CN101815794A - 微生物检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于检测地理位置(1)中烃沉积物(2)的存在的方法。所述方法包括下列步骤：检测编码能够代谢烃的蛋白质的靶标多核苷酸在所述位置的存在，其中所述靶标多核苷酸的存在指示烃沉积物的存在；确定在所述位置处的所述靶标多核苷酸的浓度；和确定与细菌在所述位置处的浓度有关的值，并且计算所述靶标多核苷酸对于所述值的比率。

Description

微生物检测方法
本发明涉及用于检测烃沉积物的存在的方法，并且更具体而言，涉及检测地理位置中的天然存在的烃沉积物的方法。
对于化石燃料增加的需要产生正在进行的需要，所述需要是发现可以工业提取的新的天然存在的油气沉积物。存在许多探查油气的已知方法，诸如通过分析推测含有烃沉积物的位置的地质学。例如，可以使用重力或磁性勘探，或对于特别有希望的位置，可以进行地震勘探。
还已知的是，显著的烃沉积物可以产生可见的表面特征诸如油和天然气渗出。然而，即使这种渗出不是可见的，也可以通过以其它方式检测渗出而探查烃沉积物。例如，WO-A-91/02086报道了油气沉积物的检测，其通过从潜在含有烃沉积物的位置取土壤样品进行。该方法基于下列理论，即能够代谢烃的微生物，特别是细菌，在存在表面下烃气体的区域中具有选择优势。因此，这种微生物的浓度高于位于石油或气体沉积物上的土壤样品中的平均值。
在该方法中，将从一个位置获得的第一份土壤样品暴露于烃气体诸如乙烷，并且在预定长度的时间范围内测量由烃气体的代谢得到的代谢物的量。这提供土壤样品内的微生物活性的指标，所述微生物能够代谢烃气体。第二份土壤样品暴露于一种基质，诸如葡萄糖，其可以一般地被所有细菌代谢，并且也测量其代谢物的生产。这提供土壤样品中总微生物群体的指标。计算能够代谢烃的微生物群对于总微生物群的比率，以提供能够代谢烃的微生物的存在的标准化指标。高指标的检测指示烃沉积物在所述位置的存在。而且，可以在跨越一个位置的不同地点取多份样品并且在每一地点确定所述指标。然后可以将跨越所述位置的指标变化做出图以指示所述位置内的沉积物存在。
WO-A-91/02086还报道将每一地点的所述指标与游离烃气体浓度组合，以便限定到达表面的剧烈的和连续的烃流动的更明显区域。
在WO-A-91/02086中报道的油气勘探方法的问题是，在实践中，它被许多技术困难所困扰。例如，在许多情况下，贮藏潜在烃沉积物的位置是非常远的，因此在从一个位置获得土壤样品和在实验室条件下分析所述样品之间通常有一些时间。在这时段期间，由于所述微生物从它们的烃源分离，所以烃代谢微生物数目对比微生物的总数目的比率将趋向于下降。因而该方法可以趋向于得到错误结果。另一个问题是，检测过程需要提供放射性烃同位素诸如碳14，以便(同位素的)代谢产物可以被检测并且区别于其它代谢过程的产物。然而，放射性同位素需要仔细的储存，操作和处理。而且，烃同位素的供应可能容易地被破坏微生物正常代谢的化合物污染，导致不正确的结果。
US2002/0065609A1报道了一种不同的矿物勘探方法。它公开了涉及微生物群的小亚基核糖体DNA(rDNA)序列的序列的微生物群的分析。假设，细菌的16S rDNA序列的特异性多态性可能与样品参数诸如细菌群的地理位置相关联。如果样品参数是烃沉积物在地理位置的存在，则含有多态性的细菌在地理位置的存在指示烃沉积物在所述地理位置的存在。就是说，特异性的16S rDNA多态性是适于在烃沉积物周围生存的细菌的推定标记物。
然而，US2002/0065609A1中报道的方法存在问题。16S rDNA基因仅编码16S亚基rRNA。虽然所述基因在分类组之间是高度保守的，但是它本身不与微生物在具有高于平均浓度的游离烃气体的环境中生存和繁殖的能力相关。因此，因为在假定的标记物和环境生存特性之间没有直接联系，所以预期该方法不是非常可靠的。
WO2005/103284涉及多靶向微生物筛选和监测方法。它涉及对于微生物标记物的存在/不存在的测试，所述微生物标记物被‘靶标’和‘指标(index)’微生物共享。指标微生物与靶标微生物在遗传学上是不同的，但是在同等条件下以类似方式表现。结果用来计算合计指标值。当检测的标记物数目不足以显示靶标微生物的存在时，指标值是有用的。可以计算阈值指标值，并且如果指标值在所述阈值之上，则它指示靶标微生物的存在。
在WO03/012390中提供了另一种检测烃的方法。它公开了使用微阵列以分析样品存在烃并且平行地执行多个测试。使用的探针特异性地结合与烃关联的靶标分析物。
然而，经由WO2005/103284和WO03/012390的方法获得的结果不区分在细菌群中检测到的靶标/烃代谢基因数目的增加的可能原因，即，它们不显示检测到的增加是否是由于通常对全部细菌是有利的条件的改变所引起，或它是否是由仅对于烃代谢细菌有利的条件变化所引起。
本发明寻求减轻上述问题的一个或多个。
