CN109136398A

CN109136398A - 一种检测犬巴贝斯虫试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN109136398A
Application number: CN201811077107.0A
Authority: CN
Inventors: 王锦明; 关贵全; 杨吉飞; 王晓星; 刘志杰; 殷宏; 罗建勋
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-09-15
Filing date: 2018-09-15
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明公开一种犬巴贝斯虫病检测试剂盒及非疾病诊断方法。本发明的检测犬巴贝斯虫试剂盒中至少包括有序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的两条扩增引物。利用本发明的试剂盒进行检测的方法具有重复性好、灵敏度高、速度快和全封闭反应等优点，检测方法具有特异性好、敏感性高和可重复性的特点，使其能更好地用于犬体内梨形虫的鉴别检测。本方法囊括了国内现存的犬巴贝斯虫病病原，检测范围广，可用于犬巴贝斯虫种的鉴别检测和流行病学调查。

Description

一种检测犬巴贝斯虫试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种脊椎动物寄生虫的试剂盒及其非疾病检测方法，确切讲本发明涉及一种犬巴贝斯虫病检测试剂盒及非疾病诊断方法。

背景技术

巴贝斯虫病是一种蜱传性的血液原虫病，该病由寄生于红细胞内的多种巴贝斯虫引起，其临床特征为发热、精神沉郁、嗜睡、黄疸、贫血、血红蛋白尿、呕吐、呼吸困难等，对犬的健康造成了巨大的危害。到目前为止，导致犬巴贝斯虫病的病原主要有6种，根据虫体形态特征可分为大巴贝斯虫和小巴贝斯虫（Laia et al, 2016）。大巴贝斯虫有3种，分别是：韦氏巴贝斯虫（Babesia canis vogeli）、犬巴贝斯虫（Babesia canis）和罗氏巴贝斯虫（Babesia canis rossi）。小巴贝斯虫有：吉氏巴贝斯虫（Babesia gibsoni）、康氏巴贝斯虫（Babesia conradae）和vulpes巴贝斯虫（Babesia vulpes）。

我国对犬巴贝斯虫病的报道最早在1985的河南，随后在江苏、江西、浙江、安徽、河南、陕西、辽宁、山东等地均有报道(吕文祥等，1989；陈启军等，1993；刘跃生，2002；Chen etal, 2014; Xu et al, 2015; Zhang et al, 2016; He et al, 2017; Wang et al,2018)。流行病学调查结果显示，在我国流行的巴贝斯虫病病原主要有犬巴贝斯虫（Babesia canis canis）、罗氏巴贝斯虫（Babesia canis rossi）、韦氏巴贝斯虫（Babesia canis vogeli）、吉氏巴贝斯虫（Babesia gibsoni）和康氏巴贝斯虫（Babesia conradae）（He etal, 2017；Wang et al, 2018）。近年来我国犬的数量呈现逐年上升的趋势，截至2012年我国宠物犬数量已达1.3亿只。利用血清学和分子生物学技术对犬巴贝斯虫的流行病学调查结果显示，该病流行范围广，其阳性率为2.47%-11.86%（Xu et al，2015；Zhang et al，2017；Wang et al，2018）。进行犬巴贝斯虫的研究，对养犬业和公共卫生有重要的意义，对巴贝斯虫的鉴别检测也是寄生虫学研究的重要内容，有益于针对性地预防和控制犬巴贝斯虫病。

对感染犬的五种巴贝斯虫进行大小群体（区分大巴贝斯虫和小巴贝斯虫）的形态鉴定相对容易，然而要进行虫种的鉴别十分困难，也存在一定的局限性。随着现代分子生物学技术的发展，国内外学者应用PCR、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）、反向线状印迹技术（RLB）等对犬巴贝斯虫进行检测。这些方法敏感性和特异性均较高，但每次只能鉴定出一种病原体，无法同时实现多种病原的鉴别检测。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的用于检测犬巴贝斯虫试剂盒，以及利用这种试剂盒进行非疾病检测目的的检测方法。

本发明的检测犬巴贝斯虫试剂盒中至少包括有序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的两条扩增引物。

优选地，本发明的检测犬巴贝斯虫试剂盒中还有含EvaGreen荧光染料qPCRMasterMix的预混溶液。为方便检测，本发明的试剂盒中还可以有标准阳性质粒模板、阴性标准品。

