CN104140953B

CN104140953B - 一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN104140953B
Application number: CN201410183516.4A
Authority: CN
Inventors: 李敏; 张丽菡; 田莉; 张春雨
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2014-05-04
Filing date: 2014-05-04
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2034-05-04
Also published as: CN104140953A

Abstract

本发明提供一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株，其保藏编号为：CCTCC C201439。本发明还提供了其构建方法。本发明成功建立了MDA‑MB‑231/EPI耐药株，耐药指数为26.27倍，对紫杉醇、依托泊苷、顺铂产生了明显的交叉耐药性。为以下相关研究提供耐药肿瘤细胞模型：研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤多药耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更有效的肿瘤治疗方法等。

Description

一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据统计，全球每年乳腺癌的发病人数约有120万人，约50万人死于乳腺癌。乳腺癌属全身性疾病，综合治疗非常关键，其中化疗是不可替代的重要手段之一。然而多药耐药常导致治疗失败及后期肿瘤的复发和转移，严重威胁患者生存。肿瘤细胞在化疗中产生的耐药性常表现为多药耐药，即同时对多种结构和作用机制不同的化疗药物产生交叉耐药的现象，它是化疗失败的主要原因。近年来，肿瘤耐药细胞株已成为重要的工具，大量研究利用它来揭示肿瘤细胞的耐药机制、研究肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等，建立肿瘤耐药细胞株具有重要应用价值。

蒽环类（阿霉素、表柔比星）为主的乳腺癌化疗方案（CAF/CEF）是目前国际最常用的联合化疗方案。但是，由于阿霉素对心脏有累积的、浓度依赖性的慢性毒性，其使用及治疗剂量常受限制，因此也在一定程度上影响了阿霉素的疗效。表柔比星（表阿霉素，Epirubicin）是阿霉素的同分异构体，其氨基糖链4^，端羟基发生变形。表柔比星的抗肿瘤效果与阿霉素相当甚至更好，而其细胞毒性和心脏损害都明显降低，将表柔比星使用较大剂量用于一线治疗后，其乳腺癌治疗的有效率可达60%以上，高于多柔比星的有效率（24%~38%）。所以目前临床上大量使用表柔比星代替阿霉素而作为乳腺癌的基础化疗用药。

表柔比星（表阿霉素，Epirubicin）是蒽环类抗肿瘤抗生素中的一种代表性药物，为阿霉素的同分异构体，是一种细胞周期非特异性药物，对多种转移性肿瘤均有疗效。其作用机制有两个：一、通过嵌入DNA碱基对之间干扰其转录过程，使mRNA的形成受抑制，从而阻止DNA和RNA的合成。二、对拓扑异构酶Ⅱ（topoisomerase type Ⅱ）的活性有抑制作用，从而导致基因组DNA的崩解。

MDA-MB-231细胞是乳腺癌细胞株，是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的，是研究乳腺癌很常用的一种细胞株。国内外建立乳腺癌对阿霉素的耐药细胞株已经很常用，而表柔比星的耐药细胞株仍较少见。本发明是首次建立MDA-MB-231细胞对表柔比星的耐药细胞株，建立乳腺癌对表柔比星耐药细胞株能够为肿瘤耐药相关研究提供必要的研究模型，具有实用价值。

中国专利CN101503675中提出：肿瘤耐药细胞株的建立通常有两种方法，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击间断给药法。国内外均有研究对这两种方法进行了比较，认为不同诱导方式可能获得不同耐药机理的耐药细胞株，同时也可能影响肿瘤细胞耐药程度，持续诱导比冲击诱导更易产生耐药性。持续诱导法以肿瘤细胞最终能在特定浓度化疗药物中稳定生长作为诱导成功的判定标准，细胞耐药性稳定、直观，因此本发明主要采用该法来诱导耐药细胞的产生。

肿瘤细胞耐药程度的判定常用耐药指数（resistant index, RI)来表示，RI是耐药细胞半数抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC50)与亲代细胞半数抑制浓度的比值。Snow等按耐药指数的高低将耐药性分为低度（< 5)、中度(5-15)、高度（> 15)。