根据本发明的一个方面，提供用于检测地理位置中烃沉积物存在的方法，所述方法包括：检测编码能够代谢烃的蛋白质的靶标多核苷酸在所述位置的存在，其中所述靶标多核苷酸的存在指示烃沉积物的存在。
所述方法包括分析预先获得的样品(例如运输到不同的位置)以及原位分析。
根据本发明的另一个方面，提供用于检测地理位置中烃沉积物存在的方法，所述方法包括：在从所述位置获得的土壤样品中，检测编码能够代谢烃的蛋白质的靶标多核苷酸在所述样品中的存在，其中所述靶标多核苷酸的存在指示烃沉积物的存在。
根据本发明的另一个方面，提供检测烃沉积物在地理位置中的存在的方法，所述方法包括下列步骤：
检测编码能够代谢烃的蛋白质的靶标多核苷酸在所述位置的存在；
确定所述靶标多核苷酸在所述位置的浓度；和
确定与在所述位置的微生物诸如细菌的浓度有关的值，并且计算所述靶标多核苷酸的浓度对于所述值的比率，所述比率指示烃沉积物的存在或不存在。
在一些实施方案中，所述方法涉及所述靶标多核苷酸的仅一个片段的检测，所述片段识别所述靶标多核苷酸。即，本发明涉及检测所述靶标多核苷酸的至少一个片段的存在。所述片段可以是至少10，15，20，30或50个核苷酸长。
优选地，所述烃沉积物是天然存在的烃沉积物。
便利地，所述方法还包括确定所述靶标多核苷酸在所述位置的浓度。
优选地，所述方法还包括确定与所述位置的微生物诸如细菌的浓度有关的值，并且计算所述靶标多核苷酸浓度对于所述值的比率。
有利地，确定与所述位置的细菌浓度有关的值的步骤包括，确定多个不同类型细菌中存在的共有多核苷酸的浓度。
有利地，共有多核苷酸诸如小亚基rRNA的存在是使用下列确定的：包括SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：39的一种或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，分别包括SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：40或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，分别包括SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：41或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
便利地，共有多核苷酸诸如16s rRNA的存在是使用下列确定的：包括SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：42或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，分别包括SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：43或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，分别包括SEQ ID NO：38或SEQ IDNO：44或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
便利地，检测所述靶标多核苷酸存在的步骤包括，检测所述靶标多核苷酸序列的亚序列的存在。
优选地，所述亚序列包括在编码能够代谢烃的多个不同基因中存在的共有序列。
有利地，所述靶标多核苷酸是DNA。
备选地，所述靶标多核苷酸是RNA。
便利地，所述烃是C1到C20烷烃，烯烃，任选取代的单环芳烃或多环芳烃，或萘(naphthene)，优选C2到C20烷烃。
优选地，能够代谢烃的蛋白质是联苯双加氧酶，甲苯单加氧酶，烷烃羟化酶；儿茶酚2，3，双加氧酶；萘双加氧酶；甲苯双加氧酶；二甲苯单加氧酶；丁烷单加氧酶；细菌P450加氧酶；真核P450加氧酶；或烷烃脱氢酶。
便利地，能够代谢烃的蛋白质是由一个核苷酸序列限定的，所述核苷酸序列包括对于表2中提到的序列具有至少80％序列同一性的序列。优选所述序列对于表2中提到的序列具有至少90％，95％，99％或100％的序列同一性。表2提供所述序列的GenBank登记号。优选的序列是在2008年7月28日存在于GenBank数据库中的那些。
有利地，联苯双加氧酶蛋白质的存在是使用下列确定的：包括SEQ IDNO：13或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，包括SEQ ID NO：14或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，包括SEQ IDNO：15或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
