CN101967508A - 检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及其试剂盒。该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，该探针包含从carb，tem，imp，oxa groupI，oxa group II，aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aadB及细菌16S rRNA基因中选取的DNA片段或其互补DNA片段。利用上述基因芯片及检测试剂盒可以达到同时检测铜绿假单胞菌上述10种耐药基因的目的，具有针对性强，特异性强，灵敏度高，检测速度快，重复性好等特点，适于医院、疾病预防控制机构及其他临床实验室对铜绿假单胞菌进行耐药基因检测和耐药性监控。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及一种检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及检测用试剂盒。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是革兰氏阴性非发酵机会致病菌，其易于在外界生长繁殖，分布广泛、耐药性强、传播途径多样，成为当今医院感染最常见的病原菌之一。重症监护区的感染10％与铜绿假单胞菌有关，铜绿假单胞菌引起的肺炎、败血症显示很高的发病率与死亡率。近年来，铜绿假单胞菌对抗生素的耐药率逐年增高，多重耐药铜绿假单胞菌的检出率也越来越高。
铜绿假单胞菌可通过获得性抗性或内在抗性对抗生素产生耐药性。其中获得性抗性可通过质粒、整合子、转座子等移动元件在在同种或不同种属之间进行基因的水平转移，从而导致细菌耐药性的传播。因此对获得性耐药菌株的监控对于控制耐药基因传播及预防传染病大爆发有积极意义。
铜绿假单胞菌可获得多种抗性基因，如β-内酰胺酶类基因(tem，shv，oxa，veb，imp，vim)，氨基糖苷修饰酶基因(aac，aad，aph)。前者可导致细菌对β-内酰胺类抗生素抗性，后者可导致细菌对氨基糖苷类抗生素抗性，而此二类抗生素都是目前临床治疗铜绿假单胞菌感染的主要药物。据我国临床检测数据，铜绿假单胞菌常见的重要耐药基因有tem，carb，oxa group I，oxa groupII，imp，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aadB等.
对各类抗生素耐药基因进行检测鉴定，能更准确地对细菌耐药性进行监测并有助于合理选用抗菌药物，提高耐药菌感染的治愈率。
一般检测耐药性的方法有：药敏试验、Southern blot，PCR，RT-PCR，基因芯片等方法。传统的药敏试验耗时长(3天)，只能判断出耐药表型，无法检测具体耐药原理；普通PCR及RT-PCR特异性高，但检测通量极其有限；Southern blot操作步骤繁琐；基因芯片基于PCR技术，但比PCR更特异灵敏，且具有快速、高通量的优点，十分适用于对多重耐药菌进行相关耐药基因的检测。
德国的Weile Jan等(DNA microarray for genotyping multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa clinical isolates，2007，Diagnostic Microbiology andInfectious Disease)利用基因芯片对97株多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株进行了基因分型，结果表明该基因芯片速度快(5h)，准确率高达87.8％)。但该芯片造价较高，每个样品检测成本约50美元，每个靶基因只设计了一个探针，容易产生假阳性。
目前，国内尚未有针对铜绿假单胞菌耐药基因的检测芯片的文献报道或发明专利。
发明内容
为了提高检测速度与精确性，降低成本，更加适于实际应用，本发明提供了一种针对铜绿假单胞菌中常见的重要耐药基因的检测芯片及其试剂盒。
本发明所述的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种：
1)从carb、tem、imp、oxa groupI、oxa groupII、aac(3’)-I、aac(3’)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II、aadB基因和细菌16S rRNA基因中所选取的至少一种DNA片段；
2)从上述1)中选取的至少一种DNA片段的互补DNA片段。
本发明的优选实施例中，所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：29所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：29所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同的序列，具体的优选序列及功能见表1。
本发明所述的基因芯片用于铜绿假单胞菌耐药基因carb、tem、，imp、oxa groupI、oxa groupII、aadB、aac(3’)-I、aac(3’)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II中至少一种的检测。
本发明还提供使用上述的基因芯片检测耐药基因的方法，其主要包含步骤：
1)根据铜绿假单胞菌的耐药基因设计并制备出用于PCR扩增的引物；
2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，按一定浓度混合，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化PCR产物，制得靶序列；
3)标记步骤2)中得到的靶序列；
4)将步骤3)标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；
5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。