本发明的非疾病检测目的的犬巴贝斯虫检测方法是：提取将待检测样品的DNA，再将所得到的待检DNA用权利要求1至3所述的试剂盒中的扩增引物进行扩增，再将扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析，将所得到的待检测样品高分辨率溶解曲线与标准的犬感染的巴贝斯虫熔解曲线进行对比，得到待检样品是否感染及感染何种犬巴贝斯虫。

本发明是在现有技术的基础上，根据18S rRNA序列分析结果，在高度保守区设计扩增引物，进行靶序列的扩增。靶序列具有如下特征：（1）在同一虫种不同地方分离株间高度保守（核苷酸序列相似性为100%）；（2）不同虫种间至少有一个碱基的变异；利用高分辨率溶解曲线方法（HRM）对扩增产物进行熔解曲线分析，由于扩增的基因序列存在一个或数个碱基的差异，导致不同的基因序列熔解温度有细微的差别，形成不同的熔解曲线，进行研制出可同时鉴别检测五种巴贝斯虫病原的试剂盒，为犬巴贝斯虫的快速鉴别诊断、流行病学调查和防控等奠定基础。

本发明利用犬巴贝斯虫、韦氏巴贝斯虫、罗氏巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫、康氏巴贝斯虫18sRNA基因序列的保守性特征（基因序列相似性为96.78%-99.2%），基于基因序列分析结果，在保守区域设计扩增引物，扩增的靶序列虽然高度相似，但在不同的虫种间存在个别碱基的差异，使其扩增产物的熔解温度存在一定的差异，反映在熔解曲线上，可以形成不重合的曲线，从而可以进行不同虫种的鉴别。该方法具有重复性好、灵敏度高、速度快和全封闭反应等优点。目前，还没有关于利用高分辨率熔解曲线进行犬梨形虫种鉴别检测方法的报道，本发明通过对反应条件的优化，检测方法具有特异性高、敏感性好和可重复性的特点，使其能更好地用于犬体内梨形虫的鉴别检测。

本方法囊括了国内现存的犬巴贝斯虫病病原，检测范围广，可用于犬巴贝斯虫种的鉴别检测和流行病学调查。

附图说明

图1实时荧光定量PCR扩增敏感性。其中1为PCR扩增质粒浓度为1×10⁷拷贝/μL，2为PCR扩增质粒浓度为1×10⁶拷贝/μL，3为PCR扩增质粒浓度为1×10⁵拷贝/μL，4为PCR扩增质粒浓度为1×10⁴拷贝/μL，5为PCR扩增质粒浓度为1×10³拷贝/μL，6为PCR扩增质粒浓度为1×10²拷贝/μL，7为PCR扩增质粒浓度为1×10¹拷贝/μL。

图2 熔解曲线敏感性。1为吉氏巴贝斯虫18sRNA质粒1×10⁷拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL扩增产物的溶解曲线，2为康氏巴贝斯虫18sRNA质粒1×10⁷拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL扩增产物的溶解曲线，3为罗氏巴贝斯虫18sRNA质粒1×10⁷拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL扩增产物的溶解曲线，4为韦氏巴贝斯虫18sRNA质粒1×10⁷拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL扩增产物的溶解曲线，5为犬巴贝斯虫18sRNA质粒1×10⁷拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL扩增产物的溶解曲线。

图3 应用本发明的方法对已知背景的样本进行鉴别检测的结果。1为吉氏巴贝斯虫（样本1-2号），2为康氏巴贝斯虫（样本3-7号），3为罗氏巴贝斯虫（样本8-10号），4为韦氏巴贝斯虫（样本11-13号），5为犬巴贝斯虫（样本14-16号）。

图4为应用本发明的方法对样本进行分析的结果。

具体实施方式

下面提供具体实施方案对本发明做更详细阐述。下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物序列合成及测序工作均由南京金斯瑞股份有限公司完成。

本发明所用引物、标准质粒和试剂如下：

（1）PCR扩增引物

SEQ ID NO.1

上游引物：Canis -F 5'- GTGACAAGAAATAACAATAC-3'

SEQ ID NO.2

下游引物：Canis -R 5'-CCAGACTTGCCCTCCAATTG-3'