便利地，儿茶酚2，3，双加氧酶蛋白质的存在是使用下列确定的：包括SEQ ID NO：1或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，包括SEQ IDNO：2或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，包括SEQID NO：3或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
优选地，萘双加氧酶蛋白质的存在是使用下列确定的：包括SEQ IDNO：4或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，包括SEQ ID NO：5或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，包括SEQ IDNO：6或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
有利地，甲苯双加氧酶蛋白质的存在是使用下列确定的：包括SEQ IDNO：7或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，包括SEQ ID NO：8或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，包括SEQ IDNO：9或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
便利地，二甲苯单加氧酶蛋白质的存在是使用下列确定的：包括SEQID NO：10或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，包括SEQ IDNO：11或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，包括SEQID NO：12或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
优选地，丁烷单加氧酶蛋白质的存在是使用下列确定的：包括SEQ IDNO：28或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，包括SEQ ID NO：29或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，包括SEQ IDNO：30或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
有利地，烷烃脱氢酶蛋白质的存在是使用下列确定的：包括SEQ IDNO：16，19，22或25，或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，分别包括SEQ ID NO：17，20，23或26，或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物，和任选地，分别包括SEQ ID NO：18，21，24或27，或对其具有至少80％同一性的序列的探针。
便利地，甲烷单加氧酶蛋白质的存在是使用下列确定的：包括SEQ IDNO：31，或对其具有至少80％同一性的序列的正向引物，分别包括SEQ IDNO：32，或对其具有至少80％同一性的序列的反向引物。
备选地，用于检测烃代谢和共有多核苷酸基因的正向引物，反向引物和探针与各自的SEQ ID NO具有80、85、90、95、99或99.5％的同一性。
在该说明书中，两个序列之间的百分比“同一性”是使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.
Figure GPA00001066761000061
Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller，和David J.Lipman(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms(间隔BLAST和PSI-BLAST：新一代的蛋白质数据库搜索程序)″，Nucleic Acids Res(核酸研究).25：3389-3402)使用默认参数确定的。特别是，BLAST算法可以使用URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/在互联网上访问。
有利地，所述靶标多核苷酸是alkB基因。
便利地，所述靶标多核苷酸的存在是使用PCR确定的。
优选地，所述靶标多核苷酸的浓度，和任选地，所述共有多核苷酸的浓度是通过定量PCR确定的。
有利地，检测靶标多核苷酸存在的步骤包括，从所述位置获得土壤样品并且检测所述靶标多核苷酸在所述土壤样品中的存在。
便利地，从表面以下10-50cm的深度获得土壤样品。
优选地，所述方法还包括在获得土壤样品以后稳定所述土壤样品中的核酸的步骤。