本发明的优选实施例中，上述步骤1)中使用的PCR引物为SEQ IDNO：30-SEQ ID NO：51所示核苷酸序列中的至少一种，具体如表2，共22条。
本发明还提供一种检测铜绿假单胞菌耐药基因的试剂盒，其包含上述的基因芯片。
本发明的优选实施例中，上述的试剂盒包含SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：29所示核苷酸序列或其互补核苷酸序列的探针序列中的至少一种。
本发明的优选实施例中，上述的试剂盒还包含SEQ ID NO：30-SEQ IDNO：51所示核苷酸序列的PCR引物。
本发明的优选实施例中，上述的试剂盒还包含杂交盒、杂交液。
本发明上述的试剂盒用于铜绿假单胞菌耐药基因carb，tem，imp，oxagroupI，oxa groupII，aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aadB中至少一种的检测。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案的有益效果在于：针对中国境内铜绿假单胞菌的常见重要获得性耐药基因，精简了探针的数量，成本大大降低；所用引物和探针均来自特异基因序列，与其他基因亲缘性关系远，不易产生交叉，加上严格的筛选，最终每个靶基因优选出2到4条探针，优选出的引物及探针均非常特异；经灵敏度试验确定了本芯片的检出限为1ng DNA；通过对本试验室收集的50株铜绿假单胞菌临床分离耐药株进行了160余次杂交试验，每株重复杂交2到3次，杂交结果十分稳定，与耐药表型符合率高；检测时间为5小时；在一张片基上可同时检测8个样品。综上所述，本发明的特点是针对性强，特异性强，灵敏度高，稳定性好，检测速度快，通量高，成本较低，非常适合医院，疾病预防控制机构及其他临床实验室进行耐药基因检测及耐药性监控。
为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明的基因芯片结构外形示意图；
图2为本发明芯片的单一点阵探针布局示意图；
图3为利用本发明的多重PCR I对铜绿假单胞菌临床分离株基因组及其混合物的扩增产物电泳图，其中：1.模板为P.aeruginosa C1595；2.模板为P.aeruginosa C2177；3.模板为P.aeruginosa C6049；4.模板为P.aeruginosa C7633；5.模板为P.aeruginosa C6393；6.模板为P.aeruginosaC1595，C2177，C6049，C7633等比例混合；M，marker；
图4为利用本发明的多重PCR II对铜绿假单胞菌临床分离株基因组及其混合物的扩增产物电泳图，其中：1.模板为P.aeruginosa C2589；2.模板为P.aeruginosa C6049；3.模板为P.aeruginosa C7633；4.模板为P.aeruginosa C2589，C6049，C7633等比例混合；M，marker；
图5为利用本发明的基因芯片检测carb基因的一个实施例杂交结果示意图；
图6为利用本发明的基因芯片检测tem基因的一个实施例杂交结果示意图；
图7为利用本发明的基因芯片检测imp基因的一个实施例杂交结果示意图；
图8为利用本发明的基因芯片检测oxa groupI基因的一个实施例杂交结果示意图；
图9为利用本发明的基因芯片检测oxa groupII基因的一个实施例杂交结果示意图；
图10图为利用本发明的基因芯片检测aac(6′)-Ib基因的一个实施例杂交结果示意图；
图11为利用本发明的基因芯片检测aac(6′)-II基因的一个实施例的杂交结果示意图；
图12为利用本发明的基因芯片检测aac(3′)-I基因的一个实施例杂交结果示意图；
图13为利用本发明的基因芯片检测aac(3′)-II基因的一个实施例杂交结果示意图；
图14为利用本发明的基因芯片检测aadB基因的一个实施例杂交结果示意图；
图15为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C1595的一个实施例杂交结果示意图；
图16为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C2177的一个实施例杂交结果示意图；
图17为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C4935的一个实施例杂交结果示意图；
图18为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C6049的一个实施例杂交结果示意图；
图19为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C6393的一个实施例杂交结果示意图；
图20为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C6933的一个实施例杂交结果示意图。
具体实施方式
实施例一探针的设计和制备
1.序列获得：
从GenBank公共数据库下载得到铜绿假单胞菌上述耐药基因的全部基因序列及细菌16S rRNA基因典型序列。
2.探针设计：
用Clustal X软件分别比对各个基因的不同序列，根据比对结果，选取一条代表序列，将该序列导入Primer Premier 5软件中。运行程序设计探针，选择长度(25±5)bp，Tm 60℃～70℃，GC含量40％～60％，将设计好的探针输入NCBI中作blastn比对，保证该序列基因内保守性和基因间特异性。每个基因设计至少4条不同探针，以备后续筛选。
3.探针合成：将设计好的探针序列经5′端polyT加至总长40个核苷酸(正对照探针加长至49个核苷酸)，5′端氨基化修饰，委托探针合成公司合成，备用。
4.探针筛选：将合成好的探针溶解于50％DMSO，稀释至1μg/μl后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片。通过杂交实验对所设计的探针进行筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片的优选探针29条，包括28条耐药基因探针及1条16S rRNA基因(16S rDNA)正对照探针，如表1。