扩增产物长度为100bp

（2）标准犬巴贝斯虫18sRNA重组质粒（10⁵拷贝/μL）；

重组质粒序列SEQ ID NO.3为：

TAATTGTAGGGCTAATACACGTTTGTGGTCTTTTGACCGCGTTTATTAGTTTGAAACCCGCCTTGGCTTTCGGTGATTCATAATAAACTGGCGAATCGCATTTAGCGATGGACCATTCAAGTTTCTGACCCATCAGCTTGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGAGGCAGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCGAATGTCTTGTAATTGGAATGATGGTGACCCAAACCCTCACCAGAGTAGCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGTATTTTTGCGTTAGCGGTTTGACCATTTGGTTGGTTATTTCGTTTTCGCTTTTGGGAATTTCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTATTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGTGATTGGAGGTCGTCGTTTTTTGACCCCTTCAAGAACTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGATCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAACGGTAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAACTAGTGCCGGTTATTTGAGTTTCCGGTTGCTTCTTAGAGGGACTTTGGGGCGCTAAGCCCTGAGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCTGGGCTGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCATCGAGTTTATTCCTTGGCCGAGAGGTCTAGGTAATCTTTAGTATGCATCGTGACGGGGATTGATTTTTGTAATTCTAAATCATGAACGAGGAATGCCTAGTATGCGCAAGTCATCAGCTTGTGCAGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACA。

（3）标准韦氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒（10⁵拷贝/μL）；

重组质粒序列SEQ ID NO.4为：

TAATTGTAGGGCTAATACACGTTTGAGGTCTTTTGACCGCGTTTATTAGTTTGAAACCCGCCTTGGCTTTCGGTGATTCATAATAAACTGGCGAATCGCATTTAGCGATGGACCATTCAAGTTTCTGACCCATCAGCTTGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGAGGCAGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCTAATGTCTTGTAATTGGAATGATGGTGACCCACACCCTCACCAGAGTAGCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTTAGCGTGTTCGAGTTTGCCATTCGTTTGGCTTTTTCGAGTTCGCTTTTGGGTTTTCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTAAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTATTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACCATGCCGACTAGTGATTGGAGGTCGTCGTTTTGCTGACCCCTTCAGGAGCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAACGGTAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAACTAGCGGCGGTTACTGTGGTTTCCGGTTGCTTCTTAGAGGGACTTTGGGGCTCTAAGCCCTGAGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCTGGGCTGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCATCGAGTTGTCCCTTGGCCGAGAGGTCTTGGTAATCTTTAGTATGCATCGTGACGGGGATTGATTTTTGCAATTCTAAATCATGAACGAGGAATGCCTAGTATGCGCAAGTCATCAGCTTGTGCAGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACA 。

(4) 标准罗氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒（10⁵拷贝/μL）;

重组质粒序列SEQ ID NO.5为：

TAGGGCTAATACACGTTGGAGGCCTTTTGGCCGCGTTTATTAGTTTGAAACCTCCGCTTGGTTTTCGGTGATTCATAATAAACTTGCGAATCGCTTTTAGCGATGGACCATTCAAGTTTCTGACCCATCAGCTTGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGAGGCAGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCTAATGTCTTGTAATTGGAATGATGGTGACTTAAACCCTCACCAGAGTAGCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGTATTTTTGCTTGGCGGTTTGTTGCCTTTGTGGCTGTATCCCGCTTGGCTTTTGGCTTTTTGCCTTATTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTGTAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGGGAACCTTGGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGTGATTGGAGGTCGTCGTTTGTTTGACCCCTTCAGGAGCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACGAACGGTAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAACTAGCGCTGGTTACTTGGTTTCCCGCTGCTTCCTAGAGGGACTTTGGGGCTTGAAGCTCCAAGGAAGATTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCTGGGCTGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCATCGAGTGTTGCCCCTGGCCGAGAGGTCTGGGTAATCTTTAGTATGCATCGTGACGGGGATTGATTTTTGTAACTCTAAATCATGAACGAGGAATGCCTAGTATGCGCAAGTCATCAGCTTGTGCAGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACAC。

(5) 标准康氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒（10⁵拷贝/μL）;