有利地，所述方法包括在所述地理位置的不同地点获得多份土壤样品并且在每份土壤样品上进行所述方法的步骤。
便利地，所述方法还包括下列步骤：关联所述方法在每份土壤样品上的结果，因此确定在地理位置之内的不同地点的靶标多核苷酸的存在的变化。
优选地，所述方法还包括下列步骤：确定所述靶标多核苷酸的浓度并且产生与每一地点的所述浓度有关的第一指标；确定每一地点之上的游离烃气体的浓度并且产生与每一地点的所述游离烃气体浓度有关的第二指标；和组合关于所述地理位置的每一地点的第一指标和第二指标。
在该说明书中，术语″烃″指的是包括氢和碳原子的有机化学化合物。
在该说明书中，其中蛋白质被描述为“能够代谢烃”，这指的是，所述蛋白质在体内条件之下具有促进或引起关于烃的化学反应的活性。例如，这可以通过下列方式测试，将样品烃添加到复现细胞内条件的反应介质中，并且与不存在蛋白质的对照介质比较，检测预定时间长度内的烃存在的减少。
现在将参考附图描述本发明的实施方案，其中：
图1是显示表面土壤中的游离气体浓度对比位置的图；
图2是含有表面下的烃沉积物的地理位置的示意性横截面视图；
图3是演示本发明原理的框图；
图4是显示从土壤样品的2，3，CAT测定获得的标准化数据的图；
图5是显示从土壤样品的AlkB-P1测定获得的标准化数据的图；和
图6是显示从土壤样品的XyM测定获得的标准化数据的图。
参考图1和2，将描述构成本发明基础的原理。
在地理位置1，从表面3看不到表面下的烃沉积物2。然而，烃气4从烃沉积物垂直迁移到表面3导致在表面3产生表面土壤中增加的烃气浓度异常。在一些情况下，所述异常直接在烃积累上(顶端异常)，但是在其它情况下，所述异常是围绕烃沉积物周围的晕状物(halo)形式(晕状物异常)。参考图1，显示地理位置1范围内的烃气浓度或者作为顶端异常或者作为晕状物异常。
表面土壤中烃气的存在导致能够使用烃作为营养和能源的土壤微生物群的发展。因而，土壤中这些细菌群的存在(或，精确地，升高浓度的这些细菌群的存在)指示烃气正在通过所述土壤迁移。这又指示存在下面的油气储藏。
因此，本发明涉及检测微生物特别是能够代谢烃的细菌群的存在。
微生物群的检测
在本发明的实施方案中，在烃沉积物附近的微生物群是通过检测编码能够代谢烃的蛋白质的基因的存在而被检测的。现在将参考图3描述这个概念背后存在的原理，图3显示指示烃存在和编码烃代谢蛋白质的基因表达之间的关系的框图。
在方框5开始，烃在微生物(特别是细菌)周围环境中的存在是通过微生物细胞检测的，其经由许多机理，主要是经由细胞表面的受体。烃存在的检测导致编码能够代谢烃的蛋白质的mRNA6转录水平上升。蛋白质7又在细胞之内翻译并表达。蛋白质适当氧化烃8，释放能量并且导致细胞的生长9和繁殖。细胞繁殖，导致编码烃代谢蛋白质的基因10数目在那个地点增加，即，这种基因浓度的增加。
相反，不含有编码烃代谢蛋白质的基因的微生物不代谢烃并且不受益于环境中作为能量来源的烃。因而，在烃沉积物存在的地方，总微生物群倾向有利于含有编码烃代谢蛋白质的基因的微生物。
因此，样品群中DNA的浓度倾向有利于编码烃代谢蛋白质的DNA。
在本发明具体的实施方案中，编码烃代谢蛋白质的基因浓度是变化的，不仅由于所述群中含有所述基因的细胞数目，而且由于在每个细胞内的所述基因的拷贝数。例如，含有具有这种基因的质粒的细菌细胞将在富含烃的环境中具有超过不含有这种质粒的细胞的选择优势。此外，含有多个结合这种基因的质粒的细胞对于含有仅具有单一拷贝的烃代谢蛋白质编码基因的质粒的细胞可以具有选择优势。因此，在这样的实施方案中，编码烃代谢蛋白质的基因的检测是特别灵敏的。
上述实施方案涉及编码烃代谢蛋白质的DNA的检测。然而，在一些备选实施方案中，代替地检测RNA并且特别是编码烃代谢蛋白质的mRNA分子。应当理解，mRNA转录产物在细胞之内存在相对短的时期，并且因此检测这种mRNA转录产物指示在采样时有代谢烃活性的细胞。相反，DNA基因拷贝数是一定时期内所述实施方案暴露到具体的烃的综合测量。
在本发明另外的实施方案中，比较编码烃代谢蛋白质的DNA和mRNA的相对浓度以得到烃存在于微生物群环境中的历史的指标。例如，如果发现微生物群中编码烃代谢蛋白质的DNA的浓度是平均水平，但是发现编码烃代谢蛋白质的mRNA的浓度完全在平均水平以上，则这可能是在微生物群环境中不存在下面的烃沉积物并且高浓度的mRNA转录产物的存在是由于人类介入(例如取样品的个体的工具)的指示。
标记基因
为了实施本发明的实施方案，需要鉴定被微生物代谢的烃；影响氧化过程的蛋白质；和编码所述蛋白质的基因。
原油中发现的有机化合物的数量数以千计。虽然在生热衍生气体中发现远远更少的化合物，但是它们仍然数以百计。从天然存在的表面下储藏迁移的烃不是基于它们的结构而是基于它们挥发性被分组成两个类别，即挥发物和半挥发物。在标准温度与压力条件下挥发物一般被发现为气体，而半挥发物在类似条件下一般是液体，但是可以非常容易挥发。