发明内容

本发明提供了一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株。

本发明提供的一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株：人乳腺癌表柔比星耐药细胞株MDA-MB-231/EP1，其保藏编号为：CCTCC C201439。

保藏日期：2014年4月4日；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection)；

保藏单位简称：CCTCC；

保藏单位地址：中国武汉市武汉大学；

保藏编号：CCTCC C201439。

本发明的第二个目的是提供一种乳腺癌多药耐药性细胞株的构建方法：

1.将人乳腺癌MDA-MB-231细胞株常规培养于含有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于37℃、5% C0₂、95%湿度培养箱中维持培养；

2.培养至70%-90%贴壁率时，弃上清，加入表柔比星，使其作用浓度为0.05-0.07mg/l，在37℃、5% C0₂、95%湿度条件下继续培养，24小时后换入新鲜的培养液，继续培养，历经6-8周，细胞稳定生长，传代2次；

3.适当增加表柔比星的作用浓度，在37℃、5% C0₂、95%湿度条件下继续培养，24小时后换入新鲜的培养液，继续培养，历经6-8周，细胞稳定生长，传代2次；

4.重复步骤（3），直到获得能含5.5-6.5mg/l表柔比星的培养体系中稳定生长、传代及复苏的MDA-MB-231/EPI细胞株。

优选地，所述适当增加表柔比星的作用浓度是采用0.05-0.07mg/l、0.1-0.15mg/l、0.2-0.3mg/l、0.4-0.6mg/l、0.8-1.2mg/l、1.8-2.5mg/l、3.5-4.5mg/l、5.5-6.5mg/l这8个浓度梯度。

本发明还提供上述多药耐药性细胞株在耐表柔比星、紫杉醇、依托泊苷、顺铂中的应用。

优选地，所述多药耐药性细胞株耐表柔比星的指数为26.27倍、耐紫杉醇的指数为12.261倍、耐依托泊苷的指数为1.739倍、耐顺铂的指数为3.834倍。

本发明建立了人乳腺癌耐药株MDA-MB-231/EPI，为以下相关研究提供耐药肿瘤细胞模型：研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤多药耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更有效的肿瘤治疗方法等。

本发明通过细胞形态学观察、生长曲线、药物敏感试验、细胞周期、P-gp蛋白表达和功能以及MRP1 mRNA水平检测，评价乳腺癌多药耐药株MDA-MB-231/EPI的生物学特性，结果成功建立了MDA-MB-231/EPI耐药株，耐药指数为26.27倍，对紫杉醇、依托泊苷、顺铂产生了明显的交叉耐药性。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的阐述。

图1是倒置相差显微镜下MDA-MB-231细胞观察图(×100)；

图2是倒置相差显微镜下MDA-MB-231/EPI细胞观察图(×100)；

图3是普通光学显微镜下MDA-MB-231细胞HE染色图(×200)；

图4是普通光学显微镜下MDA-MB-231/EPI细胞HE染色图(×200)；

图5是耐药MDA-MB-231/EPI细胞与亲本细胞MDA-MB-231体积的比较；

图6透射电镜下MDA-MB-231细胞观察图（×5000）；

图7透射电镜下MDA-MB-231/EPI细胞观察图（×5000）；

图8是MDA-MB-231和MDA-MB-231/EPI细胞生长曲线；

图9是流式细胞术检测MDA-MB-231细胞周期图；

图10是流式细胞术检测MDA-MB-231/EPI细胞周期图；

图11是流式细胞术检测MDA-MB-231和MDA-MB-231/EPI细胞p-gp表达；

图12流式细胞术检测细胞内阿霉素的蓄积和排除；

图13流式细胞术检测细胞内Rh123的蓄积和外排；

图14是QRT-PCR检测MDA-MB-231及MDA-MB-231/EPI中MRP1mRNA的水平。

图15 MTT法检测MDA-MB-231及MDA-MB-231/EPI对表柔比星的半数抑制浓度（IC50）；

图16 MTT法检测MDA-MB-231及MDA-MB-231/EPI对紫杉醇、依托泊苷和顺铂作用48h的半数抑制浓度（IC50）；

图17 MTT法检测MDA-MB-231及MDA-MB-231/EPI对紫杉醇、依托泊苷和顺铂作用72h的半数抑制浓度（IC50）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1人乳腺癌多药耐药细胞株MDA-MB-231/EPI的诱导建立