重组质粒序列SEQ ID NO.6为：

TAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACATGATCGAGGTCCTTCTGGACTGCGTTTATTAGACTCGAAACCTTCCCGCTTCGGCGGTTCCCGGTGATTCATAATAAACAGCGAATCGCATGGCTTTTGCCGGCGATAATTCATTCAAGTTTCTGATCTATCAGCTTTGGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGGGGCAGCGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACAGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATACGGACACCGTGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCTTTAAGCTTTGTAATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAATTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTCTGCCGCCGGGACTTCGTTCCCTTCGGGGCTTCGTTTTCTCGGTGGCATCCCTCTGGTTAATTTGGGCCTCGGCCCTCTTTTTCCAGTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTCTTGCCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCAGGACCAAAGTAATGGTTAATAGGAGCAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGCTCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACTATAAACTATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCATTTTAAACGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAACCTCACCAGGTCCAGACATAGTTAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTAGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCATTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCAGCTGAGAATAAACTTTGTTGTTTTCAGCATTGCTTCTTAGAGGGACTTTGCGGTCATAAATCGCAAGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCTGGG 。

(7) 标准吉氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒（10⁵拷贝/μL）;

重组质粒序列SEQ ID NO.7为：

TAATTGTAGGGCTAATACAAGTTCGAGGCCTTTTTGGCGGCGTTTATTAGTTCTAAACCTCCCTTGGTTTTCGGTGATTCATAATAAACTCGCGAATCGCTTTTAGCGATGGACCATTCAAGTTTCTGACCCATCAGCTTGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGAGGCAGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCAATTGTCTTGTAATTGGAATGATGGTGACGTAAAATCTCACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCGTTGCCCGACTCGGCTACTTGCCTTGTCTGGTTTCGCTTTTGGGGTTTTCCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTGTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACCATGCCGACTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAGTTAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAACTAGTTGCCGTTATTTCAGTTTCGGCCAGCTTCTTAGAGGGACTTTGGGGCTCTAAGCCACAAGGAAGATTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCTGGGCTGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCATCGAGTGTTATCCCTGGCCGAGAGGTCCGGGTAATCTTTAGTATGCATCGTGACGGGGATTGATTTTTGTAATTCTAAATCATGAACGAGGAATGCCTAGTATGCGCAAGTCATCAGCTTGTGCAGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACA。

(8)标准巴贝斯虫阴性犬基因组DNA（50ng/μL）；

(9)预混qPCRMaster Mix。

具体操作方法如下：

首先制备所需的五种质粒标准品。本发明包括犬巴贝斯虫、韦氏巴贝斯虫、罗氏巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫和康氏巴贝斯虫，共5个虫种的18sRNA基因重组质粒。

在具体应用时还需要有：预混qPCRMaster Mix（含EvaGreen荧光染料）、标准阳性质粒模板、阴性标准品、扩增引物。反应体系包括荧光定量PCR反应液qPCRMaster Mix 10μL，正向引物和反向引物（10pmol）各0.5μL，荧光校正液ROX Reference Dye（50×）0.4μL，标准品质粒模版1.0μL，灭菌蒸馏水7.6μL。

1、标准品的制备

犬巴贝斯虫、韦氏巴贝斯虫、罗氏巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫和康氏巴贝斯虫18sRNA重组标准质粒的制备。

（1）根据犬梨形虫核糖体18S rRNA基因序列，使用Primer premier 5.0设计引物，预期获得的目的片段约为1400bp，由南京金斯瑞有限公司合成。引物对序列为：

PIRO-F140：5'-CCATGGATAACCGTGCTAATTG-3'（SEQ ID NO.8）

PIRO- R1380：5'-CATCTAAGGGCATCACAGACC-3'（SEQ ID NO.9）

（2）以实验室保存的犬巴贝斯虫、韦氏巴贝斯虫、罗氏巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫和康氏巴贝斯虫阳性犬基因组DNA为模板进行扩增，PCR反应体系为：

反应条件为94℃预变性5min，然后94℃ 30S、55℃ 30S、72℃1min，35个循环，72℃延伸7min。取5μL扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒（zymo）进行纯化回收，将回收的DNA片段与pClone007-T载体进行连接，反应体系如下：