从天然存在的表面下储藏迁移到表面的气体的主要化学成分是甲烷。甲烷可以是地理产生的或生物产生的，并且因此如果检测到甲烷存在则存在“假阳性”结果的风险。然而，它仍然是本发明有用的标记基因。在优选实施方案中，检测C2-C20烷烃(在减少浓度的迁移气体发现更长链的链烷)。在本发明其它实施方案中，代替地检测直链烷烃和支链烷烃。在另外的实施方案中，检测链烯烃，或备选地，检测简单的和烷基化的单一多环芳香烃和饱和环(萘)。
烷烃氧化
微生物烷烃氧化的酶学是本领域众所周知的，有许多评述可以获得(参见，例如Oil&Gas Science and Technology(油气科学和技术)-Rev.IFP，第58卷(2003)第427-440页)。
直链烃是由一组被称为烷烃羟化酶的酶氧化的。这些酶将源自分子氧的氧原子引入到烷烃底物中。降解烷烃的酵母菌株含有多种属于P450超家族的烷烃羟化酶，而许多细菌含有膜结合的烷烃羟化酶体系。认为短链烷烃是被与可溶性的和微粒性的甲烷单加氧酶有关的烷烃羟化酶氧化的。
一些实施方案涉及甲烷单加氧酶的检测，例如使用引物mmoX1-mmoX2检测可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)(见表1)，如下列中所描述：Miguez等，Microbiol Ecology(微生物生态学)(1997)，33：21-31。包括基于膜结合的烷烃羟化酶(alkB)的实施方案是优选的，因为认为所述酶靶向更长链的链烷。
芳烃氧化
微生物介导的芳烃氧化的酶学也是本领域众所周知的。
大多数需氧芳烃生物降解途径通过典型地被邻位-或间位-分裂双加氧酶分裂的儿茶酚样中间体会聚。因而，儿茶酚2，3双加氧酶(C23DO)可以代表用于芳族化合物代谢的共有酶组。
芳族生物降解的单独途径通常是通过双加氧酶或单加氧酶的作用启动的。例如，联苯双加氧酶参与苯酚的氧化生物降解，而甲苯单加氧酶参与甲苯的氧化生物降解。
关于环境样品中负责芳族氧化的基因检测的报告的参考包括下列：Applied&Environmental Microbiology(应用和环境微生物学)，65，80-87(1999)；Applied&Environmental Microbiology(应用和环境微生物学)，56，254-259(1990)；Applied&Environmental Microbiology(应用和环境微生物学)，67，1542-1550(2001)；Applied&Environmental Microbiology(应用和环境微生物学)，66，80-8678-6837(2000)；和Applied&EnvironmentalMicrobiology(应用和环境微生物学)，69，3350-3358(2003)
萘
萘是饱和的单环或多环芳烃，其可以用烷基取代基修饰。
因此，本发明的优选实施方案涉及编码下列酶之一的基因检测：烷烃羟化酶(alkB相关的)；儿茶酚2，3双加氧酶；萘双加氧酶；甲苯单加氧酶；甲苯双加氧酶；二甲苯单加氧酶，或联苯双加氧酶。
其它适合的基因是编码下列酶之一的那些：丁烷单加氧酶(类似于pMMO和sMMO)；细菌P450加氧酶(C4-C16正-烷烃)；或真核P450加氧酶(C10-C16正-烷烃)。
鉴定基因
这种例举性酶和可以用于它们的鉴定的引物的更多细节提供于表1中。然而，应当理解，表1中提及的基因决不是详尽的，并且可以代替地使用其它基因。其它适合的标记基因是通过，例如，搜索公共数据库(例如GenBank和核糖体数据库计划)寻找报道的编码烃代谢蛋白质的基因而鉴定的。以这种方法鉴定了多个基因，优选的是，排列所述基因并且定位同源区域，以便识别表征编码具有该功能的蛋白质的基因的潜在基序。然后将这种潜在基序与基因数据库比较，并且排除在编码与烃代谢无关的蛋白质的基因中发现的那些潜在基序。然后将证实的基序(即，仅在编码烃代谢蛋白质的基因中发现的基序)用作本发明方法中的靶标多核苷酸。
例如，可以在GenBank中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索编码具体的分解代谢基因的一个或多个DNA序列，例如见表2，并且输入到用于操作DNA序列(诸如DS基因，www.accelrys.com)的软件中。使用在程序内提供的软件工具，比对所述序列并且进行系统发育分析。检验这些选择的下载序列并且鉴定共有区域。这些共有序列对于所得到的测定所获得的序列必须显示高比例的一致性，所述测定对于所需基因是特异性的。然后将共有序列输出到引物表达软件(Primer Express software)(www.appliedbiosystems.com)，其分析所述共有序列并且提供可被用于qPCR测定的引物/探针组合的建议。
Figure GPA00001066761000121
表2-部分或完整的编码烃代谢酶的核苷酸序列的GenBank登记号，将其每一个通过参考结合于此。
