CN112326762B - 一种毛细管电泳检测dna四面体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物分析领域，具体公开了一种毛细管电泳检测DNA四面体的方法。首先将4条DNA单链等摩尔浓度混合，经过变性过程，形成DNA四面体结构。接着通过毛细管电泳‑荧光检测技术，以线性聚丙烯酰胺作为筛分介质，经荧光光谱仪对DNA四面体及其它DNA链实现在线检测。上述技术方案操作简单，可重复性高，建立了一种新型高灵敏的DNA四面体检测方法。

Description

一种毛细管电泳检测DNA四面体的方法
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体公开了一种毛细管电泳检测DNA四面体的方法。
背景技术
DNA四面体不仅可以作为药物、核酸、酶等多种物品的载体，而且还可以用于特定分子的生物检测，在各种生物科技领域，特别是在纳米医学领域，具有广阔的应用前景。现今常用于验证和表征DNA四面体成功构建的方法有：凝胶电泳、原子力显微镜和透射电子显微镜等，但这些方法操作繁琐、耗费样品较多而且价格昂贵，在微量样品检测方面有较大的局限性。
毛细管电泳作为一种快速有效、高灵敏、低样品消耗的技术，在生物分析领域受到了科研工作者的广泛关注。同时，将荧光检测与毛细管电泳相结合用于生物分析，大大扩宽了毛细管电泳技术的应用范围。
荧光检测与毛细管电泳结合通常用于生物分析目前主要体现在以下几方面：生物分子(DNA、蛋白质)的分离；FERT效应研究；生物分子相互作用研究。存在问题：毛细管电泳-荧光检测主要用于DNA的分离，较少有研究用于DNA纳米粒的分离，并且对于分析的重现性仍需要进一步提高。
将DNA四面体与DNA链分离常用的方法为琼脂糖凝胶电泳，但该方法操作更为复杂，不易于实现精确定量，且消耗电泳液相较于毛细管电泳法更多。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术无法微量、便捷检测DNA四面体的问题，提供了一种荧光毛细管电泳检测DNA四面体的方法，通过向毛细管电泳的检测缓冲液中加入筛分介质将DNA四面体与其他DNA链检测开，从而实现对DNA四面体的检测。
为解决其技术问题本发明所采用的技术方案是：首先选择组成DNA四面体的DNA单链，其中，链4在5’端带有荧光染料修饰；将得到的DNA单链溶解于TM缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，使DNA单链的浓度为100μM。再将形成DNA四面体的四条单链等摩尔浓度混合在TM buffer中，配成DNA单链的终浓度为2μM的样品，在95℃下变性10min，随后迅速降温到4℃，保持3h，获得DNA四面体结构；将获得的DNA四面体结构的溶液与其他DNA链混合均匀，得到DNA四面体与其他DNA链的混合物；最后利用毛细管电泳检测，在毛细管电泳的检测缓冲液中加入筛分介质。
DNA四面体的四条单链序列分别为:
S1:5’-AGG CAG TTG AGA CGA ACA TTC CTA AGT CTG AAA TTT ATC ACC CGC CATAGT AGA CGT ATC ACC-3’
S2:5’-CTT GCT ACA CGA TTC AGA CTT AGG AAT GTT CGA CAT GCG AGG GTC CAATAC CGA CGA TTA CAG-3’
S3:5’-GGT GAT AAA ACG TGT AGC AAG CTG TAA TCG ATT TTA ATG CCA AAG ACACTC GCT ACA TTG GCA TAA ATA ACT ACT ATG GCG-3’
S4:FAM-5’-TAA AAA CGG TAT TGG ACC CTC GCA TGA CTC AAC TGC CTG GTG ATACGA TAT TT-3’
互补链DNA序列为：
S5:TGT AGC GAG TGT CTT TGG CAT ACT TGA TCA
S6:AAA TAT CGT ATC ACC AGG CAG TTG AGT CAT GCG AGG GTC CAA TAC CGTTTT TA。
荧光染料为FAM，TAMRA或者ATTO中的一种。
毛细管电泳检测电压12-20kV；检测缓冲液pH值8.3-10.3；缓冲液浓度15-35mM。
筛分介质为线性聚丙烯酰胺、纤维素类材料(羟乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素)。
线性聚丙烯酰胺的浓度为0.2-0.6％，优选0.4％；合成温度4-50℃，优选为25℃。
采用上述的技术方案后，本发明取得的有益效果：本发明提供的用于检测DNA四面体的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了毛细管电泳技术的应用。
附图说明