配制完成后置于25℃进行1h。

（3）pClone007-T连接产物的转化以及PCR鉴定

(a) -80℃的超低温冰箱中取出DH5α感受态细胞，置于冰上融化。

(b)取连接产物10μL加入100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30min。

(c)42℃热激90s，置冰上2min。

(d)加入不含抗生素的LB液体培养基1mL，37℃ 150转，培养90min。

(e)取100μL涂布于氨苄抗性的LB平皿上，37℃倒置培养过夜。

(f)从平板上挑取单克隆菌落于500μl氨苄抗性的LB液体培养基的1.5mL EP管中，37℃ 220rpm振荡培养5-6小时。

(g)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到5ml的LB液体培养基中进行扩摇。

（4）鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用NanoDrop 2000/2000C（ThermoScientific，America）超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μL，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0×10⁷-1.0×10¹拷贝/μL，以便进行敏感性测试。

2、高分辨率溶解曲线方法的反应性和灵敏度测试

（1）HRM-PCR扩增时所用反应体系和反应条件

PCR反应体系为20μL：

PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环。HRM分析： 95℃ 60s； 40℃ 60sec；70-85℃收集数据，温度上升速率为0.2℃/s。

扩增所用引物序列如下：

上游引物：Canis -F 5'- GTGACAAGAAATAACAATAC-3'

下游引物：Canis -R 5'-CCAGACTTGCCCTCCAATTG-3'

（2）灵敏度实验

利用上述所建立的高分辨率熔解曲线方法，每个样品三个重复分别检测犬巴贝斯虫、韦氏巴贝斯虫、罗氏巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫和康氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒。取不同稀释浓度1.0×10⁷-1.0×10¹拷贝/μL的质粒标准品进行灵敏度试验。

PCR扩增时的反应体系为：

PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环。

HRM分析的条件为：95℃ 60s；40℃ 60s；70-85℃收集数据，温度上升速率为0.2℃/s。

结果参照图1，扩增曲线显示质粒浓度为1.0×10⁷拷贝/μL至1.0×10¹拷贝/μL，均能够很好地扩增，表明该HRM方法具有很好的扩增反应性。

分别对犬巴贝斯虫、韦氏巴贝斯虫、罗氏巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫和康氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒浓度为1.0×10⁷拷贝/μL、1.0×10⁴拷贝/μL和1.0×10¹拷贝/μL扩增产物进行溶解曲线分析，标准质粒溶解曲线（图2）结果显示，不同浓度的质粒扩增产物的溶解曲线具有良好的拟合性，该方法能同时进行五种巴贝斯虫种的鉴定和检测。

（3）HRM重复性

犬巴贝斯虫、韦氏巴贝斯虫、罗氏巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫和康氏巴贝斯虫18sRNA质粒浓度为1.0×10⁷、 1.0×10⁴和1.0×10¹拷贝/μL的标准品进行PCR扩增和溶解曲线分析。对同一批次稀释的标准品，每个浓度重复三次。然后再进行3个不同时间的稀释的标准品进行溶解曲线分析，反复重复该实验三次，同一虫种不同浓度质粒的溶解曲线均能够很好地重合，说明其检测结果稳定，具有良好的重复性。

（4）HRM方法对已知背景样本的鉴别检测

利用建立的HRM方法对经过测序鉴定为梨形虫阳性的犬基因组DNA样本进行HRM分析，与重组阳性质粒的熔解曲线对照比较，依此确定样本中的虫种类型。数据显示16例（图3）样本中犬巴贝斯虫3例、吉氏巴贝斯虫2例、韦氏巴贝斯虫3例、罗氏巴贝斯虫3例、康氏巴贝斯虫5例，测序结果与本发明方法检测的结果完全一致（图4）。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种检测犬巴贝斯虫试剂盒及检测方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增上游引物Canis -F)

<400> 1

gtgacaagaa ataacaatac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增下游引物Canis -R)

<400> 2

ccagacttgc cctccaattg 20

<210> 3

<211> 1405

<212> DNA

<213> 标准犬巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babesia canis canis)