靶标                  登记号
儿茶酚2-3双加氧酶   AJ544931AJ544928AJ544927AJ544926AJ544936AJ544935AJ544937AJ544933AJ544929
萘双加氧酶   AY694167AY694169AY694170AY694172AY694166AY694168AY694165AY694171AY694164
甲苯双加氧酶   AJ512673AJ512671AJ512672
二甲苯单加氧酶   DD317812DD180886
联苯双加氧酶   DQ521945DQ521940DQ521941DQ521942DQ521939DQ521946
  丁烷单加氧酶   AY093933
儿茶酚2-3双加氧酶   AJ544931AJ544928AJ544927AJ544926AJ544936AJ544935AJ544937AJ544933AJ544929
烷烃脱氢酶-P1   AJ233397AJ833927AJ250560AY034587
烷烃脱氢酶-P2   AY286497AJ245436AJ344083
烷烃脱氢酶-R1   AJ833979AJ301875AY452488AJ301874AJ833977
烷烃脱氢酶-R2   AJ301867AJ301866AJ833985
微生物群大小标记基因
本发明的实施方案涉及确定样品中编码烃代谢蛋白质的基因浓度。然而，优选的是，参照样品中的总微生物群确定所述浓度，以便关于总微生物群给出所述基因的相对浓度的指标。存在为了确定总微生物群可以采用的多种方法，诸如测量一般底物诸如葡萄糖被样品中的微生物转化成二氧化碳；经典的平板计数；和细菌聚合物(例如肽聚糖)的定量。
然而，最快的和最优选的方法是测量存在于全部或几乎全部微生物中的共有寡核苷酸序列的存在，而不论它们的代谢烃的能力。来自细菌群的适合基因的实例提供在表3中。两个EuBac基因提供在表3中。第一个是在Suzuki等，2000，AEM，66(11)，第4605-4614页中描述的测定中提供和使用的那个。第二个是用于改进的测定，其优化在标准化测定中获得的结果。所述细菌中存在的这种共有基因通常比指示基因多103-106，并且它不受土壤中的烃存在或其它环境条件的影响。在改进的版本中，如Suzuki等中所报道，使用了相同EuBac引物序列，并且探针序列如所报道，例外是，已经使用了FAM-微小槽粘合探针，而不是FAM-TAMRA探针。另外，当改进的EuBac测定运行时，PCR热循环条件不同于Suzuki等中所描述的那些。改进的循环条件包括：在95℃10分钟，接着是40个在95℃达15秒和在57℃达1分钟的循环。
还应当注意，在一些实施方案中，通过使用在细菌菌株之间稍微变化的寡核苷酸序列的共有引物进行定量PCR测定微生物群。尽管在不同菌株的寡核苷酸序列之间的差异，但是因为所述引物是共有的，所以发生寡核苷酸序列的扩增并且指示微生物群。
应当理解，可以使用其它适合的共有核苷酸序列代替在表3中公开的那些。可以通过，例如搜寻公共数据库寻找核苷酸基序来鉴定这样的序列，所述核苷酸基序存在于高比例的微生物中，例如至少80％的微生物中。
Figure GPA00001066761000151
基因定量
在本发明的实施方案中，确定样品中编码烃代谢蛋白质的基因浓度，并且优选地，共有微生物基因浓度。用于确定这些浓度的优选技术是定量聚合酶链式反应(qPCR)，其也称为“实时PCR”。(参见，例如，Ding C等″Quantitative Analysis of Nucleic Acids-The Last Few Years ofProgress(核酸的定量分析-最近数年的进展)″J.Biochem Mol.Biol.(生物化学和分子生物学杂志)2004年1月31日；37(1)：1-10)。
qPCR依据的原理是，在PCR测定过程期间，一个PCR循环接着一个PCR循环地监控产生的扩增子数目。这通常通过将荧光团引入到测定体系中而实现。产生的荧光量与在每个PCR循环产生的扩增子数目成正比，而扩增子的数目是起始拷贝数和PCR循环数的函数。因此，通过在PCR循环进行时测量信号(例如荧光)的强度，可以测定靶标序列的起始浓度。特别是，在指数生长期期间监控PCR，其中将PCR产物量的第一次显著增加与靶标模板的初始量相关联。核酸靶标的起始拷贝数越高，观察到荧光的显著增加越快。基线值以上的荧光显著增加显示积累的PCR产物的检测(通过Ct值测量)。
PCR的绝对定量需要已知拷贝数的标准曲线，其可以使用合成的寡核苷酸或扩增子构建。该扩增子具有已知浓度，并且通过连续稀释可以得到宽范围的已知标准。然后使用与靶标DNA序列完全相同的条件，将这些标准进行PCR。然后将样品中靶标DNA序列的拷贝数从校准图或标准曲线外推，将其构建成针对Ct值绘制拷贝数的对数。