图1：线性聚丙烯酰胺浓度对DNA四面体检测的影响。其中，LPA浓度a，0；b，0.2％；c，0.3％；d，0.4％；e，0.5％；f，0.6％。
图2：线性聚丙烯酰胺合成温度对DNA四面体检测的影响。其中，合成温度a，4℃；b，25℃；c，50℃。
图3：缓冲液pH值对DNA四面体检测的影响。其中，缓冲液pH值a，8.3；b，9.3；c，10.3。
图4：缓冲液浓度对DNA四面体检测的影响。其中，缓冲液浓度a，15mM；b，20mM；c，25mM；d,30mM；e,35mM。
图5：检测电压对DNA四面体检测的影响。其中，检测电压a，12kV；b，16kV；c，20kV。
图6：不同DNA链与DNA四面体等比例混合后的电泳图。其中，a，单链4与DNA四面体的混合物；b，双链(链1+链4)与DNA四面体的混合物；c，双链(链2+链4)与DNA四面体的混合物；d，双链(链3+链4)与DNA四面体的混合物。
图7：利用单标记的DNA链，在加入不同浓度的完全互补链6后的电泳图。其中，a，仅DNA四面体；DNA四面体与互补链的摩尔比：b，5：1；c，5：2；d，5：3；e，5：4；f，1：1。
图8：DNA四面体浓度与峰面积的线性图。
图9：利用双标记的DNA链，在加入不同浓度的互补链后的电泳图；完全互补链6；其中，a，仅DNA四面体；DNA四面体与互补链的摩尔比：b，5：1；c，5：2；d，5：3；e，5：4；f，1：1。(虚线，520nm，FAM为FRET能量供体通道；实线，588nm，TAMRA为FRET能量受体通道)。
图10：利用双标记的DNA链，在加入不同浓度的互补链后的电泳图；部分互补链5；其中，a，仅DNA四面体；DNA四面体与互补链的摩尔比：b，5：1；c，5：2；d，5：3；e，5：4；f，1：1。(虚线，520nm，FAM为FRET能量供体通道；实线，588nm，TAMRA为FRET能量受体通道)。
具体实施方式
本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。
实施例1
1、DNA四面体的合成：
将购买的(生工(上海，中国))DNA单链(S1,S2,S3,S4)用离心机(8000r/min，3min)离心，然后加入TM缓冲液，使DNA单链的浓度为100μM。将形成DNA四面体的四条单链等摩尔浓度混合在TM buffer中，配成DNA单链的终浓度为2μM的样品；将配好的样品在95℃水浴锅中加热10min，然后迅速降温到4℃，并在4℃冰箱中保持3h，即可得到DNA四面体结构。
2、线性聚丙烯酰胺的合成：
称取5g的丙烯酰胺配制成50mL溶液，超声15min；向50mL的丙烯酰胺溶液中加入16μL四甲基乙二胺，迅速加入10％过硫酸铵溶液180μL，均匀搅拌，超声15min后密封，一定温度(4℃，25℃，50℃)下聚合24小时。
3、取一定体积的DNA四面体与等体积的双链或单链混合均匀(2μM)，得到两者的混合物。
4、毛细管电泳检测：
采用无涂层的石英毛细管，有效长度35cm(总长60cm，内径75μm)，检测缓冲液为25mM硼酸缓冲溶液(pH 9.3，含一定浓度的线性聚丙烯酰胺)，通过16kV的高压电源使待测样品在毛细管内流动。将DNA四面体与双链(链1+链4)混合样品用荧光毛细管电泳检测。并且对筛分剂线性聚丙烯酰胺的浓度以及其制备条件进行优化，考察了筛分剂浓度和合成温度对DNA四面体检测的影响。在一定时间范围内，通过毛细管电泳可以将DNA四面体与双链(链1+链4)检测开。从电泳图中可以看出，随着线性聚丙烯酰胺浓度的增加，DNA四面体的检测度增加，但较高浓度下电泳峰的柱效降低，0.4％作为最佳筛分浓度(图1)。此外，对线性聚丙烯酰胺的合成温度也进行了优化，在室温下制备获得的线性聚丙烯酰胺对DNA四面体及双链(链1+链4)具有最好的拆分效能(图2)。
实施例2
按照实施例1的方法，选用最佳筛分剂浓度及制备条件，分别对其它各电泳条件进行了摸索，并在最优条件下对DNA四面体和多种类DNA链，包括：单链4，双链(链1+链4)，双链(链3+链4)进行了检测。首先以DNA四面体和双链(链1+链4)为例进行考察。从图3可以看出，随着缓冲液pH值的增加DNA的迁移时间减少，推测是由于较高的pH值会促进毛细管内壁的负电荷量增加，电渗流增大。当pH值为9.3时，可实现较好的检测。在最优的缓冲液pH值条件下，选用不同的缓冲液浓度15,20,25,30和35mmol L-1，当浓度为25mmol L-1时可得到最大的检测度2.46(图4)。实验发现随着检测电压的降低，检测度增加，但当电压为12kV时柱效较低，因此选择16kV为最佳检测电压(图5)。在以上优化获得的最佳电泳条件下，对DNA四面体与单链4，双链(链1+链4)，双链(链3+链4)进行了检测(图6)。结果证明所构建的毛细管电泳体系可对DNA四面体与不同种类DNA链实现良好检测。
实施例3