<400> 3

taattgtagg gctaatacac gtttgtggtc ttttgaccgc gtttattagt ttgaaacccg 60

ccttggcttt cggtgattca taataaactg gcgaatcgca tttagcgatg gaccattcaa 120

gtttctgacc catcagcttg acggtagggt attggcctac cgaggcagca acgggtaacg 180

gggaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagagac ggctaccaca tctaaggaag 240

gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcctga cacagggagg tagtgacaag aaataacaat 300

acagggcgaa tgtcttgtaa ttggaatgat ggtgacccaa accctcacca gagtagcaat 360

tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaattccag ctccaatagc gtatattaaa 420

cttgttgcag ttaaaaagct cgtagttgta tttttgcgtt agcggtttga ccatttggtt 480

ggttatttcg ttttcgcttt tgggaatttc cctttttact ttgagaaaat tagagtgttt 540

caagcagact tttgtcttga atacttcagc atggaataat agagtaggac tttggttcta 600

ttttgttggt tattgaacct tagtaatggt taataggaac ggttgggggc attcgtattt 660

aactgtcaga ggtgaaattc ttagatttgt taaagacgaa ctactgcgaa agcatttgcc 720

aaggacgttt ccattaatca agaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc 780

gtagtcctaa ccataaacta tgccgactag tgattggagg tcgtcgtttt ttgacccctt 840

caagaacttg agagaaatca aagtctttgg gttctggggg gagtatgatc gcaaggctga 900

aacttaaagg aattgacgga agggcaccac caggcgtgga gcctgcggct taatttgact 960

caacacgggg aaactcacca ggtccagaca aacggtagga ttgacagatt gatagctctt 1020

tcttgattct ttgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctggt 1080

taattccgtt aacgaacgag accttaacct gctaactagt gccggttatt tgagtttccg 1140

gttgcttctt agagggactt tggggcgcta agccctgagg aagtttaagg caataacagg 1200

tctgtgatgc ccttagatgt cctgggctgc acgcgcgcta cactgatgca ttcatcgagt 1260

ttattccttg gccgagaggt ctaggtaatc tttagtatgc atcgtgacgg ggattgattt 1320

ttgtaattct aaatcatgaa cgaggaatgc ctagtatgcg caagtcatca gcttgtgcag 1380

attacgtccc tgccctttgt acaca 1405

<210> 4

<211> 1404

<212> DNA

<213> 标准韦氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babesia canis vogeli)

<400> 4

taattgtagg gctaatacac gtttgaggtc ttttgaccgc gtttattagt ttgaaacccg 60

ccttggcttt cggtgattca taataaactg gcgaatcgca tttagcgatg gaccattcaa 120

gtttctgacc catcagcttg acggtagggt attggcctac cgaggcagca acgggtaacg 180

gggaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagagac ggctaccaca tctaaggaag 240

gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcctga cacagggagg tagtgacaag aaataacaat 300

acagggctaa tgtcttgtaa ttggaatgat ggtgacccac accctcacca gagtagcaat 360

tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaattccag ctccaatagc gtatattaaa 420

cttgttgcag ttaaaaagct cgtagttgaa ttttagcgtg ttcgagtttg ccattcgttt 480

ggctttttcg agttcgcttt tgggttttcc ctttttactt tgagaaaatt agagtgtttc 540

aagcagactt ttgtcttaaa tacttcagca tggaataata gagtaggact ttggttctat 600

tttgttggtt attgaacctt agtaatggtt aataggaacg gttgggggca ttcgtattta 660

actgtcagag gtgaaattct tagatttgtt aaagacgaac tactgcgaaa gcatttgcca 720

aggacgtttc cattaatcaa gaacgaaagt taggggatcg aagacgatca gataccgtcg 780

tagtcctaac cataaaccat gccgactagt gattggaggt cgtcgttttg ctgacccctt 840

caggagcttg agagaaatca aagtctttgg gttctggggg gagtatggtc gcaaggctga 900

aacttaaagg aattgacgga agggcaccac caggcgtgga gcctgcggct taatttgact 960

caacacgggg aaactcacca ggtccagaca aacggtagga ttgacagatt gatagctctt 1020

tcttgattct ttgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctggt 1080

taattccgtt aacgaacgag accttaacct gctaactagc ggcggttact gtggtttccg 1140

gttgcttctt agagggactt tggggctcta agccctgagg aagtttaagg caataacagg 1200

tctgtgatgc ccttagatgt cctgggctgc acgcgcgcta cactgatgca ttcatcgagt 1260

tgtcccttgg ccgagaggtc ttggtaatct ttagtatgca tcgtgacggg gattgatttt 1320

tgcaattcta aatcatgaac gaggaatgcc tagtatgcgc aagtcatcag cttgtgcaga 1380

ttacgtccct gccctttgta caca 1404

<210> 5

<211> 1400

<212> DNA

<213> 标准罗氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒重组质粒(Babesia canis rossi)