表1：本发明基因芯片所选用的寡核苷酸探针序列及可检测的基因
| SEQ ID NO： | 探针编号NO： | 序列(5′-3′) | 检测基因 |
| 1 | 1 | GCGTGCTTCGCAACTATGACTACAA | carb |
| 2 | 2 | GGTGATTTGAGGGATACGACAACTCCTAA | carb |
| 3 | 3 | TATGTGGTGCGGTATTATCCCGTGTTG | tem |
| 4 | 4 | GAATGAAGCCATACCAAACGACGAGC | tem |
| 5 | 5 | ATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTT | tem |
| 6 | 6 | GACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT | tem |
| 7 | 7 | TCATTTTCATAGCGACAGCACGGG | imp |
| 8 | 8 | GGAATAGAGTGGCTTAATTCTCAATCT | imp |
| 9 | 9 | GGCGTTTATGTTCATACTTCGTTTGAAGAA | imp |
| 10 | 10 | CCCACGTATGCATCTGAATTAACAAATG | imp |
| 11 | 11 | TCCAGCATCAACATTTAAGATCCCCA | oxa groupI |
| 12 | 12 | TCAAATGGGACGGAAAGCCAAGAG | oxa groupI |
| 13 | 13 | TGGTTTTTCTGGTGTGGGAACTGAGTC | oxa groupI |
| 14 | 14 | ACTCCTACGGGAGGCAGC | 16S rDNA |
| 15 | 15 | GAAATTGGTGATGACAAAGCTCGGC | oxa groupII |
| 16 | 16 | CAACGCCGATCCTTCGACAAGTAAT | oxa groupII |
| 17 | 17 | GACTGGCTCCGTATTCTTCGCACTG | oxa groupII |
| 18 | 18 | GAGTTGCTGTTCAATGATCCCGAGG | aac(6′)-Ib |
| 19 | 19 | ACTTGCGAGCGATCCGATGCTACGA | aac(6′)-Ib |
| 20 | 20 | GACCGACTCTTGATGAAGTGCTGGAAC | aac(6′)-II |
| 21 | 21 | GAAGAGTCCGTAACACCGTACATCGC | aac(6′)-II |
| 22 | 22 | CTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGC | aac(3′)-I |
| 23 | 23 | GGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTAC | aac(3′)-I |
| 24 | 24 | CCGACTGGCACTGTGATGGGATAC | aac(3′)-II |
| 25 | 25 | CACCCTACGAGGAGACTCTGAATGGC | aac(3′)-II |
| 26 | 26 | AAACGCTGACGGAGCCTCACGAAC | aac(3′)-II |
| 27 | 27 | CTGGGATTACTTTTACTATGCCGATG | aadB |
| 28 | 28 | GAGTTGGACTATGGATTCTTAGCGGAGAT | aadB |
| 29 | 29 | ATGAGTTACTTGACTGCGAACCTGCTTG | aadB |
参照图1，是本发明的基因芯片结构外形示意图，该基因芯片的上部是点样区，下部是标签区域，其中点样区内规则分布有八个点阵区。探针在玻璃片基上的点阵位置为：第一横排点阵区的上端距离玻璃片基的上方为9.25mm，左侧点阵区距离玻璃片基的左侧、右侧点阵区距离玻璃片基的右侧均为4.5mm，两个点阵区间的距离为13.5mm(均从左侧点阵区和右侧点阵区的最左端起算)，第一横点阵区的最上端和第二横点阵区的最上端的距离是13.5mm，第二横排点阵区的最上端和第三横排点阵区的最上端的距离是19.5mm。
参照图2，是本发明芯片的单一点阵列结构示意图。其中的Cy3为49poly(T)-Cy3，荧光定位探针；WL-4006：49poly(T)，负对照探针；DMSO表示50％DMSO，空白对照阵；NO对应的数字表示的核苷酸序列与本发明中所述的SEQ ID NO对应的数字表示的核苷酸序列一致。
实施例二引物的设计和制备
1.PCR引物设计举例：
(1)单个耐药基因tem通用扩增引物设计举例：将铜绿假单胞菌所有tem序列(包括各tem基因亚型)导入Glustal X软件中，从中选取一条有代表性的序列导入Primer Primier 5.0软件中，设定长度(20±4)bp，G+C％值40％～60％，产物大小大于200bp。并寻找出适合通用引物设计的核苷酸序列区，其特点须满足以下条件：1，该恒定区应包括大多数的tem型别；2，该区域应包含有易于特异性探针设计的区域；3，该区域两侧为恒定区能满足引物的设计。选择二级结构(发夹结构，二聚体)最小的引物序列，将序列输入NCBI进行blastn比对，确认其特异性。其它耐药基因引物的设计均如tem。
(2)多重PCR引物设计：先按照(1)的方法分别单独设计各靶基因的引物或选择适当的文献报道引物，注意各基因扩增产物大小应该有明显差异(＞30bp)，以便于电泳检测区分。利用Primer Primier 5.0 mutiplex/nestedprimer功能，将每组多重PCR所涉及的所有引物进行分析，如果任意两条引物间有严重cross dimmer(二聚体)(ΔG≤-15kcal/mol)，需将其中一条去掉，重新设计，继续分析，保证各个引物之间没有严重的crossdimmer。
2.引物合成：将表2中的引物序列委托合成公司(英俊生物技术公司)合成(PAGE纯化)，备用。
表2本发明中用于扩增铜绿假单胞菌耐药基因及细菌16S rRNA基因的引物序列