典型装置包括ABI7300序列检测器，其执行96个平行孔的qPCR分析，确定标准曲线并且计算每一样品孔中的靶标DNA的量。因而，输出是样品中的靶标序列丰度的直接测量。
虽然测定体系化学的许多变体是本领域已知的，Taqman 5′核酸酶测定或SyBr绿色体系是特别优选的。Taqman 5′核酸酶测定对于靶标序列的存在更灵敏，并且对于其更特异性，但是它在靶标基因中需要三个紧密连接的保守区域。SyBr绿色测定体系不太灵敏和特异性，但是仅需要两个保守区域的存在。
在其中测定编码烃代谢蛋白质的基因和共有基因这两者的实施方案中，两种基因浓度可以在多重qPCR反应中同时测定。在这样一种测定体系中，为两种基因提供正向和反向引物和探针，但是信号体系对于每个探针是不同的(例如，在不同波长的标记荧光)，以便可以在PCR期间独立地测定每个基因的相对量。
使用Taqman qPCR测定的共有基因序列的检测描述在芳族化合物-Applied&Environmental Microbiology(应用和环境微生物学)，69，3350-3358(2003)；和用于总微生物群的16S RNA-Applied&Environmental Microbiology(应用和环境微生物学)，69，6597-6604(2003)中。
使用SyBr绿色qPCR测定的基因序列检测公开在下列中：Environmental Microbiology(环境微生物)，6，754-759(2004)；FEMSMicrobiology Ecology(FEMS微生物学生态学)，41，141-150(2002)；和Environmental Microbiology(环境微生物学)，1，307-317(1999)。
土壤样品稳定化
应当理解，在正常情况下，一旦已经将土壤样品从它的最初地理位置取出，土壤样品的微生物群将随时间而改变。更具体而言，如果土壤样品取自存在表面下烃沉积物的位置，则在取出土壤样品后，所述土壤样品内的微生物缺乏它们的烃来源。这可以产生土壤样品内的烃和非烃代谢微生物的相对群，返回到在没有烃沉积物的位置所取样品的典型水平。在实践中，对于样品可以必需的是从一个位置获得并且在实验室条件之下用本发明的方法进行分析。因此，重要的是，土壤样品中的基因拷贝数在从一个位置取出样品和在实验室中分析之间保持不变。
因此，在本发明的一些实施方案中，采取具体步骤以稳定固体样品内核酸的存在。在一个实施方案中，将土壤样品保持冷冻在0℃或，例如，在-196℃的液氮中。然而，优选的是，通过添加核酸稳定化合物诸如来自AmbionTM的RNALaterTM和来自QiagenTM的RNAprotectTM来稳定基因拷贝数。化学核酸稳定剂的提供避免需要将笨重的冷冻装置运输到获得土壤样品的地理位置。虽然这些稳定化合物是为了稳定RNA而特别设计的，其通常不如DNA稳定，所述化合物在稳定DNA方面也是有效的。
土壤样品提取
在本发明的实施方案中，从土壤样品提取RNA和/或DNA。虽然土壤样品可以含有干扰PCR反应和由此的定量过程的污染物质，但是其中也定量共有微生物基因的优选实施方案对于这种污染物质不灵敏，因为核酸浓度是关于所述共有微生物基因序列归一化(normalized)的。类似地，虽然不同土壤类型可以影响核酸提取效率，但是这可以通过土壤样品中共有微生物基因序列的定量而归一化。
提取从土壤样品分离的核酸的试剂盒是由MoBio实验室公司(MoBioLaboratories Inc.)商业销售的。这些试剂盒需要将土壤样品添加到珠振荡管以快速匀浆化。细胞溶解通过化学和机械装置(涡流适配器)产生。总基因组DNA捕获在常规旋转柱形式的硅氧烷膜上。洗涤DNA，然后从旋转柱洗脱。
Epicentre有限公司生产SoilMaster DNA提取试剂盒，其利用与色谱步骤相结合的热洗涤剂裂解方法，其除去已知的与来自土壤和沉积样品的DNA共提取的酶催化抑制剂。
Qbiogene公司也生产一定范围的用于从土壤实例提取DNA和RNA的试剂盒。所述试剂盒基于它们的FastPrepTM系统。
实验的
土壤柱实验
建立三个土壤柱，并且经过17-天的时期将下列气体以40ml/分钟通过柱的底部引入。
柱1-空气
柱2-空气中的丁烷、苯、甲苯、二甲苯和辛烷的混合物。每个成分以10ppm存在。
柱3-空气中的丁烷、苯、甲苯、二甲苯和辛烷的混合物。每个成分以100ppm存在。
在17天以后，在柱底部以上2cm、4cm、7cm和9cm处收集土壤样品。使用“土壤样品提取部分”中描述的试剂盒中的一种提取DNA。
在土壤样品上运行改进的EuBac测定以测量共有EuBac基因的拷贝数。
定量PCR用于获得下列指示基因的拷贝数：2，3CAT(儿茶酚2-3双加氧酶)，编码参与需氧芳族化合物降解的酶的基因；AlkB-P1，一种编码烷烃脱氢酶的基因；和XyM，一种编码土壤样品中二甲苯单加氧酶的基因。
对于每份土壤样品，指示基因的拷贝数除以EuBac拷贝数，并且表示为百分比。这给出归一化的指标数据(能代谢烃的微生物群对于总微生物群的比率)。对于2，3CAT、AlkB-P1和XyM得到的归一化数据分别图示在图4、5和6中。