<400> 5

tagggctaat acacgttgga ggccttttgg ccgcgtttat tagtttgaaa cctccgcttg 60

gttttcggtg attcataata aacttgcgaa tcgcttttag cgatggacca ttcaagtttc 120

tgacccatca gcttgacggt agggtattgg cctaccgagg cagcaacggg taacggggaa 180

ttagggttcg attccggaga gggagcctga gagacggcta ccacatctaa ggaaggcagc 240

aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg acaagaaata acaatacagg 300

gctaatgtct tgtaattgga atgatggtga cttaaaccct caccagagta gcaattggag 360

ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaacttgt 420

tgcagttaaa aagctcgtag ttgtattttt gcttggcggt ttgttgcctt tgtggctgta 480

tcccgcttgg cttttggctt tttgccttat tactttgaga aaattagagt gtttcaagca 540

gacttttgtc ttgaatactg tagcatggaa taatagagta ggactttggt tctattttgt 600

tggtttggga accttggtaa tggttaatag gaacggttgg gggcattcgt atttaactgt 660

cagaggtgaa attcttagat ttgttaaaga cgaactactg cgaaagcatt tgccaaggac 720

gtttccatta atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtc 780

ctaaccataa actatgccga ctagtgattg gaggtcgtcg tttgtttgac cccttcagga 840

gcttgagaga aatcaaagtc tttgggttct ggggggagta tggtcgcaag gctgaaactt 900

aaaggaattg acggaagggc accaccaggc gtggagcctg cggcttaatt tgactcaaca 960

cggggaaact caccaggtcc agacgaacgg taggattgac agattgatag ctctttcttg 1020

attctttggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt 1080

ccgttaacga acgagacctt aacctgctaa ctagcgctgg ttacttggtt tcccgctgct 1140

tcctagaggg actttggggc ttgaagctcc aaggaagatt aaggcaataa caggtctgtg 1200

atgcccttag atgtcctggg ctgcacgcgc gctacactga tgcattcatc gagtgttgcc 1260

cctggccgag aggtctgggt aatctttagt atgcatcgtg acggggattg atttttgtaa 1320

ctctaaatca tgaacgagga atgcctagta tgcgcaagtc atcagcttgt gcagattacg 1380

tccctgccct ttgtacacac 1400

<210> 6

<211> 1293

<212> DNA

<213> 标准康氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babesia conradae)

<400> 6

taaccgtgct aattgtaggg ctaatacatg atcgaggtcc ttctggactg cgtttattag 60

actcgaaacc ttcccgcttc ggcggttccc ggtgattcat aataaacagc gaatcgcatg 120

gcttttgccg gcgataattc attcaagttt ctgatctatc agctttggac ggtagggtat 180

tggcctaccg gggcagcgac gggtaacggg gaattagggt tcgattccgg agagggagcc 240

tgagaaacag ctaccacatc taaggaaggc agcaggcgcg caaattaccc aatacggaca 300

ccgtgaggta gtgacaagaa ataacaatac agggctttaa gctttgtaat tggaatgatg 360

ggaatccaaa ccccttccag agtatcaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg 420

taattccagc tccaatagcg tatattaaat ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac 480

ttctgccgcc gggacttcgt tcccttcggg gcttcgtttt ctcggtggca tccctctggt 540

taatttgggc ctcggccctc tttttccagt ttttactttg agaaaattag agtgtttcaa 600

gcaggctctt gccttgaata cttcagcatg gaataataaa gtaggacttt ggttctattt 660

tgttggtttc aggaccaaag taatggttaa taggagcagt tgggggcatt cgtatttaac 720

tgtcagaggt gaaattctta gatttgttaa agacgaacta ctgcgaaagc atttgccaag 780

gatgttttca ttaatcaaga acgaaagtta ggggctcgaa gacgatcaga taccgtcgta 840

gtcctaacta taaactatgc cgactagaga ttggaggtcg tcattttaaa cgactccttc 900

agcaccttga gagaaatcaa agtctttggg ttctgggggg agtatggtcg caaggctgaa 960

acttaaagga attgacggaa gggcaccacc aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc 1020