引物序列中M代表A/C，R代表A/G，Y代表C/T；引物种类中F代表上游引物，R代表下游引物。
实施例三利用基因芯片检测铜绿假单胞菌10种常见重要耐药基因及试剂盒的制备
1.芯片的预杂交
(1)将点制好的芯片放入500ml 42℃预热的预杂交液中，42℃孵育1小时。
预杂交液配方：1％BSA(牛血清蛋白)
5×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)
0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)
(2)在ddH2O中提洗1分钟两次，95％乙醇脱水2分钟，吹风机吹干，备用。
2.总DNA的获得：
(1)将收集得到的铜绿假单胞菌挑取单克隆菌落转入5ml 2YT培养液37℃震荡培养12小时；
(2)取1ml菌液入1.5ml离心管，15000g×室温离心3分钟；
(3)弃上清，加入100μl ddH2O，混匀，100℃水浴10分钟；
(4)冰浴10分钟，4℃15000g×离心10分钟；
(5)收集上清，即可用于检测或-20℃保存备用。
3.扩增靶序列：取上述总DNA 0.5μl作为模板分别加入下列PCR反应混合液中，分两组进行扩增。多重PCR I可扩增本芯片所涉及的耐药基因carb，tem，imp，oxa groupI，oxa groupII。多重PCR II可扩增本芯片所涉及的耐药基因aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aadB以及细菌16S rDNA[注：表3、4中的PCR缓冲液(含镁离子)、dNTP混合物，Taq酶均购自Takara公司]。
表3多重PCR I反应混合液配方
注：①引物混合物I中包含多重PCR I的10条引物：Tem R、Tem F、Imp F、Imp R、Carb F、Carb R、Oxa group I F，oxa group I R、oxa groupII F、oxa group II R；oxa group II R为8.0μM，其余各引物浓度均为2.0μM。
表4多重PCR II反应混合液配方
注：②引物混合物II包含多重PCR group II的12条引物：Aac(3′)-IF，Aac(3′)-I R，Aac(3′)-II F，Aac(3′)-II R，Aac(6′)-Ib F，Aac(6′)-Ib R，Aac(6′)-II F，Aac(6′)-II R，AadB F，AadB R，16S rDNA F，16S rDNA R，各引物的浓度均为2.0μM。
将反应管放入PCR仪中，设定的循环参数如下：
95℃5分钟
95℃30秒
52℃30秒
72℃50秒回到第二步，共30个循环
72℃5分钟
为了检测扩增质量，可对PCR产物进行琼脂糖电泳(此步可省略不做)，图3为多重PCR I对铜绿假单胞菌临床菌株基因组及其混合物的扩增产物电泳图；图4为多重PCR II对铜绿假单胞菌临床分离株基因组及其混合物的扩增产物电泳图。
4.PCR产物纯化：将上述多重PCR I、II的扩增产物全部转入一个minipore纯化柱，加入ddH2O补足至400μl，1000g×室温离心15分钟；加入25μl ddH2O于柱膜中央，静置5分钟；将柱子倒置于新收集管中，1000g×室温离心2分钟，离下液即为去除引物的纯化DNA。
5.荧光标记靶序列：取第4步所纯化的产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表5所示。
表5标记反应混合液配方
注：③引物混合物III中包含本芯片所涉及的十个耐药基因的下游引物：Tem R，Imp R，Carb R，Oxa group I R，Oxa group II R，Aac(3′)-I R，Aac(3′)-II R，Aac(6′)-Ib R，Aac(6′)-II R，AadB R，16S rDNA R。其中，Oxa group II R浓度为8.0μM；其余各引物浓度均为2.0μM。
将反应管放入PCR仪中，设定的循环参数如下：
95℃5分钟
95℃30秒
52℃30秒
72℃50秒回到第二步，共30个循环
72℃5分钟
6.杂交：向杂交盒(博奥公司)内加入50μl ddH2O以保持湿度，放入托架，放入铜绿假单胞菌耐药基因检测芯片，置盖片。取第5步所得标记产物10μl与10μl经55℃预热的杂交液混合，全部转入盖片的加样孔(博奥公司)，将上盖扣紧杂交盒，夹上金属夹。置55℃水浴锅中杂交1.5小时。
杂交液配方：10％硫酸葡聚糖；25％甲酰胺；0.1％SDS；6×SSPE(1×SSPE包括0.18M NaCl，10mM NaH2PO4，1mM EDTA{pH 7.7})。
7.洗涤：取出芯片，置铜架上，依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤2分钟，吹风机吹干。
洗液A：1×SSC，0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
8.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXON仪器公司)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0；official name：575DF35；PMT Gain：550；扫描分辨率：5μm；扫描结果存为JPG、TIF格式。
用本发明的基因芯片分别检测本发明所涉及铜绿假单胞菌耐药基因时的杂交扫描结果分别如图5～图20所示。
9.杂交结果的分析判读：根据扫描出的杂交图像，据荧光探针的位置及正对照探针的位置，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出对应耐药基因。
