种来源的进料水：城市用水、自来水、池水、海水、湖水、过滤水、脱盐水、循环水、废水、蒸馏水、冷凝锅炉水、冷却水和其任何组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包含鉴别所述微生物亚群所来自的水源，和仅在从所述微生物群体所来自的所述水源引入水之后并且不迟于1周实施生物控制程序以减除微生物的所述至少一种亚群的存在。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述水处理系统是选自由以下组成的群组的一种事项的一个或多个阶段：造纸、冷却水、锅炉水、食品制造、饮料制造、矿石加工、氧化铝加工、生物柴油制造、蒸馏、石油化学精炼、石油化学合成、聚合物合成、塑料制造、废水处理、洗衣、器皿洗涤、水处理、固液分离和其任何组合。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其进一步包含将所述鉴别的生物体记录成可以存储和/或传输的格式。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其进一步包含执行与减除所述鉴别的生物体相关的杀生物方案。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中至少一个测量从所述处理系统的样品产品获取。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述样品如此干燥使得其上存在极少或不存在活的生物体。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法，其中所述微生物亚群包含生物膜形成剂。
15.根据权利要求6所述的方法，其进一步包含鉴别原料、产品中间物或添加到所述微生物亚群所来自的所述系统中的处理添加剂，和仅在引入所述微生物亚群的此来源之后并且不迟于1周实施生物控制程序以减除微生物的所述至少一种亚群的存在。
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