aacacgggga acctcaccag gtccagacat agttaggatt gacagattga tagctctttc 1080

ttgattctat gggtagtggt gcatggccgt tcttagttgg tggagtgatt tgtctggtta 1140

attccattaa cgaacgagac cttaacctgc taaatagcag ctgagaataa actttgttgt 1200

tttcagcatt gcttcttaga gggactttgc ggtcataaat cgcaaggaag tttaaggcaa 1260

taacaggtct gtgatgccct tagatgtcct ggg 1293

<210> 7

<211> 1403

<212> DNA

<213> 标准吉氏巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babesia gibsoni)

<400> 7

taattgtagg gctaatacaa gttcgaggcc tttttggcgg cgtttattag ttctaaacct 60

cccttggttt tcggtgattc ataataaact cgcgaatcgc ttttagcgat ggaccattca 120

agtttctgac ccatcagctt gacggtaggg tattggccta ccgaggcagc aacgggtaac 180

ggggaattag ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac atctaaggaa 240

ggcagcaggc gcgcaaatta cccaatcctg acacagggag gtagtgacaa gaaataacaa 300

tacagggcaa ttgtcttgta attggaatga tggtgacgta aaatctcacc agagtaacaa 360

ttggagggca agtctggtgc cagcagccgc ggtaattcca gctccaatag cgtatattaa 420

acttgttgca gttaaaaagc tcgtagttga atttctgcgt tgcccgactc ggctacttgc 480

cttgtctggt ttcgcttttg gggttttccc ctttttactt tgagaaaatt agagtgtttc 540

aagcagactt gtgtcttgaa tacttcagca tggaataata aagtaggact ttggttctat 600

tttgttggtt tgtgaacctt agtaatggtt aataggaacg gttgggggca ttcgtattta 660

actgtcagag gtgaaattct tagatttgtt aaagacgaac tactgcgaaa gcatttgcca 720

aggacgtttt cattaatcaa gaacgaaagt taggggatcg aagacgatca gataccgtcg 780

tagtcctaac cataaaccat gccgactagg gattggaggt cgtcattttt cgactccttc 840

agcaccttga gagaaatcaa agtctttggg ttctgggggg agtatggtcg caaggctgaa 900

acttaaagga attgacggaa gggcaccacc aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc 960

aacacgggga aactcaccag gtccagacaa agttaggatt gacagattga tagctctttc 1020

ttgattcttt gggtggtggt gcatggccgt tcttagttgg tggagtgatt tgtctggtta 1080

attccgttaa cgaacgagac cttaacctgc taactagttg ccgttatttc agtttcggcc 1140

agcttcttag agggactttg gggctctaag ccacaaggaa gattaaggca ataacaggtc 1200

tgtgatgccc ttagatgtcc tgggctgcac gcgcgctaca ctgatgcatt catcgagtgt 1260

tatccctggc cgagaggtcc gggtaatctt tagtatgcat cgtgacgggg attgattttt 1320

gtaattctaa atcatgaacg aggaatgcct agtatgcgca agtcatcagc ttgtgcagat 1380

tacgtccctg ccctttgtac aca 1403

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增上游引物PIRO-F140)

<400> 8

ccatggataa ccgtgctaat tg 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增上游引物PIRO- R1380)

<400> 9

catctaaggg catcacagac c 21

Claims

1.一种检测犬巴贝斯虫试剂盒，其特征在于检测试剂盒中至少包括有序列为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2的两条扩增引物。

2.根据权利要求1所述的检测犬巴贝斯虫试剂盒，其特征在于检测试剂盒中还有含EvaGreen荧光染料qPCRMaster Mix的预混溶液。

3.根据权利要求1或2所述的检测犬巴贝斯虫试剂盒，其特征在于检测试剂盒中还有标准阳性质粒模板、阴性标准品。

4.非疾病检测目的的犬巴贝斯虫检测方法，其特征在于提取将待检测样品的DNA，再将所得到的待检DNA用权利要求1至3所述的试剂盒中的扩增引物进行扩增，再将扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析，将所得到的待检测样品高分辨率溶解曲线与标准的感染犬的巴贝斯虫熔解曲线进行对比，得到待检样品是否感染及感染何种犬巴贝斯虫。