图15～图20为利用本发明的芯片试剂盒对铜绿假单胞菌临床分离株的基因组进行扩增、杂交所得芯片扫描图，分别与图1及表1做对照，可得出图15对应的临床分离株C1595中含有耐药基因carb，aac(6’)-II，aadB；图16对应的临床分离株C2177中含有耐药基因imp，aac(3’)-II；图17对应的临床分离株C4935中含有耐药基因aac(6’)-Ib和aadB；图18对应的临床分离株C6049中含有耐药基因oxa groupI，aac(6’)-II，aadB；图19对应的临床分离株C6393中含有耐药基因tem，oxa groupI，oxa groupII，aac(6’)-II，aac(3’)-II；图20对应的临床分离株C6933中含有耐药基因tem，oxa groupII，aac(6’)-Ib，aac(3’)-II。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及其试剂盒
<130>9P13005-CN
<160>51
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>用于检测carb基因的探针
<400>1
gcgtgcttcg caactatgac tacaa 25
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>用于检测carb基因的探针
<400>2
ggtgatttga gggatacgac aactcctaa 29
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>用于检测tem基因的探针
<400>3
tatgtggtgc ggtattatcc cgtgttg 27
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>用于检测tem基因的探针
<400>4
gaatgaagcc ataccaaacg acgagc 26
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>用于检测tem基因的探针
<400>5
atggtaagcc ctcccgtatc gtagtt 26
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>用于检测tem基因的探针
<400>6
gacggggagt caggcaacta tggat 25
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>用于检测imp基因的探针
<400>7
tcattttcat agcgacagca cggg 24
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>用于检测imp基因的探针
<400>8
ggaatagagt ggcttaattc tcaatct 27
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>用于检测imp基因的探针
<400>9
ggcgtttatg ttcatacttc gtttgaagaa 30
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>用于检测imp基因的探针
<400>10
cccacgtatg catctgaatt aacaaatg 28
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>用于检测oxa groupI基因的探针
<400>11
tccagcatca acatttaaga tcccca 26
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>用于检测oxa groupI基因的探针
<400>12
tcaaatggga cggaaagcca agag 24
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>用于检测oxa groupI基因的探针
<400>13
tggtttttct ggtgtgggaa ctgagtc 27
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>用于检测16S rDNA基因的探针
<400>14
actcctacgg gaggcagc 18
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>用于检测oxa group II基因的探针
<400>15
gaaattggtg atgacaaagc tcggc 25
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>用于检测oxa group II基因的探针
<400>16
caacgccgat ccttcgacaa gtaat 25
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>用于检测oxa group II基因的探针
<400>17
gactggctcc gtattcttcg cactg 25
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>用于检测aac(6′)-Ib基因的探针
<400>18
gagttgctgt tcaatgatcc cgagg 25
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>用于检测aac(6′)-Ib基因的探针
<400>19
acttgcgagc gatccgatgc tacga 25
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>用于检测aaac(6′)-II基因的探针
<400>20
gaccgactct tgatgaagtg ctggaac 27
<210>21
<211>26
<212>DNA
<213>用于检测aaac(6′)-II基因的探针
<400>21
gaagagtccg taacaccgta catcgc 26
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>用于检测aac(3′)-I基因的探针
<400>22
cttgctccgt agtaagacat tcatcgc 27