按照实施例1的方法，利用单标记的链4合成DNA四面体，合成过程中加入链4的互补链以干扰四面体的合成，会产生链4与链6互补配对形成的双链。采用毛细管电泳法进行检测，可分别测定DNA四面体与DNA双链的峰。如图7，随着加入链6浓度的增加，DNA四面体的峰面积减小，由此可证明DNA四面体的成功合成。由于加入互补链6后产生了新的峰，推测链6能够用于DNA四面体结构的破坏。进一步验证了实施例1的推论。
实施例4
按照实施例1的方法，将形成DNA四面体的四条单链等比例混合在TM buffer中，配成不同浓度的样品。将配好的样品在95℃水浴锅中加热10min，然后迅速降温到4℃，并在4℃冰箱中保持3h，即可得到不同浓度(1μM，2μM，3μM，4μM，5μM)的DNA四面体结构。测定此一系列浓度梯度的DNA四面体的荧光强度，根据所得荧光强度绘制标准曲线，得到线性方程(图8)。因此，所构建的毛细管电泳体系可同时用于DNA四面体的检测与定量。
实施例5
按照实施例1的方法，利用DNA单链的5’端有6’-FAM修饰，3’端有TAMRA修饰合成含有双荧光标记的DNA四面体。利用FRET效应，可以快捷检测DNA四面体的合成。结果表明，DNA四面体结构能发生FRET效应，而在加入不同浓度的互补链6后，由于其与链4互补形成双链，致使DNA四面体结构被破坏，FRET效应慢慢减弱(图9)。当合成DNA四面体时加入的是部分互补链5时，随着链5浓度的增加，四面体的FRET效应也减弱(图10)。而在相同浓度下，链5对于四面体FRET效应的影响相较于链6更为明显。推测原因为链5更易与链3杂化，从而嵌入四面体结构中引起FAM与TAMRA的分离，而链6与链4的杂化受到了链1，2，3竞争性的影响。从结果可以看出，毛细管电泳-荧光检测技术为DNA四面体FRET的研究提供了有效的分析平台。
通过上述实施例可以看出，通过毛细管电泳技术可以有效快速地检测DNA四面体。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (6)

1.一种毛细管电泳检测DNA四面体的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
步骤1：选择组成DNA四面体的DNA单链，其中，链4在5’端带有荧光染料修饰；
所述DNA四面体的四条单链序列分别为:
S1: 5’-AGG CAG TTG AGA CGA ACA TTC CTA AGT CTG AAA TTT ATC ACC CGC CATAGT AGA CGT ATC ACC-3’
S2: 5’-CTT GCT ACA CGA TTC AGA CTT AGG AAT GTT CGA CAT GCG AGG GTC CAATAC CGA CGA TTA CAG-3’
S3: 5’-GGT GAT AAA ACG TGT AGC AAG CTG TAA TCG ATT TTA ATG CCA AAG ACACTC GCT ACA TTG GCA TAA ATA ACT ACT ATG GCG-3’
S4: FAM-5’-TAA AAA CGG TAT TGG ACC CTC GCA TGA CTC AAC TGC CTG GTG ATACGA TAT TT-3’；
步骤2： 将步骤1所述的DNA单链溶解于TM缓冲液中，再将形成DNA四面体的四条单链等摩尔浓度混合在TM buffer中，在95 ℃下变性10 min，随后迅速降温到4 ℃，保持3 h，获得DNA四面体结构的溶液；
步骤3：将步骤2所述的DNA四面体结构的溶液与其他DNA链混合均匀，得到DNA四面体与其他DNA链的混合物；
步骤4：毛细管电泳检测：将步骤3所述的混合物用毛细管电泳荧光检测，并在毛细管电泳的检测缓冲液中加入筛分介质；
所述的筛分介质为线性聚丙烯酰胺、纤维素类材料。
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测DNA四面体的方法，其特征在于：步骤1所述的荧光染料为FAM，TAMRA或者ATTO中的一种。
3.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测DNA四面体的方法，其特征在于：步骤2所述的DNA单链在TM buffer中的终浓度为2 μM。
4.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测DNA四面体的方法，其特征在于：步骤4所述的毛细管电泳检测电压12 -20 kV；检测缓冲液pH值8.3-10.3；缓冲液浓度15 -35 mM。
5.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测DNA四面体的方法，其特征在于：步骤4筛分介质线性聚丙烯酰胺的浓度为0.2-0.6%；合成温度为4-50 ℃。
6.根据权利要求1所述的毛细管电泳检测DNA四面体的方法，其特征在于：步骤4筛分介质线性聚丙烯酰胺的浓度为0.4%；合成温度为25 ℃。
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