所述图显示，与空气对照相比，在暴露于烃的土壤中，在细菌群中存在指示基因的富集。结果显示，烃的存在致使烃代谢基因的相对拷贝数增加。
应当注意，在该情况下，所述指示剂富集可以用原始的指示剂基因拷贝数数据单独看出。然而，这仅是因为已经确定了适当的对照(仅暴露于空气的土壤)。在实践中，从多个地理位置获得的土壤样品将不具有适当的相同对照。因此，归一化是重要的，以提供烃沉积物存在的精确指标。
序列表
<110>因维罗基因有限公司
     罗伯特·斯利特
     理查德·哈顿
 
<120>微生物检测方法
 
<130>LWPP58741
 
<150>GB0714601.2
<151>2007-07-26
 
<160>44
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
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<213>人造的
 
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<223>改进的EuBac反向引物
 
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<223>改进的EuBac探针
 
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<223>总细菌小亚基rRNA-正向引物
 
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<223>总细菌小亚基rRNA-探针
 
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<223>总细菌16S RNA-探针
 
<400>44
caacgagcgc aaccc
15

Claims (17)

1.一种用于检测地理位置中烃沉积物的存在的方法，所述方法包括下列步骤：
检测编码能够代谢烃的蛋白质的靶标多核苷酸在所述位置的存在，其中所述靶标多核苷酸的存在指示所述烃沉积物的存在；
确定所述靶标多核苷酸在所述位置的浓度；和
确定与细菌在所述位置的浓度有关的数值，并且计算所述靶标多核苷酸的浓度对于所述数值的比率。
2.根据权利要求1的方法，其中确定与细菌在所述位置的浓度有关的数值的步骤包括：确定在多种不同类型的细菌中存在的共有多核苷酸的浓度的步骤。
3.根据上述权利要求的任何一项的方法，其中检测所述靶标多核苷酸的存在的步骤包括：检测所述靶标多核苷酸序列的亚序列的存在。
4.根据权利要求3的方法，其中所述亚序列包括在编码能够代谢烃的蛋白质的多种不同基因中存在的共有序列。
5.根据上述权利要求的任何一项的方法，其中所述靶标多核苷酸是DNA。
6.根据权利要求1至4的任何一项的方法，其中所述靶标多核苷酸是RNA。
7.根据上述权利要求的任何一项的方法，其中所述烃是C1至C20烷烃，烯烃，任选取代的单环或多环芳烃，或萘，优选C2至C20烷烃。
8.根据上述权利要求任何一项的方法，其中能够代谢烃的蛋白质是联苯双加氧酶，甲苯单加氧酶，烷烃羟化酶；儿茶酚2，3，双加氧酶；萘双加氧酶；甲苯双加氧酶；二甲苯单加氧酶；丁烷单加氧酶；细菌P450加氧酶；或真核P450加氧酶。
9.根据权利要求8的方法，其中所述靶标多核苷酸是alkB基因。
10.根据上述权利要求任何一项的方法，其中所述靶标多核苷酸的存在是使用PCR确定的。
11.根据权利要求1至3的任何一项的方法，其中所述靶标多核苷酸的浓度，和任选地，所述共有多核苷酸的浓度是由定量PCR确定的。
12.根据上述权利要求任何一项的方法，其中检测所述靶标多核苷酸存在的步骤包括：从所述位置获得土壤样品和检测所述土壤样品中所述靶标多核苷酸的存在。
13.根据权利要求12的方法，其中所述土壤样品是从表面下10-50cm的深度获得的。
14.根据权利要求12或13的方法，所述方法还包括：在获得所述土壤样品以后，稳定所述土壤样品中的核酸的步骤。
15.根据权利要求12至13的任何一项的方法，所述方法包括在所述地理位置的不同地点获得多份土壤样品并且在每份土壤样品上进行所述方法的步骤。
16.根据权利要求15的方法，所述方法还包括下列步骤：关联所述方法关于每份土壤样品的结果，由此确定所述靶标多核苷酸在地理位置之内的不同地点的存在的变化。
17.根据权利要求16的方法，所述方法还包括下列步骤：确定所述靶标多核苷酸的浓度并且产生与每一地点的所述浓度有关的第一指标；确定每一地点之上的游离烃气体的浓度并且产生与每一地点的所述游离烃气体浓度有关的第二指标；和组合在所述地理位置的每一地点的第一指标和第二指标。
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