本发明采用逐步递增表柔比星浓度、间歇作用的体外诱导法建立人乳腺癌多药耐药细胞株MDA-MB-231/EPI。具体步骤如下：

1.将人乳腺癌MDA-MB-231细胞株，用DMEM培养液（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml)于37℃、5% C0₂、95%湿度条件下培养；

2.培养至70%-90%贴壁率时，弃上清，加入表柔比星，使其作用浓度为 0.05-0.07mg/l，在37℃、5% C0₂、95%湿度条件下继续培养，24小时后换入新鲜的培养液，继续培养，历经6-8周左右，细胞稳定生长，传代2次；

3.适当增加表柔比星的作用浓度，在37℃、5% C0₂、95%湿度条件下继续培养，24小时后换入新鲜的培养液，继续培养，历经6-8周左右，细胞稳定生长，传代2次；

4.重复步骤（3），直到获得能在5.5-6.5mg/l表柔比星中稳定生长、传代及复苏的MDA-MB-231/EPI细胞株。

在诱导过程中，掌握适当的表柔比星增加浓度非常重要，理想状况是既通过增加药物浓度筛选出少数耐药细胞又不致于使全部细胞死亡，从而不断获得有更高耐药性的MDA-MB-231细胞。在我们的发明中采用0.05-0.07mg/l、0.1-0.15mg/l、0.2-0.3mg/l、0.4-0.6mg/l、0.8-1.2mg/l、1.8-2.5mg/l、3.5-4.5mg/l、5.5-6.5mg/l这8个浓度梯度，取得了较好效果，历12个月建立了MDA-MB-231/EPI耐药株。将该MDA-MB-231/EPI耐药株进行保藏，保藏编号为：CCTCC C201439。

当细胞依次对0.05-0.07mg/l、0.1-0.15mg/l、0.2-0.3mg/l、0.4-0.6mg/l、0.8-1.2mg/l、1.8-2.5mg/l、3.5-4.5mg/l、5.5-6.5mg/l表柔比星稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。冻存液由20%小牛血清、10% DMS0,70% DMEM培养液组成，冻存过程应逐步降温，采取4℃30分钟—-20℃1小时 —-80℃过夜—液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下程序进行：在一个25cm²的细胞培养瓶中加入至少10ml含10%小牛血清的培养液；从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动使冻存物在1分钟内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净台；将解冻后的细胞悬液移入已加了培养液的培养瓶中，稍加摇动混匀，拧松瓶盖，平放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5% C0₂、95%湿度条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液3-5ml继续培养。

实施例2 对应用本发明的方法建立的MDA-MB-231/EPI细胞株进行形态学观察及生物学特性鉴定：

1.形态学观察

1.1倒置相差显微镜观察活细胞形态：取对数生长期MDA-MB-231和MDA-MB-231/EPI细胞各一瓶，换液后在倒置相差显微镜下观察活细胞形态并照像。可见MDA-MB-231细胞呈多角形，形态较一致，细胞内结构均匀（如图1所示）；MDA-MB-231/EPI细胞大小、形态均发生变化，细胞更细长，细胞内尤其是近胞膜处有较多深色物质聚集（如图 2所示）。

1.2 HE染色法观察细胞形态：细胞收集制片后用HE染色光学显微镜观察，耐药株与亲本株比较，细胞形态和体积都有所变化，细胞呈现更明显的长梭形，排列更整齐，细胞体积明显变小；胞核呈现较均一的圆形或椭圆形（图3、图4），核/浆比例明显增大（图5），与亲本株不同，耐药细胞胞核未发现有较成熟的类似分叶核或者杆状核细胞，说明耐药细胞在成熟度和分化程度上较亲本细胞更为幼稚。