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>用于检测aac(3′)-I基因的探针
<400>23
ggttgttggc gctctcgcgg cttac 25
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>用于检测aac(3′)-I基因的探针
<400>24
ccgactggca ctgtgatggg atac 24
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>用于检测aac(3′)-I基因的探针
<400>25
caccctacga ggagactctg aatggc 26
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>用于检测aac(3′)-I基因的探针
<400>26
aaacgctgac ggagcctcac gaac 24
<210>27
<211>26
<212>DNA
<213>用于检测aadB基因的探针
<400>27
ctgggattac ttttactatg ccgatg 26
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>用于检测aadB基因的探针
<400>28
gagttggact atggattctt agcggagat 29
<210>29
<211>28
<212>DNA
<213>用于检测aadB基因的探针
<400>29
atgagttact tgactgcgaa cctgcttg 28
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>扩增tem基因的引物
<400>30
acatttccgt gtcgccctta t 21
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>扩增tem基因的引物
<400>31
gcttaatcag tgaggcacct atc 23
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>扩增oxa groupI基因的引物
<400>32
gtctttcrag tacggcatta 20
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>扩增oxa groupI基因的引物
<400>33
gattttctta gcggcaactt a 21
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>扩增oxa groupII基因的引物
<400>34
gcacgatagt tgtggcaga 19
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>扩增oxa group II基因的引物
<400>35
gcggyaacgc ttcrataga 19
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>扩增imp基因的引物
<400>36
ctaccgcagc agagtctttg 20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>扩增imp基因的引物
<400>37
aaccagtttt gccttaccat 20
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>扩增carb基因的引物
<400>38
gctaaattac tatatgatgc tgag 24
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>扩增carb基因的引物
<400>39
tattgcctta ggagttgtcg 20
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>扩增aac(3′)-II基因的引物
<400>40
gcatacgcgg aaggcaataa c 21
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>扩增aac(3′)-II基因的引物
<400>41
tccaagcatc ggcatctcat a 21
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>扩增aac(6′)-II基因的引物
<400>42
cccataactc ttcgcctcat 20
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>扩增aac(6′)-II基因的引物
<400>43
cttctcccgc acgaatcct 19
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>扩增aadB基因的引物
<400>44
ggacacaacg caggtcacat t 21
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>扩增aadB基因的引物
<400>45
ctggtggtac ttcatcggca ta 22
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>扩增aac(6′)-Ib基因的引物
<400>46
acagtacttg ccaagcgttt 20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>扩增aac(6′)-Ib基因的引物
<400>47
ccatgtacac ggctggacca 20
<210>48
<211>21
<212>DNA
<213>扩增aac(3′)-I基因的引物
<400>48
cttttcggtc gtgagttcgg a 21
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>扩增aac(3′)-I基因的引物