1.3电镜观察细胞形态：取对数生长期MDA-MB-231和MDA-MB-231/EPI细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，调整密度约1×10⁵/ml，离心后弃上清，加入2.5%戊二醛固定，送电镜室常规切片，于透射电镜下观察。可见MDA-MB-231细胞表面光滑（如图6所示）；MDA-MB-231/EPI细胞表面微绒毛增多，细胞膜表面积增大，细胞内颗粒物质增多,自噬体大量增加（如图7所示, N:细胞核， n: 核仁，AV: 自噬体，黑箭头：微绒毛。）。

2.测定细胞生长曲线（MTT法）

细胞消化、计数、配制成浓度为1×10³/ml的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔500个细胞)；96孔细胞培养板置于37℃，5%C0₂培养箱中分别培养1day、2 day、3 day、4 day、5 day、6 day、7 day；将96孔板进行MTT染色，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10分钟轻轻地混匀；λ=490nm，酶标仪读出每孔的OD值，以时间为横坐标、OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。MDA-MB-231和MDA-MB-231/EPI的细胞生长曲线见图8，前2天无明显差异，从第3天开始耐药株细胞的生长速度显著低于亲本细胞。表柔比星耐药株MDA-MB-231/EPI在培养过程中可以正常生长及传代，冻存、复苏后不影响其生长。

3.PI染色法检测细胞周期

用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为1×10⁵/ml，收取细胞；用4℃保存的0.0lM PBS洗涤细胞3次，70%乙醇冰上固定5min, 2000rpm室温离心5min,重悬于冷PBS 1ml,备用；用流式细胞仪检测,激发波长为488nm，接收波长为575nm。结果显示，MDA-MB-231细胞G0/G1期、S期、G2/M期细胞分别为71.11%、17.95%、10.94%，MDA-MB-231/EPI细胞G0/G1期、S期、G2/M期细胞分别为 90.04%、8.38%、1.58%，MDA-MB-231/EPI细胞S期、G2/M期细胞减少，G0/G1期细胞明显增多，说明MDA-MB-231/EPI细胞在建模中经表柔比星诱导获得耐药性后，细胞阻滞在G0/G1期，处于慢周期甚至静息状态。结果见图9、图10。具体数据参见表1。

表1 耐药MDA-MB-231/EPI细胞周期分布的改变

。

注：PI染色，FCM检测细胞周期各时相的变化。与MDA-MB-231细胞比较，*P<0.05，**P<0.01。

4.流式细胞术检测p-gp蛋白的表达

取对数生长期MDA-MB-231和MDA-MB-231/EPI细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，调整密度约1×10⁵/ml，加p-gp一抗，PBS洗3次，加二抗，流式细胞术检测荧光强度显示耐药细胞中P-gp蛋白的表达变化，亲本细胞P-gp阳性率是0.57%，而耐药细胞中P-gp阳性率是54.2%，是亲本细胞的95.08倍（如图11）。

5.流式细胞术检测细胞内阿霉素的蓄积和排出

分别收集对数生长期的亲本细胞和耐药细胞，PBS洗涤2次，将细胞重悬于1mlPBS中，

加入ADM使其终浓度达到30mg/L，37℃避光孵育30min，冷PBS洗涤2次后，将细胞分为两部分：一部分细胞重悬于1ml冷PBS中，流式细胞仪检测细胞内ADM的蓄积量（着色阳性率及平均荧光强度）；另一部分细胞置于37℃避光孵育60min，冷PBS洗涤2次后，再次通过流式细胞仪检测细胞内存留的ADM的量（着色阳性率及平均荧光强度）。ADM具有自发荧光，通过检测细胞的荧光强度可判断细胞内ADM的含量。应用流式细胞术检测，当30mg/L的ADM与细胞孵育30min，耐药MDA-MB-231/EPI细胞内ADM的蓄积量（平均荧光强度）仅为亲本MDA-MB-231细胞的75%；继续无药孵育60min，仅33.1%的耐药细胞内可检测到ADM，而且可测到的ADM的含量仅为敏感细胞的22.2%，约有70.5%的ADM被排出细胞外，而亲本细胞几乎无ADM排出。结果见图12。