<400>49
gccggagact gcgagatcat 20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>扩增16S rDNA基因的引物
<400>50
agagtttgat cmtggctcag 20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>扩增16S rDNA基因的引物
<400>51
ccgtcaattc ctttgagttt 20
Claims (10)
1.一种用于检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种：
1)从carb、tem、imp、oxa groupI、oxa groupII、aac(3’)-I、aac(3’)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II、aadB基因和细菌16S rRNA基因中所选取的至少一种DNA片段；
2)从上述1)中选取的至少一种DNA片段的互补DNA片段。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列，或不同于SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列但编码的氨基酸序列与SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：29所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同的序列。
3.权利要求1或2所述的基因芯片用于铜绿假单胞菌耐药基因carb、tem、，imp、oxa groupI、oxa groupII、aadB、aac(3’)-I、aac(3’)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II中至少一种的检测。
4.使用权利要求1所述的基因芯片检测耐药基因的方法，其特征在于包含步骤：
1)根据铜绿假单胞菌的耐药基因设计并制备出用于PCR扩增的引物；
2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，按一定浓度混合，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化PCR产物，制得靶序列；
3)标记步骤2)中得到的靶序列；
4)将步骤3)标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；
5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1)中使用的PCR引物为SEQ ID NO：30-SEQ ID NO：51所示核苷酸序列中的至少一种。
6.一种检测铜绿假单胞菌耐药基因的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的基因芯片。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于还包含SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：29所示核苷酸序列或其互补核苷酸序列的探针序列中的至少一种。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于还包含SEQ IDNO：30-SEQ ID NO：51所示核苷酸序列的PCR引物。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于还包含杂交盒、杂交液。
10.权利要求6所述的试剂盒用于铜绿假单胞菌耐药基因carb，tem，imp，oxa groupI，oxa groupII，aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aadB中至少一种的检测。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103255216A (zh) * | 2013-04-24 | 2013-08-21 | 山东艾克韦生物技术有限公司 | 院内感染多病原体并行检测基因芯片及其制作方法和应用 |
| CN104328179A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-02-04 | 中国人民解放军济南军区第四〇一医院 | 一组用于铜绿假单胞菌多重耐药基因检测的液态芯片引物和探针 |
| CN105754978A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-07-13 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac14及制备方法和应用 |
| CN107419014A (zh) * | 2017-07-17 | 2017-12-01 | 蔡先全 | 检测水中铜绿假单胞菌和aprA的引物、试剂盒和方法 |
| CN107419016A (zh) * | 2017-07-17 | 2017-12-01 | 蔡先全 | 检测水中铜绿假单胞菌和整合子的引物、试剂盒和方法 |
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2009
- 2009-07-28 CN CN2009101520731A patent/CN101967508A/zh active Pending
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| CN103255216B (zh) * | 2013-04-24 | 2014-11-26 | 山东艾克韦生物技术有限公司 | 院内感染多病原体并行检测基因芯片及其制作方法和应用 |
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20110209 |