6.流式细胞术检测细胞内Rh123的蓄积和外排

加入Rh123使其终浓度达到15mg/L，37℃避光孵育30min，冷PBS洗涤2次后，将细胞分为两部分：一部分细胞重悬于1ml冷PBS中，流式细胞仪检测细胞内Rh123的蓄积量（着色阳性率及平均荧光强度）；另一部分细胞置于37℃避光孵育60min，冷PBS洗涤2次后，再次通过流式细胞仪检测细胞内存留的Rh123的量（着色阳性率及平均荧光强度）。Rh123是由线粒体吸收的阳离子亲脂染料，同时也是P-gp特异性的荧光底物，可被P-gp主动从细胞内泵出，其在细胞内的积聚量和外排量反映P-gp的功能和活性。流式细胞术的检测结果显示，当15mg/L的Rh123与细胞孵育30min，耐药MDA-MB-231/EPI细胞内Rh123的蓄积量（平均荧光强度）仅为亲本MDA-MB-231细胞的69%；继续无药孵育60min，仅8.17%的耐药细胞内可检测到Rh123，而且可测到的Rh123的含量仅为敏感细胞的35%，约有65%的Rh123被排出细胞外，而亲本细胞仅有30%的Rh123排出。结果见图13。

7.QRT-PCR检测MRP1mRNA的水平

用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为1×10⁵/ml，收取细胞，提取RNA，反转录cDNA，扩增后送检。采用实时荧光定量RT-PCR检测细胞mrp1耐药基因的表达，结果显示，耐药细胞MDA-MB-231/EPI中mrp1基因mRNA的表达量是亲本细胞的53.74倍（如图14）。

8.药物敏感试验

细胞消化、计数、配制成浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔1×10⁴个细胞)；96孔细胞培养板置于37℃，5%C0₂培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔换入200μL相应的含药培养基，96孔细胞培养板置于37℃，5%C0₂培养箱中培养24小时；将96孔板进行MTT染色，λ=490nm,测定OD值；如图15所示，随着表柔比星浓度逐渐增高、诱导时间延长，诱导的MDA-MB-231细胞对表柔比星的耐药性逐渐增高，当细胞耐受4mg/L表柔比星时，耐药株细胞对表柔比星的IC50为3.870mg/L，其耐药性是亲本细胞的17.834倍；当细胞耐受6mg/L表柔比星时，耐药株细胞对表柔比星的IC50为5.650mg/L，其耐药性是亲本细胞的26.270倍。

接下来，分别检测了亲本细胞和耐药细胞（耐6mg/L表柔比星）对紫杉醇、依托泊苷及顺铂的敏感性，如图16、17所示，不论是在48小时还是72小时，耐药细胞对这三种药物的IC50都明显高于亲本细胞，说明耐药细胞对紫杉醇、顺铂和顺铂也具有不同程度的交叉耐受性。计数各组别抑制率及药物IC50（如表2）：MTT法分别检测MDA-MB-231/EPI细胞对紫杉醇、依托泊苷和顺铂作用72h的半数抑制浓度，RI=IC50(MDA-MB-231/EPI)/IC50(MDA-MB-231)。与MDA-MB-231细胞比较，*P<0.05，** P<0.01。

表2 耐药MDA-MB-231/EPI细胞对几种化疗药物的耐药倍数

。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株，其保藏编号为：CCTCCC201439。

2.权利要求1所述的多药耐药性细胞株在耐表柔比星、紫杉醇、依托泊苷、顺铂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述多药耐药性细胞株耐表柔比星的指数为26.27倍、耐紫杉醇的指数为12.261倍、耐依托泊苷的指数为1.739倍、耐顺铂的指数为3.834倍。